Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Адаптогены растительного происхождения 10
1.2. Лекарственные препараты и биологически активные добавки к пище, применяемые для повышения адаптации организма 14
1.3. Роль биологически активных веществ в адаптогенной активности препаратов 23
1.4. Характеристика лекарственного и пищевого сырья композиции 30
1.4.1. Корневища и корни родиолы розовой (Rhizomata et radices Rhodiolae roseae) 30
1.4.2. Корневище с корнями рапонтикума сафлоровидного {Rhizomatacum radicibus Rhapontici carthamoides) 31
1.4.3. Плоды шиповника (Fructus Rozae) 32
1.4.4. Плоды боярышника (Fructus Crataegi) 33
1.4.5. Корневища и корни девясила (Rhizomata et radices Inulae) 34
1.4.6. Листья крапивы двудомной (Folia Urticae dioicae) 35
1.4.7. Корни ревеня (Radices Rhei) 35
1.4.8. Плоды кардамона настоящего (Fructus Elettariae cardamomi) 36
1.4.9. Корневища имбиря аптечного (Rhizomata Zingiberis) 37
1.4.10. Стандартизация лекарственного растительного сырья 38
Заключение 42
Экспериментальная часть 43
Материалы и методы исследования
Глава 2. Выбор оптимального варианта растительной композиции и ее товароведческий анализ 52
2.1. Обоснование состава растительной композиции 52
2.2. Выбор оптимального соотношения ингредиентов растительной композиции 54
2.3. Разработка технологической схемы получения чая «Арура-Тан №16» 55
2.4. Товароведческий анализ чая и растительного сырья, входящего в его состав 59
2.5. Изучение внешних признаков чая «Арура-Тан №16» 63
2.6. Микроскопический анализ 63
Выводы к главе 2 75
Глава 3. Фитохимическое изучение чая «Арура-Тан №16» 76
3.1. Обнаружение биологически активных веществ с помощью качественных реакций 76
3.2. Обнаружение веществ методом бумажной хроматографии (БХ) 78
3.3. Идентификация соединений методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) 80
3.4. Идентификация фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 83
3.5. Идентификация биологически активных веществ в чае (свободных и связанных аминокислот, сахаров, экдистерона, жирных кислот, эфирного масла) 86
3.6. Установление минерального состава чая 98
3.7. Количественное определение основных групп биологически активных веществ чая «Арура-Тан №16» 100
3.7.1. Определение суммы органических кислот 100
3.7.2. Определение содержания дубильных веществ 101
3.7.3. Определение содержания аскорбиновой кислоты 102
3.7.4. Определение содержания каротиноидов 103
3.7.5. Определение содержания экдистерона 103
Выводы к главе 3 105
Глава 4. Разработка способа получения экстракта жидкого «Фитотон» и его химический анализ 107
4.1. Подбор оптимальных условий экстрагирования 107
4.2. Технологический процесс получения экстракта жидкого на основе чая 112
4.3. Фитохимическое изучение экстракта жидкого «Фитотон» 115
4.3.1. Идентификация биологически активных веществ экстракта жидкого методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) 115
4.3.2. Идентификация фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 116
4.4. Изучение минерального состава экстракта жидкого 117
4.5. Количественное определение биологически активных веществ в экстракте жидком 118
4.5.1. Определение содержания аминокислот 118
4.5.2. Определение содержания дубильных веществ 119
4.5.3. Определение содержания суммы органических кислот 120
Выводы к главе 4 120
Глава 5. Разработка показателей качества для б ад к пище «Арура-Тан №16» и экстракта жидкого «Фитотон», и их стандартизация 122
5.1. Разработка методик количественного определения биологически активных веществ чая 122
5.1.1. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин 122
5.1.2. Разработка методики количественного определения суммы полисахаридов в пересчете на глюкозу 128
5.2. Установление показателей качества и срока годности чая 134
5.3. Разработка методик количественной стандартизации экстракта жидкого «Фитотон» по действующим веществам 138
5.3.1. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин 138
5.3.2. Разработка методики количественного определения суммы полисахаридов в пересчете на глюкозу 140
5.4. Установление показателей качества и срока годности экстракта жидкого 144
Выводы к главе 5 147
Общие выводы 148
Список литературы 149
Приложения 170
- Роль биологически активных веществ в адаптогенной активности препаратов
- Идентификация биологически активных веществ в чае (свободных и связанных аминокислот, сахаров, экдистерона, жирных кислот, эфирного масла)
- Подбор оптимальных условий экстрагирования
- Разработка методики количественного определения суммы полисахаридов в пересчете на глюкозу
Введение к работе
Актуальность темы. Характерной особенностью современной эпохи является многообразие неблагоприятных факторов, воздействующих на организм человека. К таким факторам риска можно отнести: неблагополучие экологии окружающей среды, использование рафинированной и высококалорийной пищи, малоподвижный образ жизни, эмоциональное перенапряжение, приводящие к стрессу, а также использование синтетических лекарственных препаратов, вызывающих множество побочных эффектов. Все это приводит к истощению адаптационных и компенсаторных механизмов, в результате чего повышается риск развития сердечно-сосудистых, эндокринных, онкологических, аллергических и других заболеваний. Для повышения общей резистентности организма как с лечебной, так и c профилактической целью необходимо достаточное поступление жизненно необходимых биологически активных веществ (БАВ). К сожалению, современное питание, особенно, для лиц с ослабленным здоровьем, пожилого возраста, а также в условиях повышенных умственных и физических нагрузок не может обеспечить организм всеми необходимыми веществами. В этой ситуации большое значение приобретают биологически активные добавки (БАД) к пище на основе лекарственных растений, содержащие не только витамины, аминокислоты и минералы, но и вторичные БАВ, такие как: полифенолы, полисахариды, эфирные масла и др., оказывающие регулирующее влияние на организм человека (Биологически активные добавки к пище, полная энциклопедия, 2001; Тутельян В.А. и др., 2004; Шантанова Л.Н. и др., 2010).
В настоящее время в реестре лекарственных препаратов, применяемых в практической медицине, доля средств растительного происхождения составляет около 30%, а в некоторых фармакотерапевтических группах их число достигает почти 70% (Гришина Е.И., Погодин И.С., Лукша Е.А., 2008). Повышенное внимание к средствам на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) связано с их меньшей токсичностью, физиологичностью и широтой терапевтического действия, возможностью более длительного применения, особенно, при лечении хронических заболеваний с минимальным риском проявления побочных эффектов. В этом плане весьма перспективными являются исследования по переводу чаев, сборов и отдельных растений, используемых в виде настоев и отваров, в суммарные препараты – экстракты, которые выгодно отличаются постоянством состава БАВ, рациональностью использования, а также возможностью их стандартизации (Кукес В.Г., Булаев В.М., Колхир В.К. и др., 2000; Николаев С.М., 2011).
Таким образом, разработка и создание многокомпонентных средств на основе лекарственных растений, повышающих адаптивные способности организма, является актуальной.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования является разработка и стандартизация биологически активной добавки к пище в виде чая и экстракта жидкого, обладающих адаптогенной активностью.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:
обосновать состав и соотношения ингредиентов в исходной растительной композиции для получения биологически активной добавки к пище чая «Арура-Тан №16» и экстракта жидкого, условно названного «Фитотон»;
провести фармакогностическое исследование чая: определить наличие биологически активных веществ, содержащихся в исходном сырье, в чае, а также установить основные анатомо-диагностические признаки чая и определить критерии подлинности и показатели его качества;
обосновать оптимальные параметры экстракции, разработать способ получения экстракта жидкого на основе чая и провести его химическое изучение;
разработать показатели качественной и количественной стандартизации чая «Арура-Тан №16», экстракта жидкого «Фитотон» по доминирующим биологически активным веществам;
разработать и представить проекты нормативной документации на указанные растительные средства, обладающие адаптогенной активностью: Технические условия (ТУ); Технологическую инструкцию (ТИ); рецептуру на биологически активную добавку к пище чай «Арура-Тан №16», проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на экстракт жидкий «Фитотон» для внедрения их в производство.
Научная новизна
Обоснован и разработан оптимальный вариант растительной композиции, включающий девять видов сырья, обладающих широким спектром действия и обеспечивающих суммарную адаптогенную активность.
В чае установлено содержание основных групп биологически активных веществ: флавоноидов, полисахаридов, экдистероидов, аскорбиновой кислоты, дубильных веществ, органических кислот, аминокислот, компонентов эфирного, жирного масел, макро- и микроэлементов; определены основные диагностические признаки чая, заключающиеся в особенностях строения клеток паренхимы, эпидермиса, их формы, наличие включений инулина, крахмала, кристаллов и друз оксалата кальция, жирного и эфирного масел, волосков различной формы, типа устьичного аппарата. На основании фармакогностического изучения чая «Арура-Тан №16» определены критерии его подлинности, показатели качества, количественные методики определения полисахаридов и флавоноидов, разработаны и предложены показатели качества полученного экстракта жидкого «Фитотон», необходимые для его стандартизации.
Обоснованы оптимальные параметры экстракции биологически активных веществ из растительной композиции, обеспечивающие максимальный выход экстрактивных веществ, флавоноидов, что положено в основу способа получения экстракта жидкого «Фитотон».
Рациональность состава чая «Арура-Тан №16», экстракта жидкого «Фитотон» и их эффективность подтверждены фармакологическими исследованиями.
Практическая значимость работы
По результатам исследований разработаны и внедрены:
биологически активная добавка к пище чай «Арура-Тан №16» (проекты ТУ 9361-016-03533369-12, ТИ, Рецептура);
«Лекарственное средство, обладающее адаптогенной активностью», заявка на изобретение № 2012149295/15(079058) (Уведомление о положительном результате формальной экспертизы от 25.12.2012 г. );
проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на экстракт жидкий «Фитотон»;
методики количественного определения флавоноидов и полисахаридов в БАД к пище чай «Арура-Тан №16» апробированы на ООО «Малое инновационное предприятие «Арура» (Акт о внедрении от 03.12.2012 г.).
полученные результаты используются в учебном процессе на кафедре фармации Бурятского государственного университета (Акт о внедрении от 15.11.2012 г.).
Работа выполнена в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по проекту № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», утвержденному президиумом СО РАН.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на:
- II международной научной конференции «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2011);
- II международной научно-практической конференции «Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития» (Москва, 2011);
- Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы экологии, безопасности жизнедеятельности и здоровья человека: теоретические, практические аспекты» (Соликамск, 2011);
- Международной научно-практической конференции «Современная наука: тенденции развития» (Краснодар, 2012);
- XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012).
Публикации
Основное содержание работы отражено в 9 научных работах, из них 3 статьи - в изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 169 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, четырех глав собственных исследований, выводов и списка используемой литературы, включающего 215 источников, из которых 36 - на иностранных языках, и содержит приложения. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 59 таблицами.
Роль биологически активных веществ в адаптогенной активности препаратов
В лекарственных и пищевых растениях, входящих в состав чая «Арура-Тан №16», присутствуют практически все классы БАВ - флавоноиды и другие полифенольные соединения, углеводы, сапонины, органические кислоты, эфирные масла, жирные кислоты, витамины, микроэлементы и другие вещества, требующие углубленного изучения, что позволит расширить возможности использования этих растений в медицинской практике.
Адаптогенная активность препаратов заключается в системном воздействии фармакологических эффектов на организм. Основными фармакологическими эффектами являются стрессрегулирующее действие, иммунорегулирующие свойства, дезинтоксикационные свойства, регуляция деятельности эндокринной системы. На уровне обмена веществ отмечают антикатаболическое и анаболическое, антиоксидантное действие адаптогенов, влияние на синтез и активность нуклеиновых кислот и функции генов, проявляющиеся в антимутагенном действии [177].
Модулирующим действием на гуморальный, клеточный и неспецифический иммунитет обладают многие лекарственные растения, что в основном объясняется содержанием в ЛРС этих растений фенольных соединений и полисахаридов.
Фенольные соединения являются природными нутриентами суточных рационов оздоровительного и лечебного питания, широко применяются для профилактики и лечения наиболее распространенных заболеваний, таких как болезни сердечно-сосудистой системы, сахарный диабет, онкологические заболевания и др. [16, 115].
Флавоноиды и другие полифенолы содержатся практически во всех растениях, и более 4000 из этих веществ идентифицированы [57, 211]. Флавоноиды обладают антиоксидантными, радиопротекторными свойствами, мембранностабилизирующей способностью и многообразием влияния на ферментные системы. Они влияют на азотистый обмен, обладают гепатопротекторным, капилляроукрепляющим, противовоспалительным, спазмолитическим, противоаллергическим, антимикробным, антисклеротическим и желчегонным действиями [12, 16, 57, 186, 210]. Эти биологически активные вещества (БАВ) положительно действуют на пищеварительную систему, печень, почки, кроветворение. В медицине флавоноидные соединения используются как Р-витаминные («Рутин», «Кверцитин», «Аскорутин», «Витамин Р из листьев чая» и др.), противоязвенные («Ликвиритон», «Флакарбин» и др.), гипоазотемические («Фларонин», «Леспенефрил», «Леспефлан»), желчегонные («Холосас», «Фламин», «Экстракт шиповника» и др.) средства. Фенольные соединения широко используются для профилактики онкологических заболеваний и болезней сердечно-сосудистой системы [196, 210].
Фенолкарбоновые кислоты и флаволигнаны также обладают антиоксидантным, мембранопротективным, иммуномодулирующим действием. Они повышают иммунитет, влияют на функциональную активность печеночных клеток, стимулируют выработку ферментов, влияя этим на липидный, жировой обмен, повышение антитоксической функции печени [26, 79, 181, 196] .
Фенологликозиды родиолы розовой снимают умственную и физическую усталость [146].
Органические кислоты активно участвуют в обмене веществ, активизируют деятельность слюнных желез, выделение желчи, обладают бактерицидным действием, возбуждают секрецию (выделительную деятельность) поджелудочной железы и стимулируют деятельность кишечника, усиливая его перистальтику [16].
Производные янтарной и фумаровой кислот являются адаптогенами, специфическими антидотами против ацетальдегида, митохондриальными антиоксидантами, детоксикантами, противоишемическими и противогипоксическими агентами, антимутагенами и эффективными энергизаторами; обеспечивают устойчивость мембран, стабилизируют систему кровообращения, обеспечивая мощный, растянутый во времени антигипоксический эффект.
Дубильные вещества в виде настоев, отваров, настоек, экстрактов используют как вяжущие, бактерицидные средства при желудочно-кишечных заболеваниях, для полоскания горла. Их противовоспалительные свойства обусловлены тем, что, проникая в межклеточное пространство, они связывают белки ферментов, которые вызывают развитие воспалительной реакции. При наружном применении танины также связываются с белками и образуют защитную пленку, оказывая бактерицидное и обезболивающее действие [16, 138]. Дубильные вещества также обладают противогрибковыми свойствами, оказывают местное кровоостанавливающее действие, принимают активное участие в окислительно-восстановительных процессах и в обмене веществ. Установлено, что дубильные вещества обладают противоопухолевым действием, они гасят развитие свободнорадикальных реакций, и эффективны при химиотерапевтическом лечении опухолей [16, 116].
Полисахариды природного происхождения обладают многообразным фармакологическим действием: противовирусным, противоопухолевым, противовоспалительным, гастропротективным, антигипоксическим, детоксицирующим и мембранотропным; повышают устойчивость организма к инфекциям, способствуют заживлению ран и регенерации тканей, благоприятно влияют на течение и исход воспалительных процессов, устраняют болевой синдром, снижают побочное действие лекарственных препаратов и рентгенотерапии [69, 116].
Литературные данные свидетельствует о наличии иммуномодулирующего действия полисахаридов растительного происхождения, причем в комплексе с флавоноидами, их активность возрастает [10, 62]. Установлено, что полисахариды элеутерококка являются стимуляторами индукции интерферона [60, 158, 212].
Хлорофилл, выделенный из листьев крапивы, обладает стимулирующим и тонизирующим действием, усиливает обмен веществ в организме, повышает тонус сердечно-сосудистой системы, дыхательного центра, кишечника, матки, способствует грануляции и эпителизации пораженных тканей. В народной медицине листья крапивы двудомной применяются при СД, а также как кровоостанавливающее, мочегонное, противолихорадочное, ранозаживляющее средство [103, 140]. Сапонины обладают противовоспалительным, отхаркивающим, мочегонным, слабительным действием. Кроме того, отдельные сапонины обладают общеукрепляющим, антисклеротическим, гипотензивным, антиоксидантным, противораковым, тонизирующим, антиаллергическим, регулирующим водно-солевой обмен, седативным действием. Ряд стероидных сапонинов служит источником для синтеза гормональных препаратов, широко применяемых при нарушении холестеринового обмена [16, 116, 193]. Сапонины женьшеня, аралии, элеутерококка и других растений семейства аралиевых обладают адаптогенным действием, повышают работоспособность, улучшают показатели клеточного и гуморального иммунитета [71].
Эфирные масла оказывают антимикробное, противогрибковое, противовирусное, ранозаживляющее, отхаркивающее, стимулирующее, антиоксидантное, спазмолитическое, диуретическое действие. Кроме того, эфирные масла понижают артериальное давление, ослабляют кашель, улучшают функцию желудочно-кишечного тракта, оказывают положительное влияние на сердечно-сосудистую и центральную нервную системы. Выявлены иммунотропные свойства ряда эфирных масел, однако степень их воздействия на иммунную систему в целом и на ее отдельные звенья различна. Преимущественно стимулирующее действие на В-систему иммунитета оказывают эфирные масла пихты, аниса, лавра; на Т-систему - эфирные масла эвкалипта, монарды, базилика, гвоздики, жасмина, шалфея мускатного [16, 116, 139].
К липидам относятся насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, их производные, триглицериды, фосфолипиды, липопротеиды, гликолипиды, стероиды. Жирные кислоты входят в состав клеточных мембран, влияют на обмен других липидов. Линоленовая и линолевая кислоты являются незаменимыми пищевыми веществами в процессах обмена веществ, особенно холестерина, так как проявляют гипохолестеринемическую активность, препятствуя его отложению на стенках кровеносных сосудов, повышая эффективность липотропного действия холина. Также жирные кислоты участвуют в обмене некоторых витаминов (тиамина и пиридоксина), обладают иммуномодулирующим действием, повышают устойчивость организма к инфекционным заболеваниям и действию неблагоприятных факторов внешней среды [16, 115, 116]. В ряде экспериментальных работ установлена способность полиненасыщенных жирных кислот омега-3 типа ингибировать канцерогенез [14].
Идентификация биологически активных веществ в чае (свободных и связанных аминокислот, сахаров, экдистерона, жирных кислот, эфирного масла)
Лекарственные растения являются источниками БАВ, среди которых значительное место принадлежит аминокислотам [133]. Свободные аминокислоты выполняют в живом организме ряд специфических задач, участвуя в процессах связывания, транспорта и выведения из организма биологически активных форм азота, способствуя поддержанию азотистого баланса, обладая иммуноактивными свойствами и оказывая гиполипидемическое действие. Они оказывают положительное влияние на сердечно-сосудистую систему, участвуют в процессах нервной регуляции различных функций организма, а также влияют на сосудистый тонус. Также аминокислоты являются основным строительным материалом для синтеза специфических тканевых белков, ферментов, гормонов и других физиологически активных соединений [86]. Аминокислоты придают другим БАВ легко усваиваемую и безвредную форму, одновременно потенцируя их фармакологический эффект [110].
Определение аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (Чехия). Содержание аминокислот определяли в нмоль/г, затем производили перерасчет в мг/г к абсолютно сухому сырью.
Методика. Для определения свободных аминокислот брали навеску образца 1,000 г (точная навеска). Извлечение проводилось водой очищенной при температуре 100С.
Подготовка образца для исследования свободных аминокислот включала: исчерпывающую экстракцию горячей водой, обработку хлороформом (для удаления липидов и гидрофобных пигментов), осаждение полисахаридов двойным количеством 96% спирта этилового, удаление осадка центрифугированием и концентрирование водного извлечения в вакууме. Сухие остатки (точные навески) растворяли в цитрат-литиевом буфере (рН 2,2) в объеме, определяемом в зависимости от концентрации аминокислот. Связанные аминокислоты определяли после гидролиза 6 н хлористоводородной кислотой при температуре 110С в течение 24 часов в ампуле. После ампулу вскрывали, соляную кислоту упаривали на роторном испарителе, остаток растворяли в натрий-цитратном буферном растворе (рН 2,2). Результаты исследований представлены в таблице 3.5.11.
Обнаружены 21 свободная и 19 связанных аминокислот, из них - 7 незаменимых: валин, изолейцин, метионин, лизин, лейцин, треонин, фенилаланин. Суммарное содержание свободных аминокислот в чае составляет 12,54 мг/г. В наибольшем количестве присутствуют аргинин - 30,78 % от общего количества аминокислот, пролин - 20,44 % , глутаминовая кислота -17,85 %, глутамин - 4,18 % и аланин - 3,25 %.
Идентификация свободных Сахаров
Полисахариды и свободные сахара, содержащиеся в ЛРС, проявляют широкий спектр фармакологической активности: антигипоксические, противовоспалительные, иммунотропные, противомикробные, противовирусные, противоопухолевые, антиатеросклеротические, антидотные и другие свойства [73, 166]. Проведено исследование состава Сахаров в чае после гидролиза полисахаридов методом ВЭЖХ.
Методика. Около 3,0 г (точная навеска) чая, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 200 мл, прибавляют 50 мл воды очищенной и нагревают на плитке с обратным холодильником в течение 60 мин. Полученное извлечение охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объём содержимого колбы до метки водой и перемешивают.
Результаты исследований приведены на рисунке 3.5.15 и в табл. 3.5.12. Методом ВЭЖХ в водном извлечении из чая обнаружены сахара, среди которых превалирует мальтоза.
Идентификация экдистерона в чае
Экдизоны представляют собой вещества гормонального характера, обладают высокой биологической активностью. Установлено, что экдизоны рапонтикума сафлоровидного проявляют психостимулирующее и адаптогенное, тонизирующее и анаболическое действия [29, 118, 143], как и гликозиды женьшеня, элеутерококка, родиолы розовой и лигнаны лимонника, оказывают иммуностимулирующее действие, поэтому их следует рассматривать как основные действующие вещества этого растения [115].
Также имеются данные по ингибированию экдизоном роста клеток саркомы и других видов раковых опухолей [114]. Показана перспектива их использования в составе лекарственных препаратов кардиотропного, антиатеросклеротического, ранозаживляющего [206] и антимикробного действия [160]. Основным экдистероидом в корневищах и корнях рапонтикума сафлоровидного является 20-гидроксиэкдизон (экдистерон) [146, 189].
Методика. Около 3,0 г чая помещают в колбу вместимостью 150 мл, прибавляют 20 мл 70 % спирта этилового и нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу объёмом 25 мл и доводят 70 % спиртом этиловым до метки (исследуемый раствор).
Хроматограмма ВЭЖХ РСО экдистерона и извлечения из чая представлены на рисунках 3.5.16. и 3.5.17., соответственно. Экдистен в испытуемом растворе идентифицирован по времени удерживания и сравнении с таковым раствора РСО.
В состав чая «Арура-Тан №16» входят растения, содержащие эфирные масла: корневища имбиря, плоды кардамона, корневища и корни девясила, корневища и корни родиолы и корневище с корнями рапонтикума. По данным литературы содержание эфирного масла в плодах кардамона составляет около 3-8 %; в корневищах имбиря - 1-3,5 %; корневищах и корнях девясила - 1-3 %; в корневищах и корнях родиолы - 0,8-0,9 %; в коневище с корнями рапонтикума - 0,9 % [7, 11, 31, 32, 53, 99, 117, 150, 204]. Известно, что компоненты эфирных масел обладают широким спектром терапевтических свойств. Для них характерно стимулирующее влияние на иммунную, нервную системы, спазмолитическое, антисептическое, противогрибковое, противовирусное, ранозаживляющее, отхаркивающее, стимулирующее, антиоксидантное, спазмолитическое действие [16, 109, 116, 139, 142]. Количественное определение эфирного масла проводили из навески в 30,0 г, согласно ГФ XI изд., вып. 1, с. 290, метод 1.
В связи с тем, что в состав чая входят растения, содержащие эфирные масла, нами проведен анализ его компонентов (имбиря, кардамона, девясила, рапонтикума и родиолы), для выявления химических соединений, характерных для каждого вида сырья (веществ-маркеров). Обнаружение веществ-маркеров позволяет подтвердить присутствие конкретного вида ЛРС в составе многокомпонентных средств [120].
Количество эфирного масла в корневищах имбиря составило 1,75 %, обнаружено 122 соединения, из них идентифицировано 93, наибольшее количество составили а-зингиберен - 23,252 %, Е-, Р-сесквифелландрен -12,286 %, циклогексен - 9,345 %, аг-куркумен - 8,037%, производное нафталена (Сі5Н24) - 4,302 %, производное нафталена (CisH26) - 2,606 %, а-эвдесмол -2,408%, Е-неролидол - 2,306 %, 3,3-диметил-6-октен-1-ин-3-ол - 2,084 %, 0-эвдесмол - 1,784 %, гелифолен - 1,387 %.
Выход эфирного масла из плодов кардамона составил 7,0 %, обнаружено 40 компонентов. Методом хромато-масс-спектрометрии идентифицировано 34 компонента, составляющих 98 % от суммы цельного эфирного масла. Обнаружено наибольшее содержание в % от массы эфирного масла 1,8-цинеола - 38,80 %, а-терпинилацетата - 28,05 %, а также а-пинен - 2,68 %, сабинен -5,24 %, Р-мирцен - 3,19 %, терпинолен - 2,11 %, линалоол - 7,20 %, пара-цимен-8-ол - 5,76 %. Среди неидентифицированных компонентов имеется 6 веществ, содержание которых в смеси составляет около 2%.
Количество эфирного масла в корневищах и корнях девясила высокого составило 1,50 %, найдено 26 соединений, из которых идентифицировано 20. В эфирном масле девясила содержится большое количество алантолактона (эвдесма-5,11,13)-,диен,-8,12-олид - 54,55 % , нафто-(2,3)Р-фуран-2(ЗН)-1-декагидро-8а-метил-3,5-бис-метилена - 36,56 %, гераниола - 1,01 %, количество остальных соединений составило менее 1 %.
Подбор оптимальных условий экстрагирования
Для более эффективного процесса экстрагирования БАВ изучены технологические свойства чая: насыпная плотность (масса), анализ фракционного состава и коэффициент поглощения экстрагента ЛРС.
Насыпная плотность служит мерой объема, занимаемого единицей массы измельченного сырья, используется для выбора размера экстрактора.
Методика. В мерный цилиндр 100 см (предварительно взвешенный) насыпали растительный материал со стандартным уплотнением (с легким постукиванием по стенке) до метки цилиндра, затем взвешивали с точностью до 0,01 г.
Анализ фракционного состава чая
При экстрагировании растительного материала большое значение имеет характер и крупность измельчения ЛРС. Измельчение позволяет увеличить межфазную поверхность растительного материала при экстрагировании [101]. Для оценки однородности сырья определяли его фракционный состав с помощью комплекта фармакопейных сит.
Методика. Для анализа брали 100,0 г чая и просеивали через набор сит: № 50, 30, 20, 10, 2,5 (размер отверстий соотвественно 5, 3, 2 и 1мм). Закрывали комплект сит крышкой и донышком, и встряхивали в течение 5 минут, затем по очереди освобождали сита, и каждое встряхивали над листом гладкой бумаги в течение 1 минуты, добавляя отсев на следующее сито. Остаток материала на каждом сите взвешивали с точностью до 0,01 г и выражали массу в % к навеске. Полученные данные представлены в таблице 4.1.22.
Коэффициент поглощения сырья - объем экстрагента, поглощенного единицей массы сырья при его набухании.
Методика. Для определения коэффициента поглощения сырья 10,0 г заливали 100 мл экстрагента и оставляли на 3 часа. Затем сливали свободный экстрагент и взвешивали увлажненный растительный материал.
Согласно литературным данным при производстве фитопрепаратов основными управляемыми факторами, влияющими на полноту и скорость экстракции, являются: тип экстрагента, его соотношение с сырьем, степень измельчения сырья, температура, продолжительность и кратность экстракции [94, 101]. Нами изучено влияние этих факторов на выход БАВ, содержание которых определяли по выходу экстрактивных веществ, а также по разработанной ранее методике количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин.
В состав чая, как было сказано выше, входят следующие компоненты: плоды шиповника, плоды боярышника, корневища и корни девясила, корневища и корни родиолы, корневища с корнями рапонтикума, листья крапивы, корни ревеня, плоды кардамона и корневища и корни имбиря, взятые в соотношении 2,0 : 2,0 : 1,5 : 1,0 : 1,0 : 1,0 : 0,5 : 0,5 : 0,5.
Размер частиц ЛРС играет важную роль в интенсификации процесса экстракции. В чай входит ЛРС различных морфологических групп. Наиболее оптимальным вариантом является размер частиц для плодов - 1 мм, семян - 0,5 мм, корней - 3 мм, листьев, цветков и травы - от 3 до 5 мм [40]. Для более эффективного протекания процесса экстракции было изучено влияние степени измельчения веществ.
Для подбора концентрации экстрагента изучены процессы экстрагирования чая. Нами изучены выход суммы экстрактивных веществ при использовании 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 и 96% этилового спирта. Эффективность экстрагирования оценивали по выходу экстрактивных веществ и по сумме флавоноидов в пересчете на рутин. Результаты исследований приведены в таблице 4.1.25.
Определение выхода экстрактивных веществ во всех указанных экспериментах проводили по однотипной методике, приведенной в ГФ XI изд., вып.1, с. 295. Определение суммы флавоноидов проводили по разработанной методике приведенной выше.
Установлено, что спирт этиловый в диапазоне 50-70 % извлекает больше флавоноидов, но меньше экстрактивных веществ, при визуальном осмотре цвет данных извлечений менее насыщенный, этот факт говорит о том, что экстрагент с высокой концентрацией извлекает узкий спектр действующих веществ, поэтому его использование не целесообразно. Выбор спирта этилового в концентрации менее 30 % также не целесообразен, поскольку происходит извлечение большого количества балластных веществ, которые адсорбируют многие действующие вещества и осаждают их, а также в последующем затрудняют процесс фильтрации, к тому же указанные экстрагенты являются благоприятной средой для развития микроорганизмов.
Наиболее оптимальным экстрагентом является 40 % спирт этиловый, так как он извлекает достаточное количество экстрактивных веществ (при этом извлечение имеет насыщенную темно-коричневую окраску).
Для установления наиболее эффективного метода экстрагирования растительного сырья изучено влияние способов экстракции на выход суммы флавоноидов и экстрактивных веществ, для этого были выбраны три метода получения экстракта жидкого: дробная мацерация, перколяция и реперколяция. Установлено, что увеличение числа диффузоров повышает эффективность процесса экстракции и позволяет повысить качество готового продукта [94, 101]. Поэтому была выбрана система из пяти диффузоров.
Экстракция указанными способами проводилась при следующих условиях: масса сырья - 100,0 г, соотношение сырья и экстрагента - 1:1, экстрагент - 40 % спирт этиловый (объем экстрагента взят с учетом коэффициента поглощения сырья), время экстракции при дробной мацерации и перколяции составляло 2 суток, реперколяции в батарее из пяти диффузоров - 8 суток.
Результаты исследований приведены в таблице 4.1.26.
В результате исследования установлено, что наибольший выход действующих веществ наблюдается при использовании метода реперколяции. Также провели анализ шрота, оставшегося после получения экстрактов, результаты исследования показали, что наиболее истощенный шрот получается после экстракции способом реперколяции. Кроме того, данный метод дает возможность получить концентрированную вытяжку без последующего упаривания, что позволяет нам сохранить эфирные масла чая.
Таким образом, проведенные исследования по выбору наиболее эффективного метода экстракции сырья показали, что оптимальным методом для получения экстракта жидкого на основе чая «Арура-Тан №16» является метод реперколяции по Чулкову.
Разработка методики количественного определения суммы полисахаридов в пересчете на глюкозу
С целью количественной оценки Сахаров в чае была использована методика спектрофотометрического определения, основанная на реакции с пикриновой кислотой в щелочной среде, после кислотного гидролиза и использования в качестве стандартного образца глюкозы. В основе метода лежит цветная реакция моносахаров с пикриновой кислотой с образованием аминопикриновой кислоты в результате восстановления сахаром группы NO2 в NH2.
Для определения влияния типа экстрагента на выход полисахаридов (ПС) из чая использовали гравиметрический метод определения полисахаридов из ГФ XI изд.
Для очистки извлечения от сопутствующих БАВ (флавоноидов и сапонинов), применяли метод последовательной экстракции спиртом этиловым и водой.
Методика. Около 1,0 г чая помещают в кругло донную колбу, прибавляют 50 мл 60 % спирта этилового, нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 40 минут, проводят данную операцию дважды, затем экстракцию продолжают с 50 мл воды очищенной. В результате получают три извлечения, которые фильтруют, концентрируют, остаток растворяют в 95% спирте этиловом и анализируют методом ТСХ на присутствие в них флавоноидов и сапонинов.
Для проверки эффективности очистки извлечения от флавоноидов, хроматографировали три полученных извлечения на пластинках «Sorbfil» (ПТСХ-П-А-УФ-254) в системе растворителей 1. После обработки хроматограммы 5 % спиртовым раствором алюминия хлорида установлено, что в водном извлечении флавоноиды отсутствуют. Для обнаружения Сахаров хроматографирование проводили в системе растворителей 3. В качестве детектирующего реагента используют 20 % раствор кислоты серной. На хроматограмме наблюдалось уменьшение интенсивности окраски пятен во втором образце по сравнению с первым и отсутствие пятен в третье образце, что свидетельствует об эффективности данного метода очистки для Сахаров.
Для методики количественного определения суммы полисахаридов рекомендуем использовать трехкратную экстракцию: первую и вторую 60 % спиртом этиловым для очистки от сопутствующих соединений и третью водой очищенной для количественного определения полисахаридов.
Для устранения ошибки результатов единичного определения, принято измельчить аналитическую пробу сырья до размеров частиц 1 мм, так как чай многокомпонентный и сырье является неоднородным.
Подобрано оптимальное соотношение сырье-экстрагент, для анализа использовали гравиметрический метод определения полисахаридов по ГФ XI изд., вып. 2, ст. 20. Результаты представлены в таблице 5.2.44.
Исследования показали, что при использовании метода двукратной экстракции I фаза-30 минут, II фаза-15 минут извлечение ПС из чая происходит полностью.
Для методики количественного определения полисахаридов в чае в качестве стандартного образца использовали РСО глюкозы.
Спектры поглощения полученных восстанавливающих моносахаров с кислотой пикриновой в щелочной среде имеют максимум поглощения при 466±2 нм (Рис. 5.2.22.).
Полученные в ходе экспериментов оптимальные параметры легли в основу методики количественного определения суммы полисахаридов в чае.
Методика. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 40 мл 60 % спирта этилового, 0,3 г кальция карбоната и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 15 минут. Горячее извлечение сливают через бумажный фильтр, следя за тем, чтобы частицы сырья оставались в колбе. Колбу с сырьем промывают дважды, используя по 10 мл 60 % спирта этилового, извлечения сливают. Операцию экстрагирования повторяют с 30 мл 60 % спирта этилового, оставшиеся на фильтре частицы сырья аккуратно смывают экстрагентом обратно в колбу, время нагревания 15 минут, извлечение сливают, сырье в колбе снова промывают дважды, используя по 10 мл того же экстрагента. Далее в колбу с сырьем приливают 50 мл воды и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут, охлаждают при комнатной температуре. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, следя за тем, чтобы частицы сырья не попали на фильтр. Колбу с сырьем промывают 10 мл воды, извлечение фильтруют в ту же колбу. Экстракцию повторяют с 30 мл воды, время нагревания 15 минут. Переносят сырье на фильтр, промывают коническую колбу используя 10 мл воды. Доводят объем раствора до метки, перемешивают (раствор А).
20 мл раствора А помещают в круглодонную колбу, прибавляют 5 мл кислоты хлористоводородной и кипятят на плитке в течение 10 минут, используя обратный холодильник. К полученному извлечению прибавляют 40% раствор натрия гидроксида до получения раствора с рН 4,0-4,5. Раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора в колбе водой до метки, перемешивают. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывают первые 10-15 мл фильтрата (раствор Б).
В три конические колбы вместимостью 50 мл помещают по 2,5 мл 1% раствора кислоты пикриновой, затем по 7,5 мл 20 % раствора натрия карбоната. В первую колбу прибавляют 5 мл раствора Б (анализируемый раствор), во вторую - 5 мл воды (раствор сравнения), в третью - 5 мл раствора рабочего стандартного образца (РСО) глюкозы. Колбы с содержимым погружают на 10 минут в кипящую водяную баню, затем охлаждают до комнатной температуры.
Содержимое количественно переносят в мерные колбы вместимостью 25 мл, доводят объем растворов до меток водой и перемешивают.
Установлено, что содержание полисахаридов в чае находится в пределах от 14,68 до 18,26%.
Валидация методики:
Методика специфична, так как максимумы поглощения испытуемого раствора и РСО глюкозы при 466±2 нм совпадают, на спектре раствора сравнения (плацебо) максимума отсутствует.
Методика прецизионна и характеризуется сходимостью (повторяемостью), т.е. проведение анализа в одинаковых условиях обеспечивает получение сравнимых результатов. Результаты определения показателя на разных приборах в разные дни показало, что методика отвечает требованиям промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности (табл. 5.2.47.)
Ошибка единичного определения с 95% вероятностью не превышает 4,14%.
Таким образом, разработана методика количественного определения суммы полисахаридов в пересчете на глюкозу в чае. Содержание суммы полисахаридов в опытных сериях чая составило от 14,68 до 18,26%. Норму по этому показателю предлагается установить, не менее 14%.
