Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .17
1.1. Методы определения БАВ в ЛРС и ФП 17
1.1.1. Определение полифенольных соединений 17
1.1.1.1. Антоциановые соединения 17
1.1.1.2. Флавоноиды 23
1.1.1.3. Дубильные вещества 29
1.1.2. Методы определения аминокислот 36
1.2. Современные подходы к стандартизации и оценке качества
растительных масел и масляных экстрактов фармацевтического назначения 47
Выводы к главе 1 .65
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 67
Глава 3. Разработка методологических подходов к определению основных групп бав лрс и масляных экстрактов методом ТСХ 82
3.1. Исследование хроматографических характеристик липофильных
БАВ в тонком слое сорбента 82
3.1.1. Изучение закономерностей хроматографического поведения -каротина .83
3.1.2. Изучение закономерностей хроматографического поведения эргокальциферола 85
3.1.3. Изучение закономерностей хроматографического поведения витамина А 88
3.1.4. Изучение закономерностей хроматографического поведения и количественное определение витамина Е в тонком слое .90
3.1.5. Разработка методики разделения и определения жирорастворимых витаминов при совместном присутствии 93
3.2. Исследование хроматографических характеристик водорастворимых БАВ в тонком слое сорбента 100
3.2.1. Количественное определение рутина методом ТСХ 100
3.2.2. Количественное определение аскорбиновой кислоты методом ТСХ 104
3.2.3. Исследование хроматографических характеристик аминокислот в тонком слое 111
3.2.3.1. Количественное определение глутаминовой кислоты методом ТСХ 118
3.2.4. Количественное определение полифенольных соединений методом ступенчатого элюирования в тонком слое сорбента .121
3.2.5. Количественное определение простых сахаров в тонком слое сорбента 127
Выводы к главе 3 136
Глава 4. Общие методологические подходы к стандартизации, оценке качества и безопасности применения лрс и масляных экстрактов на его основе 139
4.1. Определение экстрактивных веществ 139
4.2. Определение масовой доли липофильных групп БАВ в ЛРС 142
4.3. Определение экотоксикантов в ЛРС и масляных экстрактах на его основе 142
4.3.1. Определение тяжелых металлов и мышьяка в ЛРС и масляных экстрактах на его основе 143
4.3.2. Определение остаточных пестицидов и радионуклидов 145
4.3.3. Определение микробиологической чистоты и микотоксинов в ЛРС и масляных экстрактах на его основе 148
4.4. Разработка общих методологических подходов к определению некоторых групп БАВ в ЛРС 154
4.4.1. Сравнительная характеристика различных методов определения органических кислот в растительных объектах 154
4.4.2. Исследование аминокислотного состава извлечений из растительных объектов физико-химическими методами 159
4.4.2.1. Определение аминокислот методом двумерной ТСХ .159
4.4.2.2. Определение аминокислот в тонком слое с применением однократного элюирования 163
4.4.2.3. Определение полного состава аминокислот в изучаемых растительных объектах 167
4.4.3. Определение жирорастворимых витаминов в растительных объектах методом ТСХ 171
4.4.4. Разработка методики определения танина и галловой кислоты при совместном присутствии в фармацевтических субстанциях растительного происхождения 174
4.4.5. Исследования элементного состава изучаемого ЛРС методом масс-спектрометрии 180
4.5. Исследование мембраностабилизирующей, антиоксидантной и антитоксической активности водных извлечений из ЛРС на тест-системе Рaramecium caudatum 187
Выводы к главе 4 .191
ГЛАВА 5. Исследования по стандартизации комплекса бав и выбору оптимальных условий хранения плодов облепихи крушиновидной 193
5.1. Исследование микродиагностических признаков высушенных плодов облепихи крушиновидной 193
5.2. Изучение состава БАВ извлечений из свежих и высушенных плодов облепихи крушиновидной методом спектрофотометрии 194
5.3. Исследование комплекса гидрофильных групп БАВ плодов 196
5.3.1. Разработка методик идентификации и количественного определения антоциановых соединений в плодах облепихи крушиновидной 196
5.3.1.1. Исследование спектральных характеристик антоциановых соединений плодов облепихи крушиновидной 196
5.3.1.2. Определение антоциановых соединений в плодах облепихи крушиновидной методами рН-дифференцированной спектрофотометрии .205
5.3.2. Исследование состава флавоноидов в плодах облепихи крушиновидной 209
5.3.2.1. Разделение и идентификация флавоноидов методом ТСХ 209
5.3.2.2. Количественное определение суммы флавоноидов
методом дифференциальной спектрофотометрии .212
5.3.2.3. Исследование фенольной фракции плодов методом ВЭЖХ- МС. 215
5.3.3. Определение аминокислот в свежих, замороженных и высушенных плодах облепихи крушиновидной 217
5.3.4. Определение органических кислот 224
5.3.4.1. Определение суммы органических кислот титриметрическим методом .224
5.3.4.2. Определение аскорбиновой кислоты в плодах 225
5.3.4.3. Спектрофотометрическое определение гидроксикоричных кислот в плодах облепихи крушиновидной 225
5.3.5. Сравнительная характеристика различных методов определения дубильных веществ в плодах облепихи крушиновидной 228
5.3.6. Определение антиоксидантной активности извлечений из плодов облепихи .234
5.3.7. Определение микроэлемента кальция 237
5.3.8. Определение суммы свободных и связанных простых сахаров в плодах .241
5.4. Влияние различных способов экстракции на извлечение некоторых гидрофильных групп БАВ из плодов облепихи крушиновидной 249
5.5. Иследование липофильных групп БАВ плодов 251
5.5.1. Определение каротиноидов в плодах облепихи крушиновидной
5.5.1.1. Исследование каротиноидного состава плодов и масла облепихи .252
5.5.1.2. Количественное определение суммы каротиноидов в плодах облепихи методом спектрофотометрии в видимой области 253
5.6. Исследования по выбору оптимального способа консервации плодов облепихи крушиновидной 260
Выводы к главе 5 .261
ГЛАВА 6. Исследование и стандартизация комплекса бав листьев крапивы двудомной 264
6.1. Определение комплекса липофильных БАВ листьев крапивы 264
6.1.1. Определение гидроксикоричных кислот, каротиноидов и хлорофилла 264
6.1.2. Разработка ТСХ-методики разделения и определения липофильных пигментов листьев крапивы двудомной 268
6.1.3. Исследование состава пигментнов листьев и масляного экстракта крапивы двудомной 274
6.2. Определение гидрофильного комплекса БАВ листьев крапивы .281
6.2.1. Определение органических кислот в листьях крапивы двудомной .281
6.2.2. Определение флавоноидов в листьях крапивы двудомной .284
6.2.3. Определение дубильных веществ в листьях крапивы двудомной 295
6.2.4. Определение суммы свободных аминокислот в листьях крапивы .301
6.2.5. Определение антиоксидантной активности водно-спиртовых извлечений из листьев крапивы двудомной 308
6.2.6. Определение микроэлементов магния и кальция методом комплексонометрии 310
6.3. Анализ структуры забракованной продукции на основе изучаемого ЛРС за 2004-2016 гг 314
Выводы к главе 6 .315
ГЛАВА 7. Исследования по стандартизации и оценке качества масляных экстрактов на основе исследуемого ЛРС 317
7.1. Исследование недоброкачественных и фальсифицированных ЛРП
на основе растительных месел и масляных экстрактов за 2004-2016 гг 317 7.2. Исследования по стандартизации и оценке качества масляных экстрактов из ЛРС 321
7.2.1. Определение общих показателей качества изучаемых масляных экстрактов 321
7.2.2. Исследование качества липидного комплекса изучаемых объектов 323
7.2.3. Определение БАВ в изучаемых масляных экстрактов .326
7.2.3.1. Экспресс-анализ БАВ в оценке качества масляных экстрактов 327
7.2.3.2. Определение каротиноидов в масляных экстрактах 328
7.2.3.3. Определение токоферолов в масляных экстрактах 330
7.2.3.4. Определение флавоноидов в экстракционных маслах методом дифференциальной спектрофотометрии 335
7.2.3.5. Исследование жирнокислотного состава масляных экстрактов .336
7.2.3.6. Определение антиоксидантной активности масляных экстрактов
7.2.4. Идентификация масляных экстрактов методом ТСХ 339
7.2.5. Изучение БАВ масляных экстрактов методом ИК – спектроскопии 343
7.2.5.1. Изучение характеристических полос поглощения -токоферола в ИК-области 344
7.2.5.2. Изучение характеристических полос поглощения БАВ масляных экстрактов в
7.3. Исследование стабильности масляных экстрактов при хранении 350
Выводы к главе 7 352
Общие выводы 355
Список использованных сокращений .357
Список литературы
- Антоциановые соединения
- Изучение закономерностей хроматографического поведения витамина А
- Определение тяжелых металлов и мышьяка в ЛРС и масляных экстрактах на его основе
- Разработка методик идентификации и количественного определения антоциановых соединений в плодах облепихи крушиновидной
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Концепция государственной политики в
области обеспечения населения Российской Федерации (РФ) эффективными
доступными отечественными лекарственными средствами (ЛС), в т.ч.
импортозамещение перспективными лекарственными препаратами (ЛП) растительного происхождения, предусматривает расширение исследований состава биологически активных веществ (БАВ) лекарственного растительного сырья (ЛРС) не только фармакопейных видов, но и сырья, традиционно используемого в народной медицине. Растущий интерес к фитотерапии стимулирует не только расширение разнообразия сырьевой базы растений и разработки новых фитопрепаратов (ФП) на их основе, но и постоянное совершенствование методик стандартизации, а также обоснование оптимальных условий заготовки и хранения официнального ЛРС.
Разнообразие масляных экстрактов (МЭ) из растений на фармацевтическом рынке России стремительно увеличивается, с каждым годом составляя все большую конкуренцию аналогичным лекарственным ФП. В настоящее время на Российском фармацевтическом рынке находится в обращении несколько десятков наименований МЭ. Де-юре абсолютное большинство МЭ являются биологически активными добавками (БАД) и, следовательно, процесс их производства и контроль за их качеством регламентируется нормативной документацией (НД) пищевой индустрии. Однако реализация этой продукции осуществляется через аптечные сети и поэтому ответственность за качество и безопасность МЭ несет фармацевтическая отрасль. При производстве МЭ разрабатываются технические условия (ТУ), в которых описаны методы контроля качества, содержащие ссылки на методические указания (МУ), ГОСТы, фармакопейные статьи (ФС) или выдержки из них. С химической точки зрения МЭ являются довольно сложным объектом для анализа. Отсутствие системного подхода, учитывающего взаимное влияние отдельных ингредиентов различной физико-химической природы, является одной из основных проблем в стандартизации этого вида продукции. В то же время качество МЭ фармацевтического назначения определяется такими составляющими, как использование исходного сырья (ЛРС и масел-экстрагентов), отвечающего требованиям современной НД; соблюдение технологии производства, а также установление условий хранения и сроков годности, обеспечивающих эффективность и безопасность применения.
Анализ сложившихся подходов к оценке качества ЛРС и ФП, в т.ч. МЭ, позволил выявить ряд проблем, требующих концептуального научного подхода для их решения:
-
Необходимость разработки новой современной НД на ЛРС и ФП, гармонизированной с требованиями Европейской фармакопеи (ЕФ), в соответствии с которой стандартизация и оценка качества должна проводиться по содержанию БАВ;
-
Представленные в литературе отдельные исследования состава БАВ в ЛРС и ФП носят фрагментарный характер, однако известно, что уникальные фармакологические свойства лекарственных растительных препаратов (ЛРП) обусловлены комплексным характером действия БАВ, превосходящим по силе отдельные полученные синтетические аналоги;
-
Существует проблема рационального использования растительных ресурсов, что требует дополнительного исследования даже традиционного ЛРС (новые части растения, не подвергающиеся заготовке; выявление новых видов фармакологической активности; возможность применения других способов заготовки и консервации);
-
В рамках принципа «сквозной стандартизации» подробно исследованы водные и водно-спиртовые извлечения из ЛРС. Однако, проблемы перехода БАВ в МЭ в литературе освещены недостаточно, что существенно затрудняет реализацию широкого использования МЭ в фармации, как ЛС;
-
В связи с появлением новых требований к оценке безопасности применения ЛРС и ФП, возникает необходимость проведения дополнительных исследований по оценке накопления отдельными растениями и их частями опасных радионуклидов, тяжелых металлов, остаточных пестицидов и микотоксинов и способности их перехода в готовые МЭ;
-
Активное внедрение заморозки плодов, как нового способа консервации, требует подробного изучения стабильности БАВ с обоснованием оптимального времени хранения;
-
Большая часть существующих фармакопейных методик определения БАВ в ЛРС и ЛРП позволяет установить лишь суммарное содержание определенной группы БАВ в пересчете на тот или иной компонент, без достоверной информации о присутствии отдельных составляющих, что требует разработки новых экспрессных и экономически доступных методик анализа;
-
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), позволяющая проводить одновременное разделение, идентификацию и количественное определение
компонентов в сложных смесях, не всегда является предпочтительной при анализе ЛРС,
содержащего комплекс БАВ, требующих частой смены дорогостоящих
хроматографических колонок и растворителей особой чистоты, что значительно
увеличивает стоимость одного анализа. Тонкослойная хроматография (ТСХ), обладая
всеми преимуществами хроматографических процессов, как перспективная
альтернатива, в настоящее время довольно узко используется в анализе ЛРС, в основном для установления качественного состава БАВ различных групп;
9. Оценка качества растительных масел (РМ), МЭ и БАД на их основе осуществляется в соответствии с требованиями СанПиН, по основным показателям безопасности. Контроль за составом БАВ, обусловливающих фармакологическую активность, при этом не осуществляется.
Решение выявленных проблем с применением принципов сквозной стандартизации и новых подходов при контроле качества фармацевтических объектов растительного происхождения было осуществлено на примере 2-х моделей:
1. Плоды облепихи крушиновидной различных способов консервации (как пример ЛРС
с высоким содержанием жирного масла и богатым комплексом БАВ липофильной
природы) и МЭ на их основе: официнальный препарат – «облепиховое масло»;
2. Листья крапивы двудомной (как пример ЛРС, содержащего комплекс БАВ как
гидрофильной, так и липофильной природы) и МЭ листьев крапивы двудомной.
Таким образом, исследование ЛРС, имеющего богатый состав БАВ различной природы и используемых для получения МЭ в промышленных масштабах, позволяющее сформулировать основные принципы методологического подхода к комплексной оценке качества, эффективности и безопасности, представляет собой в совокупности актуальную научную проблему, решение которой позволит существенно расширить спектр ЛРП на основе МЭ и внести важный вклад в развитие фармацевтической химии и фармакогнозии. Важность исследований продиктована также необходимостью создания частных ФС, соответствующих положениям общей фармакопейной статьи (ОФС) Государственной фармакопеи (ГФ) XIII издания «Масла жирные растительные», а также дополнения ОФС ГФ XIII издания на методы исследования ЛРС при использовании различных способов консервации. Алгоритм комплексной оценки качества от исходного ЛРС до конечного ФП, а также предложенные модели могут быть интерполированы на другие объекты аналогичной природы.
Степень разработанности темы исследования. Принципы сквозной
стандартизации, основанные на установлении содержания одной и той же группы БАВ в ЛРС и ФП с использованием одного и того же метода, активно внедряются с 90-х годов XX века в Российской Федерации в работах ведущих фармакогностов (Самылина И.А., Сорокина А.А, Куркин В.А. и др.). В настоящей работе продолжается развитие принципов сквозной стандартизации от исходного ЛРС до полученных на его основе масляных извлечений фармацевтического назначения.
Примеры теоретического подхода к решению задачи разделения сложных смесей давно описаны в литературе (Гейсс Ф., Красиков В.Д. и др.). Для конструирования подвижных фаз методом ТСХ наиболее широко используются схема, предложенная фирмой «Camag» и модель «ПРИЗМА». Предложенная и обоснованная в настоящей работе возможность теоретического подхода к выбору оптимальных условий хроматографического разделения липофильных и гидрофильных БАВ в тонком слое сорбента дает воспроизводимые результаты и позволяет с минимальными затратами решать поставленные задачи.
Свежее ЛРС в настоящее время используется в основном для изготовления ЛРП в гомеопатической практике. Традиционная медицина применяет высушенное ЛРС и полученные на его основе ФП, тогда как большая часть БАВ теряется при высушивании. Исследованиям по возможности широкого использования свежего и замороженного сырья и интенсификации процессов выделения БАВ посвящены работы Молчанова Г.И., Сорокиной А.А. и Сергуновой Е.В.
Учеными Сибири разработана концепция ресурсосберегающей технологии переработки биомассы облепихи крушиновидной, позволяющая решить проблемы рационального использования шрота, как побочного продукта в производстве облепихового масла, с сохранением БАВ (Золотарева А.М.). Однако, отсутствует информация о влиянии высоких и отрицательных температур на качественный и количественный состав БАВ в плодах облепихи крушиновидной. Имеются данные об основных диагностических признаках плодов (Самылина И.А., Аносова О.Г. и др.) без сведений о влиянии способа консервации на их вариабельность.
Исследованиям по стандартизации БАВ МЭ посвящены работы Шикова А.Н., Нестеровой О.В., Мининой С.А. и др. Однако, ввиду появления на фармацевтическом рынке все большего количества новых видов РМ и МЭ на основе нетрадиционного
растительного сырья, проблемы разработки подходов к оценке их качества продолжают являться актуальными.
Цель исследования. Цель настоящего исследования - разработка
методологических подходов к стандартизации и комплексной оценке качества исходного ЛРС и МЭ на его основе для обеспечения эффективности и безопасности применения.
Задачи исследования:
1. Разработать методологический подход к комплексной оценке качества изучаемых
объектов на основе принципов сквозной стандартизации от исходного ЛРС до МЭ на
его основе, который может быть адаптирован для других аналогичных растительных
объектов;
-
Изучить влияние полярности элюента на хроматографическую подвижность основных действующих липофильных и гидрофильных БАВ растительных объектов и выявить закономерности их поведения в тонком слое сорбента. Теоретически обосновать выбор оптимальных условий идентификации и разделения БАВ в извлечениях из исследуемого ЛРС и МЭ с позиции эффективности хроматографического процесса;
-
Разработать унифицированные методики количественной оценки содержания БАВ методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и апробировать их на исследуемых объектах;
-
Разработать и валидировать методики количественного определения содержания основных групп БАВ в изучаемом ЛРС и полученных из него водных и масляных извлечениях;
-
Установить качественный и количественный состав основных действующих БАВ исследуемого ЛРС (каротиноидов, токоферолов, хлорофиллов, флавоноидов и др.) с применением комплекса физико-химических методов;
-
Изучить качественный и количественный состав основных действующих БАВ МЭ (каротиноидов, токоферолов, хлорофиллов, полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), флавоноидов и др.) и обосновать необходимость расширения показателей качества МЭ, обеспечивающего их эффективность и безопасность;
-
Разработать методики оценки качества изучаемого ЛРС и МЭ по хроматографическому профилю БАВ (метод «отпечатков пальцев») с применением ТСХ;
-
Изучить стабильность БАВ в плодах облепихи крушиновидной различных способов консервации и МЭ при хранении в режиме реального времени для обоснования оптимальных условий и сроков хранения;
-
Провести определение экотоксикантов, элементного состава и микробиологической чистоты изучаемых объектов и обосновать новые критерии для оценки безопасности их применения;
10. Разработать проекты ФС на плоды облепихи крушиновидной различных способов
консервации и получаемый на их основе МЭ – «облепиховое масло» для ГФ XIII изд., а
также дополнить ОФС «Экстракты» и «Тяжелые металлы».
Научная новизна. Предложены методологические подходы к комплексной оценке качества ЛРС и МЭ на его основе, включающие показатели оценки эффективности и безопасности применения ЛРП, на моделях ЛРС со значительным уровнем БАВ липофильной природы (плоды облепихи крушиновидной) и преобладанием гидрофильных групп БАВ (листья крапивы двудомной). Разработанные подходы могут быть использованы в качестве алгоритмов при стандартизации и оценке качества других объектов аналогичной природы.
Теоретически и экспериментально обоснован выбор оптимальных условий идентификации и разделения БАВ в извлечениях из исследуемого ЛРС и МЭ методом ВЭТСХ с использованием параметров эффективности хроматографического процесса. Выявлены закономерности хроматографического поведения основных действующих липофильных и гидрофильных БАВ растительных объектов (жирорастворимых витаминов, полифенольных соединений, аминокислот, органических кислот, простых сахаров) в тонком слое сорбента. Предложен алгоритм выбора подвижной фазы и приемов проведения хроматографического анализа, позволяющий достичь приемлемых критериев разделения БАВ ЛРС и МЭ.
Впервые разработаны унифицированные экспресс-методики количественной оценки БАВ на основе данных ВЭТСХ. Методики апробированы на исследуемых образцах ЛРС и МЭ. Новизна разработок подтверждена получением патентов на изобретения РФ (№ 2581727 от 10.10.2014; № 2581456 от 10.10.2014; № 2469316 от 06.05.2011; № 2530620 от 30.07.2013; №2597661 от 06.07.2016) и заявкой на получение патента№ 2016110353 от 21.03.2016 г.
Разработаны и валидированы методики количественного определения основных групп БАВ (каротиноидов, флавоноидов, дубильных веществ, токоферолов, аминокислот, хлорофиллов, органических кислот, антоцианов, полисахаридов и простых сахаров, некоторых макроэлементов и витаминов) в листьях крапивы двудомной и в плодах облепихи крушиновидной. Новизна разработок подтверждена получением патента на изобретение РФ № 2531940 от 15.04.2013 г и заявками на получение патентов (№ 2015102880 от 28.01.2015; № 2015127130 от 06.07.2015).
Впервые разработаны методики экспресс-оценки подтверждения подлинности и оценки качества изучаемого ЛРС и МЭ методом «отпечатков пальцев» с применением ТСХ.
Исследована, ранее не обсуждаемая в литературе, возможность перехода из ЛРС в МЭ, таких экотоксикантов, как радионуклиды и остаточные пестициды. Предложено введение в НД новых нормативов на допустимое содержание микотоксинов в МЭ и ЛРС, богатом жирными маслами, а также транс-изомеров жирных кислот.
Выявлены основные закономерности изменения содержания различных групп БАВ в плодах облепихи крушиновидной (органических кислот, флавоноидов, антоцианов, дубильных веществ, аминокислот и простых сахаров) в зависимости от способа консервации. Исследована стабильность МЭ при хранении в режиме реального времени, обоснованы условия их хранения и сроки годности.
Теоретическая значимость исследования. В работе сформулированы основные принципы методологического подхода к комплексной оценке качества ЛРС и МЭ на его основе, который может быть использован для других аналогичных объектов.
Выявлены и теоретически обоснованы закономерности хроматографического поведения представителей основных групп БАВ ЛРС и МЭ в тонком слое сорбента, позволяющие прогнозировать возможность разделения сложных смесей БАВ различной химической природы при совместном присутствии.
Показана значимость образования межмолекулярных структур БАВ в МЭ, придающих им уникальные фармакологические свойства.
Практическая значимость результатов исследования. Разработанные
унифицированные экспресс-методики количественной оценки результатов ВЭТСХ БАВ могут быть применены как для оценки качества ЛРС, так и субстанций и различных ЛС, содержащих исследуемые группы БАВ, а также найти применение в других отраслях
промышленности. Использование высокоэффективного варианта ТСХ позволяет значительно сократить время проведения анализа, снизить на порядок предел обнаружения по определяемому веществу, а также увеличить эффективность разделения БАВ на хроматограммах, снизить стоимость анализов в 5-6 раз.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Системный подход на основе принципа сквозной стандартизации к оценке качества ЛРС и МЭ на его основе, предусматривающий, наряду с определением основных групп БАВ, контроль по показателям эффективности и безопасности применения ЛРП (на примере плодов облепихи крушиновидной и листьев крапивы двудомной);
-
Результаты исследования влияния полярности элюента на хроматографическую подвижность основных действующих липофильных и гидрофильных БАВ растительных объектов, выявленные закономерности их поведения в тонком слое сорбента, а также алгоритм выбора подвижной фазы и приемов проведения хроматографического анализа, позволяющий достичь приемлемых критериев разделения БАВ ЛРС и МЭ;
-
Результаты определения содержания БАВ в исследуемых образцах ЛРС и МЭ на его основе с применением разработанных унифицированных методик количественной оценки данных ВЭТСХ;
-
Результаты оценки качества изучаемого ЛРС и МЭ по виду хроматографического профиля БАВ («отпечатки пальцев»), полученного с применением разработанных унифицированных экспресс-методик;
-
Результаты определения основных групп БАВ (каротиноидов, флавоноидов, дубильных веществ, аминокислот, хлорофиллов, органических кислот, антоцианов, сахаров, некоторых макроэлементов и витаминов) в изучаемом ЛРС с применением разработанных и валидированных методик;
-
Результаты изучения состава основных действующих БАВ МЭ (каротиноидов, токоферолов, хлорофиллов, ПНЖК, флавоноидов и др.), установленного с применением комплекса физико-химических методов;
-
Обоснование условий и сроков хранения плодов облепихи крушиновидной различных способов консервации и МЭ по результатам исследования стабильности в режиме реального времени;
-
Результаты оценки безопасности применения исследуемых объектов по содержанию экотоксикантов (тяжелых металлов, микотоксинов, остаточных пестицидов и
радионуклидов), микробиологической чистоты и обоснование необходимости введения в НД на ЛРС и МЭ ряда новых показателей качества.
Методология и методы исследования. Теоретическую основу исследования составили труды российских (Самылина И.А., Сорокина А.А., Молчанов Г.И., Муравьева Д.А., Яковлев Г.П., Куркин В.А., Золотарева А.М., Арзамасцев А.П., и др.) и зарубежных (Cheng Tigong, S.M. Sabir, Rsch, Gutzeit, Arimboor, P. Pinellietal.) исследователей, развивающих системный подход в стандартизации ЛРС и ФП; международная и российская НД на ЛРС. Методология исследования заключалась в проведении комплексной оценки качества изучаемого ЛРС и МЭ на его основе, в сравнительном изучении химического состава плодов облепихи крушиновидной в зависимости от способа консервации с последующим выбором оптимального метода консервации, позволяющего максимально сохранить БАВ, а также рекомендациями по хранению и применению сырья. При выполнении работы были использованы методы сравнительного, документированного анализа; комплекс физико-химических методов, технологических испытаний; математические методы анализа и обработки результатов.
Достоверность научных положений и выводов. Все полученные результаты и выводы основаны на достаточном количестве экспериментальных исследований. В работе использовалось сертифицированное оборудование, на которое выданы действующие свидетельства о поверке. Разработанные методики валидированы. В исследовании использован достаточный объем литературных источников отечественных и иностранных авторов.
Апробация работы. Основные результаты исследования доложены на конференциях: Х Международный конгресс молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2009); 4-ая Всероссийская с международным участием научно-методическая конференции «Фармобразование - 2010» (Воронеж, 2010); Всероссийская с международным участием на научно-практическая конференция «Традиции и инновации фармацевтической науки и практики» (Курск, 2011); XII международная научно-практическая конференция «Студенческая медицинская наука XXI века» (Витебск, 2012); 5-ая Всероссийская с международным участием научно-методическая конференция «Фармобразование - 2013» (Воронеж, 2013); Первая международная научная конференция молодых ученых и студентов «Перспективы развития биологии, медицины и фармации» (Шымкент, 2013); II Всероссийская конференции с международным участием «Современные проблемы химической науки и фармации»
(Чебоксары, 2014);Всероссийский съезд фармацевтических работников (Москва, 2014);
Международная конференция «Актуальные вопросы медицины в современных
условиях» (Санкт-Петербург, 2015); III и IV научно-практическая конференции
«Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного
происхождения в медицине» (Москва, 2015 и 2016); 5-ая международная научно-
практическая телеконференция «Фармацевтический кластер как интеграция науки,
образования и производства» (Белгород, 2015); VII научно-практическая конференция
«Актуальные вопросы оценки безопасности применения лекарственных средств»
(Москва, 2016); 6-ая международная научно-методическая конференция
«Фармобразование - 2016» (Воронеж, 2016), научно-практическая конференция «Лекарственные растения ботанического сада» (Москва, 2016) и других. Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедр фармацевтической химии и фармацевтической технологии, фармакологии; фармации; управления и экономики фармации и фармакогнозии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» (23.06.2016 г.).
Личный вклад автора. Лично автором осуществлен выбор научного направления, выполнена основная часть экспериментальных исследований. Во всех работах, опубликованных с соавторами, автору принадлежат постановка цели и задач, обоснование выбора оптимальных путей их решения, планирование и реализация эксперимента, анализ полученных результатов, формулировка общих выводов; участие в докладах и публикациях, внедрение результатов исследования.
Внедрение результатов исследования. Полученные экспериментальные данные по составу БАВ в свежих и высушенных плодах облепихи крушиновидной и полученном на их основе «облепиховом масле» использованы при разработке проектов ФС «Облепихи крушиновидной свежие плоды» и ФС «Облепихи крушиновидной плоды», а также ФС «Облепиховое масло» для ГФ РФ XIII изд. Внесены дополнения в ОФС ГФ РФ XIII изд. «Экстракты», касающиеся показателей оценки качества МЭ, которые будут включены в ОФС.1.4.1.0021.15 «Экстракты». Внесены дополнения в ОФС «Тяжелые металлы», касающиеся особенностей количественного определения отдельных ионов тяжелых металлов в МЭ. Указанные проекты приняты ФГБУ «НЦЭСМП» к рассмотрению в установленном порядке. Результаты исследований по определению жирорастворимых витаминов в МЭ включены в методическое пособие по обучающему симуляционному курсу для провизоров-ординаторов, обучающихся по
специальности 33.08.03 «Фармацевтическая химия и фармакогнозия» (акт внедрения №29-19 от 16.12.2014 г). Методические рекомендации по качественному и количественному определению аскорбиновой кислоты и рутина в ЛРС методом ВЭТСХ внедрены в лекционный курс и практические занятия с интернами кафедры фармации ФГБОУ ВО «ВГУ» (акт внедрения №29-17 от 20.06.2016 г); при проведении лабораторных занятий со студентами кафедр управления и экономики фармации и фармакогнозии и фармацевтической химии и фармацевтической технологии по дисциплинам «Фармацевтическая химия», «Фармакогнозия» и «Фитохимия» (акты внедрения № 1500-300 от 10.05.2016; № 1502-01 от 18.03.2016 г). Экспериментальные данные, опубликованные в монографии «Комплексное исследование содержания и специфического профиля БАВ плодов облепихи крушиновидной», рекомендуются для использования научными работниками и преподавателями, осуществляющими подготовку специалистов в области фармации, медицины, биологии (акты внедрения № 29-18 от 12.09.2016 г и № 1502-02 от 12.09.2016 г).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные
положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 -
фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2, 3, 5, 6 и 7 паспорта специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планами научно-
исследовательских работ ФГБОУ ВО «ВГУ» Минобрнауки России по научной проблеме «Исследование закономерностей аналоговых превращений аминогликанов в процессе создания новых противотуберкулезных, противоопухолевых и ранозаживляющих средств» (номер государственной регистрации 01201263909). Тема включена в план научных исследований фармацевтического факультета ФГБОУ ВО «ВГУ» (протоколы заседаний Ученого совета факультета за период с 2012 по 2016 гг).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 441 странице машинописного текста, содержит 188 рисунков, 234 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, общих выводов, библиографического указателя, включающего 433 источника, в т.ч. 52 на иностранном языке, и приложений (43 стр.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 105 печатных работ, в том числе и монография: «Комплексное исследование содержания и специфического профиля БАВ плодов облепихи крушиновидной» (Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2016. – 224 с.), 63 статьи, из которых 58 в журналах, входящих в список ВАК, 6 патентов на изобретения РФ.
Антоциановые соединения
Метод характеризуется высокими показателями производительности, точности определения, а также возможностью получить данные о количественном содержании, как суммы АК, так и отдельных представителей. Основным недостатком анализа АК с применением АКА является высокая себестоимость одного анализа в виду дорогостоящего оборудования, что делает его малодоступным для большинства лабораторий.
Несмотря на широкое внедрение методов ВЭЖХ и ГЖХ, анализ АК в с помощью ТСХ настоящее время используется посвеместно [99,105,317,379]. Для детектирования хромато-грамм в большинстве случаев используют 0,2 – 2 % растворы нингидрина в спирте или ацетоне. При определении определенных АК часто применяют и более селективные реагенты. Так, предложен хроматоденситометрический метод экспресс-анализа триптофана в культуральных жидкостях, в котором используется 0,5 % этанольный раствор 4-диметиламинобензальдегида с добавлением 5 % концентрированной серной кислоты, избирательно взаимодействующий с ин-дольным циклом АК [317,379].
При разработке новых методик определения основной задачей становится выбор подходящих систем растворителей, обеспечивающих достаточное разделение всех анализируемых АК. При исследовании состава АК различных объектов наиболее широко используются элюен-ты, представленные в таблице 22.
Анали данных таблицы 22, позволяет сделать вывод о том, что разделение зон АК на хроматограммах с наилучшим разрешением наблюдается при использовании элюентов с полярностью в диапазоне от 4,5 до 6,0.
В качестве сорбентов используют стандартные материалы, такие, как оксид алюминия, силикагель, ионообменники на основе целлюлозы и ее порошок, полиамиды, а также гели на основе декстранов и полиакриламидов [317,379].
Описан способ разделения смесей АК методом двумерной ТСХ с использованием сначала системы изопропанол - ацетон - 24-25%-ный водный раствор аммиака - вода в соотношении по объему (19,0-27,0):(20,0-26,0):(3,0-6,5):(6,0-10,0), а затем системы хлороформ - этанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении по объему (23,0-27,0):(13,5-16,0):(4,5-6,5):(1,3-3,5). Для проявления используют следующие реактивы: нингидриновый, Несслера, Эрлиха и др. [317,379]. Предложена ТСХ-методика определения -АК, осуществляемая в следующих системах: 1) н-бутанол - кислота уксусная - ацетон - вода (35:15:35:20); 2) два раза в системе изобу-танол - метилэтилкетон - ацетон - 12 % раствор аммиака (10:11:10:6), а затем эта же система в соотношении 10:11:10:8; 3) первое направление в системе 1 [317].
Методом двумерной ТСХ на силикагеле (Whatman, США) описан способ разделения 15 из 20 основных протеиногенных АК с последовательным элюированием в двух подвижных фазах: н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5) и фенол - вода (15:1). Этот вариант разделения АК, по сравнению с другими известными аналогами, наиболее эффективен, но занимает 7 ч на один анализ.
В [317] описан еще один способ разделения АК на двух пластинках одновременно, помещенных в две разные камеры. В камере для АК с коэффициентами подвижности 0,3, разделение проводят в элюенте, состоящем из пропанол: 24 – 42,5% водный раствор аммиака:вода (3,3 - 4,1):(0,9 -1,5):(7,5 - 9,0), а в другой - для АК с коэффициентом подвижности 0,3-1,0, разделение осуществляют в системе растворителей хлороформ:этанол:уксусная кислота:вода (52,5-54,0):(26,0 - 27,5):(8,9 - 9,6):(3,5 - 4,2) по объему.
Разработана методика разделения и определения количественного содержания 14 свободных АК в условиях восходящего двумерного хроматографирования на пластинках типа «Армсорб» (таблица 23). При использовании в первом направлении подвижной фазы: гептан -дихлорэтан - уксусная кислота (20:30:30); а во втором направлении - бутанол - уксусная кислота - вода (80:20:20) наблюдается наилучшее разделение смеси АК [317]. Таблица 23 Величины Rf АК, полученные на пластинках «Армсорб» методом двумерной ТСХ [317]
Описан способ разделения АК, модифицированных путем ацилирования остатками жирных кислот, основанный на двукратном элюированием сначала в системе гексан-диэтиловый эфир ((1,5-2):1), а далее в системе гексан-диэтиловый эфир-ацетон (1:1:0,6). Детектирование зон осуществляется в УФ-свете [317].
ТСХ является достаточно высокоточным методом определения, не требует применения оборудования с высокой стоимостью. Однако практическое использование данного метода ограничено такими недостатками, как длительность процедуры анализа (до нескольких суток), нестабильность во времени окраски продукта реакции нингидрина с АК. Поэтому временной фактор следует учитывать при определении количества АК методом ТСХ, основанном на измерении оптической плотности продукта цветной реакции. Метод ТСХ сегодня используют для предварительного исследования, более полные данные о качественнм составе АК в исследуемых образцах получают при использовании КЭ, АКА, ГЖХ и ВЭЖХ.
Бумажная хроматография (БХ) является одним из самых доступных методов исследования качественного и количественного состава АК в различных объектах. В БХ применяют те же элюенты и проявители, что и в ТСХ. В таблице 24 представлены значения величин Rf различных АК при использовании бумаги F4 в системе н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (БУВ) в соотношении 4:1:2.
В качестве цветореагента для детекции АК методом БХ описаны в литературе примеры использования оксолина. Его токсичность в десять раз меньше по сравнению с токсичностью нингидрина. После проявления хроматограмм раствором оксолина с последующим нагреванием появляется красно-фиолетового окрашивание пятен АК, обусловленое образованием нингидри-на in situ [317,379].
БХ применяется чаще всего в двумерном варианте. Систему н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:5) применяют для хроматографирования в первом направлении; во втором направлении - несколько систем: этанол - вода (95:5), бензиловый спирт – вода (70:30), пиридин - амиловый спирт - вода (35:35:30). Количественное определение АК после хроматогра-фического разделения проводят денситометрически, непосредственно анализируя хромато-граммы после элюирования. Оптическую плотность продуктов реакции определяют на ФЭК-56М с зеленым светофильтром [317,379]. Этот способ не требует специального оборудования и является доступным. Следует отметить, что его главным недостатком является длительность анализа.
Масла жирные растительные (Olea pinguia) – это природные смеси, состоящие из триа-цилглицеридов. В состав жирных масел могут входить различные БАВ в виде ЖК семейств омега-3 или омега-6; каротиноиды; токоферолы; стерины; лигнаны или другие соединения. Растительные масла (РМ) применяются в качестве слабительных, гепатопротекторных, антисклеротических, ранозаживляющих и других средств. Масла жирные, не обладающие выраженной фармакологической активностью, используются в качестве вспомогательных веществ (персиковое, миндальное, подсолнечное, льняное масло и др.) для изготовления ЛФ [271,333].
К медицинскому применению разрешены следующие жидкие жирные масла растительного происхождения: миндальное, касторовое, кунжутное, арахисовое, оливковое, рапсовое, кукурузное, соевое и др. Твердыми жирными маслами растительного происхождения, в триа-циглицеридах которых преобладают насыщенные ЖК (пальмитиновая, стеариновая и др.) являются: масло какао, пальмоядровое и кокосовое масла. Препараты на основе жирных масел и высших ЖК среди ЛС и ЛФ насчитывают более 120 наименований [271], которые можно разделить на 6 основных групп: ЛС и вспомогательные вещества, представляющие собой нативные жирные масла природного происхождения; ЛС, представляющие собой модифицированные природные жирные масла; ЛС, представляющие собой масляные экстракты (МЭ) (Extractum oleosa); ЛС, представляющие собой масляные растворы липофильных лекарственных субстанций (Solutio oleosa; Solutio oleosa pro tnjecionibus); ЛС, представляющие собой смеси высших ЖК или их эфиров; ЛС, представляющие собой смеси сложных омыляемых липидов [333].
Изучение закономерностей хроматографического поведения витамина А
Получение извлечения из листьев крапивы двудомной: измельченное ЛРС, проходящее через сито с диаметром отверстий 0,5 мм, массой около 1,0 г (т.н.), экстрагируют в конической колбе объемом 250 мл с 125 мл нагретой до кипения воды и кипятят с обратным воздушным холодильником в течение 30 мин. Жидкость процеживают через несколько слоев марли в коническую колбу, не дожидаясь охлаждения, избегая попадения частиц ЛРС в колбу.
Получение извлечения из плодов облепихи крушиновидной: Около 1,0 г (т.н.) сырья экстрагируют в конической колбе объемом 250 мл с 125 мл нагретой до кипения воды и кипятят с обратным воздушным холодильником в течение 30 мин. Жидкость процеживают через несколько слоев марли в коническую колбу, не дожидаясь охлаждения (охлаждение сопровождается снижением растворимости ДВ в воде), избегая попадения частиц ЛРС в колбу.
Отбирают 5 мл полученного извлечения в коническую колбу для титрования вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл воды, 5 мл индигосульфокислоты и титруют при постоянном перемешивании раствором калия перманганата (0,02 моль/л) от синего до золотисто-желтого окрашивания. Параллельно проводят контрольный опыт. К 5 мл индигосульфокислоты, прибавляют 105 мл воды и титруют калия перманганатом (0,02 моль/л) до золотисто-желтого окрашивания. Содержание суммы дубильных веществ (ДВ) (Хі) в процентах в пересчете на абсолютно-сухое сырье вычисляют по формуле 5: Vо и Vк - объем раствора калия перманганта (0,02 моль/л), израсходованного на титрование в основном и контрольном опытах соответственно, в мл; 0,004157 - количество ДВ в пересчете на танин, соответствующее 1 мл раствора калия перманганата (0,02 моль/л), г; а - масса ЛРС, г; W - влажность ЛРС, %;
Желатиновый метод. Отбирали 20 мл полученного извлечения, переносили в мерную колбу объемом 50 мл и добавляют 20 мл 1 % раствора желатина в 10 % растворе натрия хлорида, доводили водой до метки. Перемешивали и образовавшийся осадок отфильтровывали, отбрасывая первые порции фильтрата. Далее поступали как описано выше в методике перманга-натометрического определения. Содержание ДВ, осажденных желатином (Хз), в процентах в пересчете на абсолютно-сухое сырье вычисляли по формуле 6: Х3=Х1-Х2, (6) где Хг - сумма веществ, окисляемых перманганатом калия, после осаждения ДВ желатином
Приготовление извлечения из листьев крапивы двудомной: Точную навеску измельченного ЛРС с размером частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм, массой около 1 г, экстрагируют в конической колбе объемом 100 мл с 50 мл экстрагента (смесь гексан-этанол (1:1) или н-гексан) при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин. Затем колбу с содержимым быстро охлаждают до комнатной температуры. Извлечение процеживают через несколько слоев плотной марли, отжимая частицы ЛРС [306].
Приготовление извлечения из плодов облепихи крушиновидной: Около10,0 г (т.н.) плодов облепихи (в пересчете на абсолютно сухое сырье) разминают стеклянной палочкой в конической колбе объемом 50 мл и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин с 30 мл этанола. Затем колбу с содержимым быстро охлаждают до комнатной температуры. Извлечение процеживают через несколько слоев марли, отжимая ЛРС [306].
Анализ соединений фенольной фракции изучаемого ЛРС методом ВЭЖХ-ДМД-МС Стандарты и растворители. В качестве стандартных образцов использовались коммерчески доступные индивидуальные вещества: рутин (94%, Sigma), гиперозид (95%, HWI ANAL YTIK GMBH), изокверцитрин (94%, HWI ANAL YTIK GMBH), кемпферол-3 -глюкозид (95%, PhytoLab), хлорогеновая кислота (95%, Sigma), кофейная кислота (98%, Sigma), феруловая кислота (99%, Aldrich), розмариновая кислота ( 96%, Aldrich), кафтаровая кислота (98%, Fluka), п-кумаровая кислота (98%, Sigma), синаповая кислота (98%, Sigma). В работе были использованы следующие растворители/реактивы: вода очищенная (получена с помощью системы MilliQ Advantage А10), ацетонитрил UPLC/HPLC grade производства AppliChem PanReac (Дармштадт, Германия), метанол UPLC/HPLC grade производства J.Т. Baker (Avantor Performance Materials, Пало Альто, США), муравьиная кислота 98-100% производства Merck (Дармштадт, Германия).
Методика эксперимента: около 2,0 г (т.н.) измельченного сырья переносили в кругло-донную колбу на 100 мл, добавляли 50 мл 60% метанола. Экстракцию проводили на водяной бане с обратным холодильником при температуре 95С в течение 2 ч. Далее колбу с извлечением охлаждали до комнатной температуры и помещали на ультразвуковую ванну на 5 мин. Содержимое колбы фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили до метки 60% метанолом, аликвоту в 1,5 мл переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали при 15000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант помещали в виалу для авто-семплера. Исследования проводились с использованием системы ВЭЖХ Agilent 1100 (Agilent Technologies, США), оснащенной бинарным насосом, дегазатором, термостатируемым автосем-плером, термостатом колонок, ДМД спектрофотометрическим (Agilent 1100 Series Diode Array) и времяпролетным (TOF) МС-детектором (Agilent 6200 TOF LC/MS). Идентификацию и определение содержания БАВ проводили по методике, разработанной ранее [117]. Условия ВЭЖХ. Неподвижная фаза: колонка ProteCol C18 HPH125 2504.6 мм с размером частиц 5м. Подвижная фаза: А – 0,1% раствор муравьиной кислоты, В – ацетонитрил. Градиентное элюирование 0-40 мин, 10-60% В, затем регенерация колонки 41-50 мин, 10% В. Температура колонки 30 С, температура автосемплера 20 С, скорость подачи элюента 0,5 мл/мин, объем вводимой пробы 10 л. ДМД спектрофотометрическое детектирование проводилось при 5 аналитических длинах волн: 370 нм, 350 нм, 338 нм, 330 нм и 290 нм. Условия масс-детектирования. Ионизация электроспреем, сканирование масс – в режиме регистрации положительных ионов (ESI-MS+) в диапазоне m/z 100-1000 Да. Рабочие параметры источника ионизации: напряжение на капилляре 3500 В, поток газа-осушителя (азот) 9 л/мин, температура 325 С, давление на распылителе 0,27 МПа. Напряжение на фрагменторе 175 В, на конусе – 65 В, на октополе OCT 1RF Vpp – 250 В. Обработка данных осуществлялась с помощью программного обеспечения Agilent MassHunter Workstation Software.
Определение тяжелых металлов и мышьяка в ЛРС и масляных экстрактах на его основе
Для обнаружения пятен ретинола ацетата (ФС 42-7811-97) [352], выбранного в качестве стандартного образца при разработке методики, были использованы реагенты, предложенные в литературе [90,91,132,374]. Обработка пластин конц. серной кислотой дает темно-фиолетовые зоны на белом фоне, разв. серной кислотой – синие пятна на белом фоне, 5% спиртовым раствором ФМК и 10 % спиртовым раствором ФМК с добавлением конц. хлористоводородной кислоты (25:1) – темно-синие пятна на желто-зеленом фоне и 70 % хлорной кислотой - фиолетовые пятна на белом фоне. В литературе часто рекомендуется для этой цели использовать труднодосту-пеный и весьма токсиченый хлороформный раствор хлорида сурьмы (III или V). Детектирование пятен проводят также путем просмотра пластин в УФ-свете. Наблюдаются темные зоны витамина А на светлом флуоресцирующем фоне [289]. Детектирующим реагентом, отвечающим всем требованиям, является 10 % спиртовый раствор ФМК с добавлением концентрированной хлористоводородной кислоты. Нами также было установлено, что предел обнаружения с помощью выбранного детектирующего агента составил 110-7 г (0,1 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл). В элюентах, представленных в таблице 38, хроматографировали пробы раствора ретинола ацетата объемом 0,5 мкл с содержанием 1 мг/мл.
В литературе в качестве элюентов чаще всего предлагаются такие однокомпонентные системы как: бензол, хлороформ, гексан, циклогексан, толуол, ксилол, метанол и другие [132,374]. В эксперименте изучено десять различных хроматограческих систем со значениями полярности от 0 до 2,20 ед. (таблица 38).
Наилучшее качество хроматографических зон и оптимальные величины Rf [39] получены в системах № 8 и 9. Изменение в бикомпонентных подвижных фазах № 1-3, 6-9 (таблица 38) процентного содержания хлороформа и гексана позволило получить кривые зависимости величины Rf от объемной доли каждого растворителя в элюенте (рис. 12 а и б).
Полученные графики показали, что зоны витамина А на хроматограммах могут достигать оптимальных значений Rf [39] при содержании хлороформа и гексана в системе от 20 до 30 и от 70 до 80% соответственно. По экспериментальным данным построена кривая зависимости величины Rf витамина А (рис. 13) от Р системы.
Взаимосвязь относительной скорости перемещения ретинола ацетата от содержания хлороформа (а) и гексана (б) в системе (сорбент – силикагель)
Увеличение полярности системы от 0 до 1,5 ед. и более (рис. 13) приводит к тому, что значение величины Rf зон ретинола ацетата на хроматограммах теряет зависимость от Р элюен-та. Определяемый компонент при этом не сорбируется силикагелем (Rf 1).
Детальное исследование влияния Р системы в диапазоне от 0,1 до 1,5 ед. на значения Rf, позволило установить тот интервал значений Р элюента, при котором выявленная зависимость преобретает линейный характер (от 0,2 до 1,1 ед. полярности) (рис. 14).
С помощью установленной зависимости возможно комбинировать различные растворители при составлении системы для определения витамина А в тонком слое, таким образом, что 0,8
Совокупности полученных экспериментальных данных позволила подобрать оптимальные условия хроматографического определения витамина А: сорбент – пластинки силикагелевые марки «Sorbfil» (ПТСХ-А) с полимерной подложкой размером 10 х10 см; возможные элюенты – гек-сан:хлороформ (5:1), (4:1), (3:1); объем пробы – 0,5 мкл 1 г/мл раствора; детектирование зон – 10% спиртовый раствор ФМК с добавлением конц. хлористоводородной кислоты; время насыщения хроматографической камеры парами элюента – 20 мин; время развития хроматограммы – 25 мин; время термостатирования при t = 50 – 60 С - 5 – 7 мин.
На хроматографическую пластинку марки «Sorbfil» размером 1010 см наносили пробу спиртового раствора объемом 10 мкл с содержанием -токоферола (чистота 97 %, «ICN Biomed-ical», США) 3 мг/мл. Для детекции зон токоферолов на хроматограммах были использованы реагенты, приведенные в таблице 39 [174,238,364,365].
Как известно, ФМК является неспецифичным проявителем. Раствор гексацианоферрата калия (III), по нашим данным, не обладает требуемой чувствительностью. Использование серебра нитрата для обработки пластин экономически нецелесообразно, ввиду его высокой рыночной стоимости. Впервые выбрана в качестве проявителя конц. азотная кислота, образующая с -токоферолом о-токоферилхинон, окрашенный в оранжево-красный цвет. Данная реакция рекомендована ГФ [90-92] для установления подлинности ацетета токоферола. Интенсивности окраски хроматограммы, обра 91 ботанных этим реагентом, не изменяется со времени. Предел обнаружения с помощью выбранного детектирующего реагента, как установлено, составляет 3 мкг в зоне [238,365].
Определяющее влияние на поведение веществ в тонком слое сорбента оказывает растворитель. Исследованы системы, описанные в литературе [174,290, 364], а также новая однокомпонентная хроматографическая система – хлороформ [365]. Параметры, демонстрирующие эффективность хроматографического определения -токоферола в различных элюирующих системах представлены в таблице 40.
Из данных таблицы 40 следует, что наибольшая эффективность хроматографического процесса, по данным рассчета величин N, достигаются в системах № 2, 3 и 7. Оптимальные величины Rf [39] -токоферола наблюдаются в системах № 4,7 и 8.
Несмотря на то, что величины N в системах № 2, 3 и 7 имеют более высокие значения, чем в системах № 4 и 8, обработка их затруднена, так как качество хроматографических зон значительно хуже. В однокомпонентной системе № 4 было достигнуто наилучшее качество зон округлой форму на хроматограммах [365], что свидетельствует о линейной изотерме сорбции -токоферола в данных условиях [39]. Кроме того, трихлорметан как элюент является легкодоступным, дешевым и относительно малотоксичным.
Оптимальными условиями хроматографирования, по совокупности полученных результатов, были выбраны следующие: сорбент – пластинки силикагелевые марки «Sorbfil» размером 10х10 см с полимерной подложкой; объем пробы – 10 мкл 0,3% спиртового раствора -токоферола; элюент – хлороформ; обработка хроматограмм – конц. азотная кислота; время насыщения камеры парами элюента – 20 мин; время развития хроматограмм – 25 мин; время термостатирования при t 80 С - 5 – 7 мин; предел обнаружения – 3 мкг в зоне.
Количественное определение токоферолов методом тонкослойной хроматографии
В условиях, представленных выше, получены калибровочные хроматограммы с серией стандартных растворов -токоферола (рис. 15). Пластины обрабатывают детектирующим реагентом, сушат, а затем сканируют с помощью планшетного сканера. Изображения хроматограмм в формате bmp (рис. 15) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer», принцип работы которой состоит в оценке размера и интенсивности окраски зон на хроматограммах по отношению к фону.
Разработка методик идентификации и количественного определения антоциановых соединений в плодах облепихи крушиновидной
Содержание массовой доли липофильных групп БАВ в плодах практически на порядок выше по сравнению с листьями, а, следовательно, в ФС на подобное ЛРС требуется включение такого показателя качества «Наличие микотоксинов», а также разработка новой ОФС «Определение микотоксинов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах». Данные таблицы 82 свидетельствуют также о том, что лишь незначительная доля БАВ данного ЛРС способна экстрагироваться в МЭ. Доминирующими БАВ в МЭ листьев крапивы двудомной будут БАВ, содержащие в жирных маслах-экстрагентах, используемых в производстве МЭ фармацевтического назначения. Такие «минорные» БАВ и их содержание могут быть маркерами для оценки подлинности МЭ, а также должны быть использованы при разработке ФС в разделе «Количественное определение».
Отсутствие четких критериев и методов оценки ЛРП привело к тому, что из одного вида сырья в настоящее время производят и ЛП, и БАД к пище. В соответствии с подходом к докли ническому изучению ЛС, разрабатываемых из природного сырья, уровень безопасности препарата природного происхождения прямо зависит от уровня его стандартизации [38]. Несмотря на то, что с каждым годом доля культивируемого ЛРС растет, она все еще не превышает 50% от заготавливаемого [23,24]. Вероятность сбора ЛРС населением вблизи источников выброса пол-лютантов остается еще существенной. Руководящим принципом оценки качества в отношении безопасности ЛРС является нормирование содержания контаминантов и остаточных загрязнителей, в том числе тяжелых металлов (ТМ), мышьяка [177,342], радионуклидов (РН), остаточных пестицидов (ОП) [38,163,268, 345] и др. Отечественными учеными подробно исследованы процессы перехода экотоксикантов (ЭТ) в водно-спиртовые извлечения из ЛРС [345]. Безопасность применения жирных РМ и МЭ в настоящее время оцениваются только по содержанию ТМ. Однако, миграция ЭТ из ЛРС в МЭ не изучена, тогда как ОП, обладающие высокой способностью растворяться в жирах, способны попадать в готовый МЭ. В связи с этим требуется включение дополнительных критериев качества РМ и МЭ при переработке существующих ОФС и разработке новых ФС. Кроме того возможность присутствия различных ЭТ в МЭ обусловлена использованием масел-экстрагентов, ненормируемых по содержанию поллютантов, что требует разработки ФС на жирные масла, традиционно используемые в технологии производства МЭ из ЛРС (рафинированные подсолнечное, оливковое, соевое и др. масла невысыхающего и полувысыхающего типа).
Актуальность оценки содержания ТМ в ЛП обусловлена возможностью кумуляции некоторых элементов, потенциальной генотоксичностью и канцерогенностью различных солей металлов, а также более высокой чувствительностью детей к токсическому действию металлов (отмечено влияние ТМ на нервную систему) [149,216].
В настоящее время существует ОФС в ГФ РФ XIII «Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах», в соответствии с которым определение примесей ТМ (свинца, кадмия, ртути) и мышьяка в ЛРС проводят методом атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС). Согласно ОФС «Масла жирные растительные» [93], вновь разработанной для ГФ XIII изд., нормированию в РМ стали подвергаются многие показатели качества (исследование на ТМ, показатели чистоты, в т.ч. и микробиологическая чистота). МЭ отнесены к БАД, однако применяются не только в косметических, профилактических, но и в лечебных целях. Отсутствует также информация о возможности миграции ТМ в масляные извлечения из ЛРС. Поэтому исследования, направленные на оценку безопасности ЛРС и МЭ, полученных на его основе, являются весьма актуальными.
Подготовку образцов и определение ТМ, а также мышьяка проводили как описано в Главе 2 (п. 2.4). Согласно НД в настоящее время обязательному нормированию в ЛРС и полученных на его основе РМ и МЭ подлежат 4 элемента (кадмий, свинец, ртуть и мышьяк). В РМ и МЭ в соответствии с различными ГОСТ и ТУ дополнительно определяют железо и медь [44,45,48,52,55,66,71,79,81]. Результаты определения содержания ТМ в исследуемых объектах приведены в таблице 83.
Для определения соответствия ЛРС и МЭ на его основе (в том числе облепихово-го масла) по уровням содержания ТМ рекомендуется использовать нормативы СанПин 2.3.2.1078-01 [244] для БАД на растительной основе, которые взяты за основу и в ОФС ГФ XIII (табл. 84). Предельно допустимое содержание ТМ для МЭ фармацевтического назначения не разработаны. Для оценки их качества по показателю содержания ТМ могут быть использованы нормативы, рекомендованные для пищевых масел в ГОСТах, ТУ [44,45,48,52,55,66,71, 79,81] и СанПин 2.3.2.1078-01 [244] для РМ и БАД на основе РМ (табл. 84). Рекомендации ФАО/ВОЗ о допустимом еженедельном поступлении токсичных ТМ с пищей и другими источниками, а также оптимальные физиологические потребности ТМ для взрослого человека приведены в таблице 84.
Анализ данных таблиц 83 и 84, показывает, что все отобранные образцы ЛPC и МЭ на его основе соответствуют требованиям НД [308].
Нормирование ОП в ЛPC и ЛРП чрезвычайно важно с точки зрения безопасности пациентов [166]. Отечественными учеными разработана ОФС «Определение содержания пестицидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» для ГФ XIII [93]. Хлорированные углеводородные пестициды (ГХЦГ, ДДТ, гексахлоран, алдрин и др.) являются наиболее токсичными и устойчивыми из всех разработанных к настоящему времени средств защиты растений [23,24,166,273,345].
Ввиду того, что пестициды могут концентрироваться в процессе экстракции в связи с их высокой растворимостью в жирах, необходимо проводить определение содержания ОП и в сырье, и в РМ и МЭ, полученных на его основе. Подготовку и исследование образцов на присутствие РН и ОП осуществляли как описано в Главе 2 (п. 2.4). Результаты определения содержания ОП в исследуемых объектах приведены в таблице 85.
Для определения соответствия ЛРС по уровням содержания ОП рекомендуется использовать нормативы СанПин 2.3.2.1078-01 [244] для БАД на растительной основе, которые взяты за основу и в ОФС ГФ XIII. Предельно допустимое содержание ОП для МЭ фармацевтического назначения не разработаны. Для оценки их качества по данному показателю могут быть использованы нормативы, рекомендованные для пищевых масел в ГОСТах, ТУ [44,45,48,52,55,66,71,79,81] и СанПин 2.3.2.1078-01 [167,186,244] для РМ и БАД на основе РМ (таблица 86).