Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современное состояние фармакогностического, фитохимического и фармакологического изучения шалфея лекарственного, ройлеаноны. Тритерпеноиды 12
1.1. Ботаническая характеристика .12
1.2. Местообитание .13
1.3. Химический состав шалфея лекарственного 13
1.3.1. Надземная часть 13
1.3.2. Корни 14
1.4. Ройлеаноны 15
1.4.1. Распространение в растительном мире 15
1.4.2. Биогенез 15
1.4.3. Методы выделения из растительного сырья 22
1.4.4. Химические свойства ройлеанонов 23
1.4.5. Установление структуры ройлеанонов 26
1.4.6. Биологическая активность ройлеанонов .33
1.5. Тритерпеноиды олеанолового и урсанового ряда 35
1.5.1. Методы установления строения тритерпеноидов .36
1.5.2. Биологическая активность тритерпеноидов..40
Часть II. Экспериментальная часть
Глава II. Объекты, материалы и методы исследования .43
Глава III. Изучение морфолого-анатомических характеристик и химического состава корней шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.) 46
3.1. Ройлеаноны .46
3.1.1. Изучение морфолого-анатомического строения корней шалфея лекарственного 46
3.1.2. Микроскопический анализ сырья 46
3.1.3. Экстракция сырья. Выделение ройлеанонов методом колоночной хроматографии 49
3.1.4. Идентификация ройлеанонов. Сопоставление антимикробной активности выделенных ройлеанонов 50
3.1.5.Масс-спектрометрическоеизучение ройлеанонов 55
3.2. Пентациклические тритерпеноиды.. 58
3.2.1. Выделение тритерпеноидов методом колоночной хроматографии 59
3.2.2. Идентифтикация пентациклических тритерпеноидов. Установление строения нового вещества 60
3.2.3. Биологическая активность пентациклических тритерпеноидов .68
Выводы к Главе III 71
Глава IV. Технология получения субстанции антимикробного действия ройлевин .72
Выводы к Главе IV 93
Глава V. Разработка показателей качества субстанции ройлевин 94
5.1. Разработка методов установления подлинночти 94
5.2. Разработка методик количественного определения 7 гидроксиройлеанона (горминона) в Ройлевине для постадийного контроля при получении субстанции 96
5.2.1. Разработка методики количесвтенного определения 7-гидроксиройлеанона (горминона) в Ройлевине .96
5.2.1.1. Разработка метода получения горминона СО и оценка его качества 97
5.2.1.2. Методика количественного определения горминона в Ройлевине 99
5.2.2. Разработка методик количественного определения 7-гидроксиройлеанона (горминона) в постадийном контроле при получении Ройлевина .107
5.2.2.1. Разработка методик определения горминона в сырье и шроте .109
5.2.2.2. Разработка методики анализа 1го и 2го спиртового экстракта сырья 111
5.2.2.3. Разработка методики анализа хлороформного извлечения из сырья 112
Выводы к Главе V 113
Обсуждение результатов 114
Общие выводы 117
Список сокращений 118
Список литературы 119
Приложения 136
- Установление структуры ройлеанонов
- Идентифтикация пентациклических тритерпеноидов. Установление строения нового вещества
- Технология получения субстанции антимикробного действия ройлевин
- Методика количественного определения горминона в Ройлевине
Введение к работе
Актуальность темы исследования Препараты антибактериального действия в настоящее время занимают большой удельный вес среди всех медикаментозных средств и потребность в них не только не уменьшается, а с течением времени растет. Инфекционные болезни на протяжении всей истории были огромной проблемой для человечества. После того, как было установлено, что инфекции вызываются болезнетворными микроорганизмами, вектор борьбы с такими болезнями переместился в направлении создания антибактериальных средств. Однако, в течение почти 100 последних лет эффективных в этом направлении средств практически не было. Положение изменилось в 30-х годах прошлого столетия с созданием сульфаниламидов, а десятилетие спустя – антибиотиков. Была получена возможность направленного и эффективного лечения. Однако, антибиотики, принеся избавление от одних проблем, вызвали новые. Одна из них – самая труднопреодолимая и глобально масштабная – антибиотикорезистентность. В настоящее время существует уже несколько поколений антибиотиков, и к большинству из них появляются новые резистентные штаммы микроорганизмов. Меры преодоления, предлагаемые в нашей стране и за рубежом – комбинации антибиотиков, замена на отдельных этапах лечения одних антибиотиков другими, ограничение применения антибиотиков в тех случаях, когда без них можно обойтись. Другой путь решения проблемы – обращение к препаратам растительного происхождения. Антимикробные препараты из лекарственного растительного сырья (ЛРС), такие как Эвкалимин (из листьев эвкалипта), Сангвиритрин (из травы маклеи), разработанные в ВИЛАР как аналоги антибиотиков, имеют широкий спектр действия, практически не имеют побочных эффектов и, что самое главное, к ним не вырабатывается устойчивость микроорганизмов. Одним из перспективных растений для создания препарата антимикробного действия является шалфей лекарственный.
Шалфей лекарственный (Salvia officinalis L.) является официнальным растением и часто применяется в медицинской практике разных стран мира. Он включен в фармакопеи Англии, США, Германии, Франции, Польши, Австрии и Китая. Экстракты шалфея обладают противовоспалительным, антимикробным, желчегонным, тонизирующим и целым рядом других действий. Традиционно считалось, что биологическая активность растения связана с наличием эфирного масла. В последнее время интерес для исследователей представляют нелетучие компоненты. Одной из основных групп действующих веществ являются дитерпеноиды абиетанового ряда с ароматическим кольцом С, содержащиеся в траве шалфея (корназоловая кислота и ее производные), проявляющие сильное антимикробное действие. В корнях также найдены абиетановые дитерпеноиды, где кольцо С имеет строение хинона: ройлеанон, 7-гидроксиройлеанон (горминон) и 7-ацетоксиройлеанон. Эти соединения обладают высокой
антимикробной активностью. В настоящее время создание субстанции антимикробного действия из корней шалфея лекарственного является актуальным.
Потребность в препарате антимикробного действия растительного происхождения сохраняется.
Возможно комплексное использование растения без дополнительных экономических затрат, т.к. корни шалфея лекарственного являются отходами после использования растений для заготовки листьев в течение нескольких вегетационных периодов.
Помимо антимикробной активности в последнее время у ройлеанонов обнаружено цитотоксическое действие на клетки опухоли кишечника и печени (Мастеров с соавт., 2004 г.).
Степень разработки темы исследования В лаборатории антимикробных исследований ВИЛР (Вичканова С.А. с сотр., 1969 г.) впервые показано наличие у ройлеанонов антимикробного действия и на основе этих данных (Романова А.С. с соавт.) была разработана субстанция под рабочим названием «Донелвин» как полуфабрикат для получения лекарственных форм. Действующими веществами субстанции являлась сумма горминона и 7-ацетоксигорминона. Балластными веществами были неполярные компоненты липофильного характера, стерины, линейные углеводороды типа козана. Состав субстанции отличался нестабильностью: доля горминона и 7-ацетоксигорминона колеблется от 20 до 80 % в зависимости от сырья. Другими недостатками технологии являются необходимость нагрева пожароопасных растворителей (петройленый эфир), а также трудновоспроизводимый и длительный процесс кристаллизации целевого продукта с возможностью образования смолистой субстанции, поэтому работа были приостановлена, а субстанция не зарегистрирована.
В связи с вышеизложенным разработка субстанции антимикробного действия из корней шалфея лекарственного по новой технологии является актуальной.
Цель исследования – разработать способ получения субстанции антимикробного действия на основе углубленного изучения химического состава корней шалфея лекарственного и метод стандартизации субстанции.
Задачи:
-
Изучить морфолого-анатомическое строение корней шалфея лекарственного, установить локализацию ройлеанонов в корнях, диагностические признаки сырья.
-
Определить количественное содержание и химический состав ройлеанонов в корнях шалфея лекарственного, включая минорные компоненты.
-
Разработать новый способ получения субстанции антимикробного действия, основанный на преобразовании суммы ройлеанонов в наиболее активный горминон.
-
Изучить химический состав веществ, сопутствующих горминону в субстанции антимикробного действия.
5. Установить числовые значения параметров контроля подлинности и качества субстанции антимикробного действия, оформить нормативную и технологическую документацию на субстанцию антимикробного действия и на стандартный образец горминона для количественного определения (проект НД, методики количественного определения, лабораторный регламент).
Научная новизна
Впервые выделены биологически активные вещества: 7-оксоройлеанон, таксохинон и 6,7-дегидроройлеанон в дополнение к ранее известным горминону, 7-ацетоксигорминону и ройлеанону в ходе углубленного изучения содержания ройлеанонов в корнях шалфея лекарственного.
Установлена связь строения молекул и биологической активности ройлеанонов, содержащихся в корнях шалфея. Наиболее активный горминон предложен в качестве основы для субстанции антимикробного действия.
Изучена стабильность горминона в щелочной среде и реакция гидролиза ацетоксигорминона как обоснование нового способа получения субстанции антимикробного действия из корней шалфея лекарственного.
Оптимизированы параметры экстракции сырья на головной стадии и на стадии жидкофазных экстракций в ходе технологического процесса.
Впервые выделены из корней шалфея лекарственного пентациклические тритерпены: эускафиковая, 19-дезоксиэускафиковая кислоты и новое соединение 2, 21, 22-тригидроксиолеаноловая кислота и установлено ее строение.
Отмечено наличие антимикробной активности у выделенных тритерпеновых кислот.
Впервые в ходе изучения ройлеанонов с помощью масс-спектрометрии установлена закономерность распада молекулы ройлеанона под действием электронного спрея ESI.
Теоретическая и практическая значимость исследования Результаты работы:
Разработан лабораторный регламент на производство субстанции антимикробного действия из корней шалфея лекарственного «Ройлевин» ЛР 04868244-01-2016.
Разработаны технические условия на стандартный образец 7-гидроксиройлеанона (горминона) ТУ 9369-188-04868244-2015.
Разработан проект нормативного документа (проект НД) на субстанцию антимикробного действия Ройлевин.
Разработаны методики количественного определения 7-гидроксиройлеанона при получении субстанции Ройлевин из корней шалфея лекарственного №М-04868244-52-2016.
На основе полученной субстанции антимикробного действия разработана фармацевтическая композиция антимикробного действия. Получен Патент №2596500 от 10 августа 2016 года.
Основные положения, выносимые на защиту
Результаты морфолого-анатомического исследования сырья, изучения компонентного состава ройлеанонов в корнях шалфея лекарственного и сравнительной оценки их антимикробной активности.
Технологическая схема получения субстанции антимикробного действия Ройлевин из корней шалфея лекарственного на основе наиболее активного ройлеанона – горминона ЛР 04868244-01-2016.
Результаты исследования химического состава пентациклических тритерпенов, сопутствующих горминону в субстанции антимикробного действия Ройлевин.
Результаты определения параметров стандартизации субстанции антимикробного действия Ройлевин (проект НД), промежуточных продуктов технологического процесса получения субстанции Ройлевин (№М-04868244-52-2016) и стандартного образца горминона (ТУ 9369-188-04868244-2015).
Методология и методы исследования Методология исследования построена на анализе и обобщении литературных данных по изучению ботанических характеристик корней шалфея лекарственного, химических свойств, медико-биологических характеристик, распространения ройлеанонов в природе и включала изучение химического состава корней шалфея лекарственного, изучение химического состава субстанции антимикробного действия из корней шалфея лекарственного, изучение биологической активности субстанции и индивидуальных веществ. При выполнении работы были использованы фармакогностические, химические, инструментальные физико-химические и микробиологические методы исследования.
Достоверность научных положений и выводов Достоверность выполненных исследований подтверждается точностью регистрации данных в первичной документации, получением результатов с использованием современных методов анализа, а также статистической обработкой полученных данных и сопоставлением с данными литературы.
Апробация результатов исследования Основные положения работы доложены на III и IV научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые и фармация XXI века» (г. Москва, 2015, 2016); Международной научно-практической конференции «Биологические особенности лекарственных и ароматических растений и их роль в медицине (г. Москва, 2016). Апробация работы прошла 30 мая 2017 года на заседании Секции по разработке и исследованию биологически активных веществ и фитопрепаратов Ученого Совета ФГБНУ ВИЛАР.
Личный вклад автора Автору принадлежит ведущая роль в определении темы, в постановке цели и задач исследования диссертационной работы, анализе и обобщении полученных результатов. Все экспериментальные работы выполнены лично автором. Автором
разработана следующая нормативная документация: проект НД на субстанцию антимикробного действия, методики количественного определения горминона в сырье, промежуточных продуктах технологического процесса и готовой субстанции, ТУ на горминон СО. Вклад автора является определяющим на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и внедрения их в практику.
Внедрение результатов исследования Результаты, полученные диссертантом в процессе исследования, внедрены в учебный процесс для аспирантов ФГБНУ ВИЛАР (Акт внедрения от 02.05.2017 г.), а также использованы отделом фармацевтической технологии ФГБНУ ВИЛАР для разработки лекарственных форм антимикробного действия. Получен патент № 2596500 «Фармацевтическая композиция антимикробного действия». Дата регистрации 10 августа 2016 года.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения, изложенные в данной диссертационной работе, соответствуют паспорту специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведения исследования соответствуют паспорту специальности конкретно пунктам 2,3,6.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки Работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ФГБНУ ВИЛАР с 2014 по 2017 год (№ государственной регистрации 0576-2014-0009).
Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвящённой методам и объектам исследования, четырех глав экспериментальной части, списка литературы и приложений. В диссертации содержатся 21 таблица, 39 рисунков. 3 схемы. Список литературы включает в себя 134 источника, из которых 78 на иностранных языках.
Установление структуры ройлеанонов
Впервые ройлеаноны были выделены из растений сравнительно недавно. Первая публикация о выделении ройлеанонов из Inula royleana D.C. датирована 1962 годом. К этому времени были уже хорошо разработаны инструментальные методы исследования, которые и нашли широкое применение при установлении строения ройлеанонов.
В настоящее время физико-химические и химические методы идентификации ройлеанонов используются в совокупности.
ИК-спектроскопия.
В настоящее время метод играет вспомогательную роль. Полосы поглощения при 3350 см-1[74,80,119] подтверждают наличие ОН-группы с Н-связью, 3 1670 и 1630 cм-1 обусловлена хиноновыми карбонилами[42,86]. Поглощение в области более высокой частоты ( 1750 см-1) указывает на наличие С=О сложноэфирной группы. В целом ИК-спектры незаменимы при непосредственном сравнении исследуемого и аутентичного соединений.
УФ-спектроскопия.
В УФ-спектрах ройлеанонов практически всегда наблюдается полоса поглощения в области 270-278 нм, в спектрах некоторых соединений появляются очень слабые длинноволновые полосы с максимумом при 400-410 нм [10,74,80,119].
Измерение кривой дисперсии (КД) в УФ области [30] дает информацию о стереохимии ройлеанонов (Рисунок 6). Сравнение эффекта Коттона в КД известного и изучаемого вещества указывает на их тождественную или отличающуюся стереохимию [41,80].
ЯМР-спектроскопия.
ЯМР-спектроскопия как 1Н так и 13С очень широко используется при решении вопросов структуры в химии ройлеанонов. Структурное разнообразие ройлеанонов (Таблица 1) не дает возможности выделить общие характеристические параметры 1Н ЯМР спектров для всей группы этих соединений, а только для отдельных подгрупп (Таблица 2).
Ройлеаноны с незамещенным кольцом А и изопропильной группировкой при С-13 хинонового кольца.
В это группу соединений входят ройлеанон, горминон, таксохинон, 7 ацетоксиройлеанон, 6,7-дегидроройлеанон, неморон, 7-оксоройлеанон, 6,7 дигидроксиройлеанон, 7-ацетокси-6-гидроксиройлеанон, 6 гидроксиройлеанон, 7-ацетокси-6,20-дигидроксиройлеанон, 7,20 эпоксиройлеанон. Характеристическими сигналами этой группы веществ в
1Н ЯМР спектрах являются: 1)септет в области 3,09-3,18 м.д. и два дублета в области 1,10-1,23 м.д., J=7 Гц (изопропильная группировка); 2)синглетные сигналы метильных групп в области 0,90-1,0 м.д. (2СН3 при С-4), 1,2-1,35 м.д. (СН3 при С-10). При появлении кислородной функции при С-6 синглет СН3– при С-10 сдвигается в слабое поле до 1,56-1,62 м.д. (Таблица 2); 3)при записи 1Н ЯМР спектра в апротонном растворителе (CDCl3) ОН– при С-12 дает сигнал со стабильными параметрами: синглет, 7,25-7,34 м.д. [80,92,123] для всех известных ройлеанонов, что обусловлено прочной Н связью [87]; 4)при наличии ОН – групп в положении 7 Н-7 проявляются в виде мультиплета при 4,7 м.д. При этом мультиплетность сигнала Н-7 позволяет четко различать эпимеры с и ориентацией ОН- групп. Для -изомера (горминон)W12Н-7=8 Гц, для -изомера (таксохинон) W12 =22 Гц [80];
5)при наличии ацилоксигруппы в положении 7 сигнал Н-7 смещается примерно на 1,0 м.д. в слабое поле; 6)наличие двойной связи 6 в цикле В четко проявляются в виде дублета дублетов при 6,45 и 6,82 м.д., причем спин-спиновое взаимодействие с протоном в положении 5 наблюдается не только для Н-6, но и для Н-7аллильное взаимодействие [7,21,74,80,92,123].
Ройлеаноны с н-пропильной группой в хиноидном цикле.
н-Пропильная группировка при С-13 хинонового цикла в известных из литературы ройлеанонах существует в окисленной форме (Рисунок 7а и 7б)или в н-пропенильной форме(Рисунок 7в), как продукт соответствующей дегидратации.
Протоны, геминальные к гидрокси-группе, дают сигналы в обычной для них области 4,00- 4,05 м.д., для н-пропильной группировки [134] и в области 4,6-4,7 м.д. для Н-6 и Н-7 цикла В[80].
н-Пропенильная группировка довольно распространена в структуре ройлеанонов, особенно в растениях из южных широт (Абиссиния, Бали, Ю. Африка, Мадагаскар). Известно 9 соединений, содержащих этот фрагмент [78,120,134]. Характеристические параметры –СН2 – СН=СН2следующие: 4.97-5.18 м.д., м или дк ((-СН2=(Н-цис)), 5.07-5.13 м.д., м или дк (-СН2=(Н-транс)), 5.80-5.85 м.д., м (–СН=СН2), 3.13-3.24 м.д., м (–СН2 – СН=СН2).
В некоторых соединениях описываемой группы ройлеанонов в цикле при С-4 присутствует экзоциклический метилен =СН2. В спектрах таких веществ резонансные области указанного фрагмента и соответствующих протонов н-пропенильной группировки совпадают.
В ройлеанонах тропических растений имеет место окисление положения 3 в цикле А, метильных групп при С-4 (дигидрокси- и ацилокси-группы), перегруппировка в цикле А (СН3-3 и СН3-4) с последующим образованием экзоциклического метилена при С-4.
Все указанные структурные особенности фиксируются параметрами сигналов соответствующих групп. Например, при С-3 в качестве ацилокси-группы неоднократно присутствует формилокси-группа, дающая синглеты при 8,06-8,21 м.д. Ацилокси-группы при С-3, С-6, С-7резонируют при 2.0 м.д.
13С ЯМР спектроскопия.
Большую информацию о строении ройлеанонов дают спектры 13С ЯМР. Данные Таблицы 3 показывают, что химические сдвигисинглетов углеродных атомов хинонового кольца являются характеристическими параметрами для практически всех ройлеанонов. Карбонильные углероды хинонового цикла дают сигналы в области 182-190 м.д. Разница между химическими сдвигами С-11 и С-14 составляет 2-5 м.д. (для 7-оксоройлеанона 0,3 м.д.).
Авторы работ [80,91] относят слабопольный сигнал к С-11, сильнопольный к С-14. Авторы работы [123] делают обратные отнесения. С нашей точки зрения конкретные отнесения не играют роли для вывода о структуре. Оба названных сигнала можно совокупно относить к обеим С=О группам хинонового цикла, не конкретизируя их положения. Сигнал С-12 лежит в узком диапазоне 150,6-151,9 м.д. (-эффект ОН-группы) [22]. Сигнал С-13 значительно сдвигается вправо (117-125 м.д.) по сравнению с сигналами других С-атомов хинонового кольца за счет -эффекта алкильной группы. При этом в 13С ЯМР спектрах ройлеанонов с изопропильной группой С-13 резонирует в интервале 123-125 м.д., а н-пропенильной при 117-118 м.д. Углеродные атомы в положениях 8 и 9 дают сигналы в области 132-144 м.д. и 147-155 м.д. соответственно.
Сигналы заместителей.
Карбонильный атом углерода сложноэфирной группы проявляется в более сильном поле, чем С=О хинона ( 170 м.д.). Углероды н-пропенильной группы – при 133-134 м.д. (С-16) и 116-117 м.д. (С-17). Последние попадают в область сигналов С-13 (Таблица3).
Идентифтикация пентациклических тритерпеноидов. Установление строения нового вещества
Смесь веществ VII и VIII на основании данных 1Н ЯМР спектра состоит из олеаноловой и урсоловой кислот с преобладанием последней. Характеристическими для VII и VIII являются сигналы протона при С-18: для олеаноловой кислоты дублет дублетов 2,85 м.д. (-амириновый цикл), для урсоловой – дублет 2,2 м.д. (производные -амирина) (Рисунок 25) [55]. Кроме того, присутствие в смеси урсоловой кислоты подтверждается наличием двух дублетов 0,85 и 0,94 м.д. в области сигналов метильных групп.
Сигналы олефинового протона и Н-3 для обеих кислот совпадают: 5,25 и 3,25 м.д. соответственно. Также полностью совпадают зоны адсорбции VII и VIII на ТСХ, так что различить их можно только с помощью 1Н ЯМР спектроскопии, как описано выше.
Принадлежность соединений IХ и Х к пентациклическим тритерпенам следует из данных их масс-спектров. В спектре IХ присутствуют пики m/z 488 (М+), 472 (10,1%), 470 (3,9%), 442 (7,2%), 426 (4,6%), 368 (8,9%), 316 (35,6%), 285 (19,1%), 271 (33,1%), 264 (15,3%), 248 (100%), 223 (26,4%), 219 (34,9%), 203 (65,3%), 187 (34,3%). Пики m/z 264, 248 и 223 связаны с ретро 62 диеновым распадом (РДР) молекулы по связям С-9, С-11 и С-8, С-14 цикла С при наличии 12 [5,6,66]. Массовое число пика 264 (циклы D,E) свидетельствует о присутствии в этой части молекулы трех атомов кислорода, а m/z 223 (циклы А,В) указывает на наличие в этом фрагменте молекулы двух кислородных функций. Одна из кислородных функций (D,E) – карбоксильная группа, по биогенетическим соображениям расположена при С-17. Ее наличие обусловливает в масс-спектре пики m/z 442 (М-НСОН), m/z 426 (m/z 472-HCOOH, m/z 470-CO2), m/z 219 (m/z 264-COOH), m/z 203 (m/z 248-COOH). Положение третьей кислородной функции, ОН-группы, в цикле Е при С-19 однозначно следует из данных 1Н ЯМР спектра. Сигнал Н 18 при 2,5 м.д. представляет собой синглет, что связано с наличием двух заместителей при С-19 (СН3- и ОН- группы). Из этих же данных для структуры IХ осуществляется выбор между производными олеанана и урсана в пользу последнего. Сигнал метильной группы при С-20 (0,94 м.д., J=6,5 Гц) в виде дублета также согласуется с этим выводом.Две гидроксильные группы находятся в цикле А, что следует из данных масс-спектра. Разрыв связей С-9, С-10 и С-5, С-6 и отщепление цикла А с m/z 156 дает пики m/z 332 (M+ C9H16O2) и 316 (m/z 472-C9H16O2). Одна ОН-группа находится при С-3.
Вицинальное расположение к ОН-группе при С-3 второй ОН-группы следует из наличия кросс-пика 3,92 м.д./3,30 м.д. в спектре COSY между сигналами Н-2 и Н-3. Вопрос о взаимном пространственном расположении гидроксильных групп в молекуле Х решали путем сопоставления с литературными данными [81,90,116,117]. Рассмотренному выше расположению функциональных группв скелете урсана отвечают эускафиковая (2,3) и торментоловая (2,3) кислоты. Параметры сигнала метильных групп и Н-2, и Н-3 в 1Н ЯМР спектрах позволяют сделать выбор в пользу конкретного стереоизомера: вещество IХ отвечает структуре эускафиковой кислоты С30Н48О5 (Таблица 7).
Вещество Х так же, как и IХ, по данным 1Н ЯМР и масс-спектров принадлежит к пентациклическим тритерпенам урсанового типа.
Действительно, масс-спектр Х содержит те же основные пики, что и в спектре вещества IХ: М+ 472 (1,6%), m/z 316 (M+ - С9Н16О2), m/z 248 (D,E), m/z 223 (A,B) – РДР, m/z 203 (m/z 248 -СООН). Отсутствие пика m/z 264 в сочетании с сигналом Н-18 в виде дублета в 1Н ЯМР спектре (2,2 м.д.) и его смещение в сильное поле по сравнению с 1Н ЯМР спектром IХ (2,52 м.д.) указывает на отсутствие ОН- группы при С-19. Пик m/z 223 в масс спектре Х и сигналы протонов в 1Н ЯМР спектре 3,93 м.д., ддд, J1=12 Гц, J2=J3=2,85 Гц (Н-2)и 3,31 м.д., д, частично перекрывающийся с сигналом растворителя (Н 64 3) подтверждают наличие ОН-групп при С-2 и С-3. Таким образом Хявляется 19-дезоксиэускафиковой кислотой С30Н48О4
Аналогично протекает и фрагментация 19-дезоксиэускафиковой кислоты.
Принадлежность вещества ХI к пентациклическим тритерпенам следует из данных масс-спектра. В масс-спектре наблюдаются следующие характеристические пики: m/z 486, m/z 442, m/z 248 (100%), m/z 223, m/z 219, m/z 203. Характер ретродиенового распада свидетельствует о наличии двойной связи 12[66]. Пик m/z 248 характерен для иона, включающего циклы D.E, карбоксильную группу, отщепление которой дает пик m/z 203. Пик m/z 248 образуется не из молекулярного иона, а после отщепления из последнего двух ОН-групп. Наличие в масс-спектре пика иона m/z 223, включающего циклы А и В, свидетельствует о расположении двух кислородных функций в этом фрагменте. Слабоинтенсивный пик m/z 486 обусловлен ионом, образующимся в результате потери молекулярным ионом Н2О. Наличие пиков m/z 442 и m/z 219 связано с конкурирующим распадом иона m/z 486 (m/z 486 – CO2) и последующим ретродиеновым распадом с образованием ионов m/z 219 (циклы D, E) и 223 (циклы А,В). Дальнейшая информация о структуре вещества ХI следует из данных 1Н ЯМР спектра.
Принадлежность вещества ХI к производным -амирина следует из параметров сигнала Н-18: дублет дублетов 2,84 м.д., J1=13,6 Гц, J2=4,5 Гц, что свидетельствует об отсутствии заместителя при С-19 и присоединении обеих СН3-групп к С-20. Мультиплетность сигнала Н-3 (дублет 3,07 м.д., J=9,6 Гц) указывает на наличие второй кислородной функции при С-2. Спин-спиновое взаимодействие между Н-2 и Н-3 показано также наличием кросс-пиков 3,79/3,07 м.д. в спектре H,H COSY. Значение КССВ в сигнале Н-2 (секстет, 3,79 м.д., J1=11,4 Гц, J2=9,6 Гц, J3=4,3 Гц) свидетельствует о 2, 3 конфигурации протонов при С-2 и С-3 (Таблица 8).
Три кислородные функции из 5 присутствуют во фрагменте, состоящем из колец D, E. Одна из кислородных функций по биогенетическим соображениямкарбоксильная группа при С-17. Наличие карбоксильной группы подтверждается фрагментацией молекулы XI под действием электронного удара, а именно отцеплением m/z 45 (СООН) от иона, дающего пик m/z 248 (циклы D, E) и образованием пика m/z 203. В 1Н ЯМР спектре присутствуют сигналы только 7 метильных групп и отсутствуют сигналы протонов продукта промежуточного окисления метильной группы (НСО, СН2ОН). В 1Н ЯМР спектре присутствуют дублеты 4,05 м.д. и 3,35 м.д., КССВ 11,2 Гц обусловленные транс-диаксиальными протонами изолированной группировки –СНОН-СНОН-. Взаимодействие протонов следует из наличия кросс-пиков 4,05/3,35 в Н,Н СOSY (Рисунок 27). Такая группировка может быть в цикле Е: С(21)НОН-С(22)НОН или в цикле D: С(15)НОН-С(16)НОН.
Выбор в пользу первого варианта сделан на основе следующих соображений. При наличии ОН-групп в цикле D при С-15 и С-16 или только при С-16 синглетный сигнал СН3-27 в 1Н ЯМР спектре (d5-пиридин) присутствует в области 1,78-1,85 м.д. [83]. При отсутствии замещения С-15 и С-16 метильная группа СН3-27 дает сигнал при 1,65 м.д. (торментоловая кислота). Сигнал СН3-27 вещества XI расположен при 1,58 м.д., что согласуется с отсутствием замещения в цикле D.
Технология получения субстанции антимикробного действия ройлевин
Для решения поставленной задачи необходимо было выполнить следующуюработу:
1. Изучить состав ройлеанонов в корнях шалфея лекарственного и сопоставить их антимикробную активность;
2. Изучить природу сопутствующих веществ, строение молекул и возможность их вклада в антимикробную активность;
3. Изучить возможность трансформации ацетилгорминона в более активный горминон в результате щелочного гидролиза. Доказать стабильность горминона в щелочной среде. Изучить характер и скорость реакции гидролиза 7-ацетоксигорминона в щелочной среде;
4. Разработать лабораторный регламент получения Ройлевина. Провести оптимизацию параметров экстракции сырья;
5. Разработать метод количественного определения горминона в сырье, субстанции Ройлевин и для постадийного контроля производства препарата.
Решению 1й и 2й задач посвящена III Глава диссертации. В данной главе описывается процесс решения последующих (3-5) задач.
Ранее из корней шалфея лекарственного в 70-х годах 20 столетия в ВИЛАР был разработан препарат антимикробного действия, который предполагалось использовать только как полуфабрикат для получения лекарственных форм. Антимикробная активность обуславливалась суммой горминона и ацетоксигорминона, соотношение которых колеблется от 2:8 до 8:2[29]. Технологическая схема получения этого препарата следующая:
1. экстракция измельченного сырья 70% изопропиловым спиртом;
2. упаривание изопропиловых экстрактов;
3. экстракция водного кубового остатка петролейным эфиром (примерно, семикратная);
4. упаривание петролейноэфирных экстрактов;
5. выдерживание сгущенного петролейноэфирного раствора в холодильнике ( 3 суток). В случае получения смолистого продукта кристаллизацию повторяют;
6. сушка, измельчение готового продукта.
В качестве сопутствующих ройлеанонам веществ в препарате присутствуют малополярные соединения липидного характера, насыщенные углеводороды с молекулярной массой свыше 400 типа нонакозана.
Нами был разработан способ полученияантимикробной субстанции из корней шалфея лекарственного на принципиально иной технологической основе. В качестве антимикробного начала присутствует индивидуальное соединение, наиболее активный ройлеанон горминон (его активность в отношении золотистого стафилококка 15,6 мкг/мл, ацетоксигорминона 62,5 мкг/мл). Принцип технологии следующий: в качестве экстрагента выбран 96% этиловый спирт. После отгонки растворителя кубовый остаток разбавляют водой, полностью отгоняют спирт, обрабатывают хлороформом с последующей экстракцией целевого продукта из хлороформа раствором водной щелочи, который подкисляют соляной или серной кислотой.Осадок целевого продукта отфильтровывают, промывают, сушат, измельчают. Экстракцией целевого продукта щелочью в виде фенолята, растворимого в воде, решаются сразу две задачи – гидролиз менее активного 7-ацетоксиройлеанона и отделение от 7-гидроксиройлеанона примесей липидного характера, остающихся в хлороформе [47].
Введение в схему щелочного агента (1% водный раствор гидроксида натрия) требовало доказательства стабильности целевого продукта в щелочной среде. С этой целью был записан 1Н ЯМР спектр горминона в присутствии 1% гидроксида натрия в дейтерометаноле (CD3OD) через 20 минут после растворения, через 6 часов и 24 часа.Изменений в спектрах не наблюдалось (Рисунок 30). Из этого опыта можно сделать вывод о стабильности конечного продукта реакции горминона в щелочной среде в течение по крайней мере 24 часов и о возможности жидкофазной экстракции в течение такого времени.
Дальнейшей нашей задачей являлось доказательство отсутствия конкурирующих реакций в ходе щелочного гидролиза ацетилгорминона типа дегидратации и получения единственного целевого продукта – горминона. Опыт проводили следующим образом: 20 мг ацетилгорминона растворили в 5 мл 1% раствора NaOH в D2O. Отбирали пробы по 1 мл раствора через 6, 11, 16 и 23 минутыпосле растворения, подкисляли 5% раствором HClдо нейтральной реакции, извлекали реакционную смесь дейтерохлороформом, удаляли водную фазу и записывали 1Н ЯМР спектр хлороформного раствора. При воздействии щелочи на ацетат действительно наблюдается образование одного продукта – горминона (Рисунок 31).
В 1Н ЯМР спектрах, с помощью которых контролировали ход реакции, присутствуют сигналы только исходного 7-ацетилгорминона (Н-7 5,8 м.д., мультиплет) и продукта реакции – горминона (Н-7 4,75 м.д., мультиплет).
Отсутствуют дублеты дублетов в ароматической области (6,5-6,8 м.д.) характерные для олефиновых протонов 6,7 дегидроройлеанона.Следовательно, возможная побочная реакция дегидратации при элиминировании ацетоксигруппы не имеет места.
Поскольку реакция гидролиза идет с уменьшением концентрации исходного вещества, значение логарифма в уравнении будет отрицательным (Рисунок 33).
Таким образом в результате описанных экспериментов моделирования реакции гидролиза ацетилгорминона и способности горминона сохранять стабильность в течение 24 часов показана возможность использования этой реакции в технологии получения антимикробного препарата Ройлевин. Следующей нашей задачей при разработке регламента получения Ройлевина была оптимизация параметров технологического процесса.
Нами проведены опыты по выбору оптимальных параметров на головной стадии экстракции сырья 96% этанолом и на стадии жидкофазной экстракции водного кубового остатка хлороформом и хлороформа – водной щелочью. На стадии экстракции сырья варьировались кратность экстракции (2 или 3), время каждой экстракции, соотношение массы сырья и объема экстрагента, размер частиц и температура экстракции. Результаты представлены в таблицах 11-14.
Анализ таблиц показывает, что оптимальными параметрами являются соотношение массы сырья и объема экстрагента 1:5, время 1й, 2й, 3й экстракций соответственно 4, 3, 2 часа, размер частиц измельченного сырья 3 мм. Данные 13й таблицы показывают, что выход ройлеанонов существенно не меняется в интервале температур 20-40 0С. При нагревании до 60 0С возможно увеличение перехода в раствор поглощающих в УФ области продуктов неройлеанонового характера. Мы остановили свой выбор на экстракции при комнатной температуре.
Методика количественного определения горминона в Ройлевине
Поскольку в препарате Ройлевин присутствует только одно поглощающее в УФ области вещество, горминон, то измерение УФ спектра раствора Ройлевина проводится без дополнительной обработки.
Анализ готового продукта Методика проведения анализа: в мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 0,02 г субстанции Ройлевина, прибавляют 10 мл спирта этилового 96%, перемешивают до полного растворения и доводят до метки этим же растворителем (раствор А). Затем в мерную колбу вместимостью 25 мл приливают 1 мл раствора А и доводят до метки спиртом этиловым 96% (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 273 нм. В качестве раствора сравнения используют спирт этиловый 96%.
Содержание горминона в процентах в пересчете на абсолютно сухую субстанцию Ройлевина рассчитывают по формуле
Валидационная оценка методики количественного определения горминона в Ройлевине проводилась по следующим показателям: специфичность, линейность, правильность, внутрилабораторная прецизионность.
Специфичность. Проверка соответствия максимума поглощения спектра раствора Ройлевина в спирте этиловом 96 % и СО 7-гидроксиройлеанона (горминона), полученных на регистрирующем спектрофотометре в диапазоне длин волн 240-340 нм.
УФ-спектр Ройлевина, субстанции антимикробного действия из корней шалфея лекарственного в диапазоне длин волн от 240 до 340 нм имеет максимум поглощения при длине волны 273±2 нм. Аналогичный максимум поглощения имеет спектр раствора стандартного образца горминона (Рисунок 37).
Линейность. Около 0,005 г (точная навеска) СО горминона помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл спирта этилового 96 %, перемешивают и объем раствора доводят этим же спиртом до метки, 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и объем раствора доводят до метки спиртом этиловым 96 %, перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
Определение линейности проводилось на 8 уровнях концентраций СО горминона в диапазоне 4 – 27,2 мкг/мл (Таблица 17, Рисунок 38).
Коэффициент корреляции составил 0,9994, что соответствует критерию приемлемости линейности.
Правильность.Модельные смеси готовили трех концентраций с содержанием СО горминона 25, 50, 75 % к ее исходной концентрации в спиртовом растворе Ройлевина (Таблица 18).
Показано, что процент восстановления находится в пределах от 98,30 % до 101,7 % и имеет среднее значение 99,56 %, что соответствует требованиям критерия приемлемости.
Внутрилабораторная прецизионность.
Сходимость методики. Определение процентного содержания горминона в 6 повторностях образца Ройлевина, субстанции антимикробного действия из корней шалфея лекарственного, выполнялось одним аналитиком при одних и тех же условиях (реактивы, оборудование, обстановка и др.), в течение короткого промежутка времени (Таблица 19).
Коэффициент вариации для 6 измерений имеет значение 1,31, что соответствует требованиям критерия приемлемости.
Воспроизводимость методики.Определение внутрилабораторной воспроизводимости методики проводили 2 аналитика на 9 повторностях образца Ройлевина, субстанции антимикробного действия из корней шалфея лекарственного, приготовленных независимо друг от друга (Таблица 20).
Для определения числового показателя содержания горминона в Ройлевине было протестировано 11 образцов субстанции на антимикробную активность в отношении золотистого стафилококка (Таблица 21). Анализ таблицы показывает, что антимикробная активность в отношении золотистого стафилококка для Ройлевина в 2 раза ниже, чем у горминона (31,2 и 15,6 мкг/мл соответственно), в 2 раза выше, чем у ацетоксигорминона (62,5 мкг/мл) и равна активности 7-оксогорминона (31,2 мкг/мл). Активности Ройлевина, равной 31,2 мкг/мл, отвечают образцы с содержанием горминона от 57,24 до 36,4 %. На основании этих данных установлена нижняя норма содержания горминона в Ройлевине 35%.
Полученные значения коэффициента вариации не превышают 2 %, различия между результатами сотрудников статистически незначимы (Fфакт. F табл.), что позволяет считать внутрилабораторную воспроизводимость результатов приемлемой.
Полученные экспериментальные данные позволяют положительно оценить методику количественного определения 7-гидроксиройлеанона (горминона) в Ройлевине, сусбтанции антимикробного действия из корней шалфея лекарственного по полученным значениям параметров:
Контроль специфичности (совпадение максимумов поглощения при длине волны 273±2 нм); Контроль линейности методики (коэффициент корреляции 0,9994);
Контроль правильности методики (диапазон процента восстановления – от 98,30 % до 101,7 %);
Контроль внутрилабораторной прецизионности методики: Сходимость методики (коэффициент вариации 1,31 %);
Воспроизводимость методики(коэффициенты вариации внутрилабораторной воспроизводимости не превышают 2 %).
Методику можно считать пригодной для достоверного количественного определения 7-гидроксиройлеанона при получении Ройлевина, субстанции антимикробного действия из корней шалфея лекарственного.
Содержание горминона в Ройлевине устанавливается не ниже 35%.