Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Механизмы развития острой гипоксии и пути её фармакологической коррекции 20
Глава 2. Материалы и методы исследования 53
2.1. Экспериментальные животные 53
2.2. Металлсодержащие антиоксиданты и лекарственные вещества сравнения 53
2.3. Моделирование острой экзогенной гипоксии 56
2.4. Методы исследования 64
Глава 3. Влияние исследованных веществ на продол жительность жизни мышей и резервное время при различных видах острой экзогенной гипоксии и ректальную температуру 81
Глава 4. Изучение фармакологических свойств наиболее активного металлсодержащего антиоксиданта - вещества teqi 104 112
Глава 5. Изучение влияния вещества tiqi 104 на процессы окисления и фосфорилирования в митохондриях клеток головного мозга 146
Глава 6. Изучение влияния вещества яф 104 на вызванные потенциалы и импульсную активность нейронов сома тосенсорной коры головного мозга 152
Обсуждение результатов 189
Выводы 250
Научно-практические рекомендации 252
Список литературы
- Механизмы развития острой гипоксии и пути её фармакологической коррекции
- Металлсодержащие антиоксиданты и лекарственные вещества сравнения
- Влияние исследованных веществ на продол жительность жизни мышей и резервное время при различных видах острой экзогенной гипоксии и ректальную температуру
- Изучение фармакологических свойств наиболее активного металлсодержащего антиоксиданта - вещества teqi 104
Введение к работе
Актуальность проблемы
Практическая медицина постоянно сталкивается с проблемой защиты организма от осложнений, вызываемых недостатком кислорода. Гипоксия является ключевым фактором в генезе больпшнства острых и хронических заболеваний [143, 293, 325]. В литературе содержится достаточно сведений, дающих представление о многочисленных способах адаптации организма человека к дефициту Ог-Тем не менее вопрос о механизмах формирования гипоксического состояния и последствиях, обусловленных эпизодами кислородной недостаточности, продолжает привлекать исследователей и мотивировать их на поиск эффективных средств, способных нейтрализовать последствия перенесённой гипоксии [23, 379, 537].
Как известно, провести чёткую границу между гипоксией физиологической, инициирующей компенсаторные реакции, и гипоксией, запускающей каскад патологических реакций, довольно трудно. Согласно известным концепциям, адаптационный процесс в ответ на воздействие экстремальных факторов проявляется в значительных перестройках морфофункциональных структур, обеспечивающих механизмы адекватного гомеостатического регулирования [3, 229, 346].
В современных производственных условиях человек рискует оказаться в сфере влияния разнообразных негативных факторов внешней среды, в ряду которых одно из первых мест отводится остроразвивающейся гипоксии [33, 249, 466, 553, 577].
Здоровый организм наиболее часто подвергается воздействию экзогенных форм острой гипоксии, которые как правило обусловлены уменьшением парциального давления Ог в окружающем воздухе или во вдыхаемой смеси газов [224, 447]. Экзогенная гипоксия может возникать, например при эксплуатации летательных аппаратов, подводных лодок, в случае отказа систем, обеспечивающих подачу или регенерацию воздуха обитаемых замкнутых пространств
10 [60, 248]. В связи с этим очевидна актуальность проблемы разработки комплекса мероприятий по профилактике гипоксии и лечению вызываемых ею осложнений.
Установлено, что организмы с высоким уровнем организации ЦНС острее реагируют на экстремальные воздействия, включая и гипоксию в сравнении с организмами, имеющими более низкий уровень организации ЦНС [109, 371, 448]. В частности, показано, что ЦНС человека в целом и прежде всего кора головного мозга обладают повышенной чувствительностью к недостатку 02 [25, 361, 547]. Есть данные о том, что в ходе развития острого гипоксического состояния нейроны коры реагируют даже на слабые колебания уровня 02 в межклеточной жидкости. В случае значительного снижения напряжения 02, в мозговой ткани возникают грубые и необратимые изменения [327, 344, 481, 588].
Как было отмечено во многих исследованиях, активация аппарата внешнего дыхания, увеличение количества эритроцитов в кровяном русле, сопровождающееся повышением кислородной ёмкости крови, увеличение минутного объёма кровотока в первую очередь направлены на усиление доставки 02 клеткам головного мозга [3, 77, 283, 335, 386, 427, 444, 487, 497, 520, 567, 576]. Такого рода реакции носят адаптивный характер и позволяют организму противостоять возникающим неблагоприятным условиям [36, 517, 586].
В последние годы было показано, что общая направленность процессов адаптации при развитии остро нарастающей гипоксии не исключает возможности возникновения параллельных негативных реакций [23, 86, 92, 166, 278, 574]. В связи с этим в качестве интегрального критерия адаптации организма к недостатку 02 чаще всего используется показатель выживаемости организма, находящегося в условиях развивающейся острой гипоксии [249,295, 396,413].
Многие авторы допускают, что перспективным способом увеличения выживаемости человека в условиях гипоксии экзогенной природы является ограничение уровня его физической активности, что гарантирует экономный расход доступного для дыхания 02 и наличного резерва субстратов биологического
окисления [92, 339, 556]. Как было установлено, снижение метаболических запросов организма также может быть обеспечено применением эффективных фармакологических веществ, относящихся к классу антигипоксантов [72, 267, 431].
На сегодняшний день арсенал антигипоксических веществ, которые могли бы быть использованы прежде всего в практике экстремальной медицины, невелик [180, 203, 277, 287]. Наиболее перспективной группой антигипоксантов заслуженно считают вещества метаболического типа действия, относящиеся преимущественно к производным аминотиолов — гутимин, амтизол, бемитил, алмид, этомерзол и др. [70, 143]. Перечисленные химические соединения предупреждают как нарушения энергетического обмена, так и последствия этих нарушений, повышая устойчивость клеточных элементов жизненно важных органов и организма в целом не только к недостатку 02, но также к некоторым другим воздействиям, нарушающим энергетический обмен в тканях [215, 300, 347]. Функциональный анализ активности данной группы противогипоксиче-ских веществ способствовал созданию современной методологии поиска высокоэффективных антигипоксантов [141, 216, 338].
С появлением в поле зрения исследователей новой группы химических веществ — металлсодержащих антиоксидантов, представляющих собой комплексные соединения биометаллов с природными антиоксидантами, открылись новые возможности для изыскания антигипоксических средств [260]. Высокая биологическая активность и биодоступность этих химических соединений в сочетании с полимодальностью их фармакологических эффектов были отмечены в публикациях многих авторов [15,200,246, 271, 328, 515, 516].
Впервые синтезированные Э.А. Парфёновым на базе НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра РАМН [261] вещества этой фармакологической группы, обозначенные лабораторным шифром «7iQ» и соответствующими порядковыми номе-
12 рами, оказались эффективными при развитии у животных различных видов острой экзогенной гипоксии [21, 200, 202].
Таким образом, проблема изыскания эффективных антигипоксических средств для осуществления профилактики и лечения последствий, вызванных экзогенными гипоксическими состояниями, может быть в значительной мере решена путём проведения комплексного физиологического исследования, ориентированного на ключевые звенья динамики формирования гипоксических состояний и их фармакологической коррекции металлсодержащими антиоксидантами.
Цель исследования
Изучить механизмы изменений состояния основных функциональных систем организма (кровообращения, дыхательной, нервной) при развитии острой экзогенной гипоксии и выявить высокоэффективные антигипоксанты среди новых металлсодержащих антиоксидантов на различных моделях острой экзогенной гипоксии.
Задачи исследования:
Изучить динамику изменений ЭКГ и внешнего дыхания мышей при развитии острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной гипоксии без гиперкапнии.
Изучить динамику изменений корковых вызванных потенциалов и импульсной активности нейронов соматосенсорнои коры головного мозга кошек при развитии острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной гипоксии без гиперкапнии в условиях мониторинга ЭКГ.
Изучить влияние 9 новых металлсодержащих антиоксидантов на продолжительность жизни мышей в условиях острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией, острой экзогенной нормобарической гипоксии без
13 гиперкапнии и резервное время мышей в условиях острой экзогенной гипоба-рической гипоксии.
4. Провести сравнительный анализ антигипоксической активности веществ
в ряду исследованных химических соединений, а также сопоставить их антиги-
поксическую эффективность с таковой веществ сравнения - антигипоксантов
мексидола, амтизола и бемитила.
5. Установить величины средней летальной и средней эффективной доз
для наиболее активных металлсодержащих антиоксидантов.
Изучить влияние наиболее активных металлсодержащих антиоксидантов и наиболее эффективных веществ сравнения на характеристики условнореф-лекторной деятельности мышей, ЭКГ и внешнего дыхания у мышей, помещённых в условия острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии, а также на параметры их стандартного энергетического обмена.
Изучить влияние наиболее активных металлсодержащих антиоксидантов на процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях клеток головного мозга крыс.
Изучить влияние наиболее активных металлсодержащих антиоксидантов на параметры корковых вызванных потенциалов, импульсной активности нейронов соматосенсорной коры головного мозга кошек, подвергнутых воздействию периодической дыхательной асфиксии, а также помещённых в условия острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии.
Научная новизна
Впервые проведён системный анализ формирующегося экзогенного гипок-сического состояния по характеристикам изменений ЭКГ, внешнего дыхания, корковых вызванных потенциалов, импульсной активности отдельных нейронов соматосенсорной коры в зависимости от наличия или отсутствия фактора гиперкапнии. Изучено влияние 9 оригинальных новых металлсодержащих ан-
14 тиоксидантов на резистентность мышей к условиям трёх моделей острой экзогенной гипоксии. Установлено, что химические соединения 7rQ901, ttQ1104 на всех использованных в скрининге моделях гипоксии обладают выраженной ан-тигипоксической активностью, превышающей таковую мексидола, бемитила, но сопоставимой с активностью амтизола. Подтверждена низкая токсичность вещества 7iQ1104. На модели избегательного оборонительного условного рефлекса обнаружено обратимое негативное влияние вещества 7TQ1104 и антигипоксанта амтизола на моторные реакции мышей. В ходе анализа ЭКГ и пнев-мобарограмм мышей доказано, что вещество ttQ 1104 в условиях нормобариче-ских видов острой экзогенной гипоксии продлевает период относительного благополучия в большей степени, чем антигипоксант амтизол при использовании данных веществ в равных дозах. Проведено измерение стандартного энергетического обмена у мышей на фоне действия цинксодержащего антиоксидан-та TtQl 104 и антигипоксанта амтизола. Установлено, что вещество 7tQl 104 в большей мере снижает величину энергетического обмена, чем амтизол. Установлено, что вещество tcQ 1104 существенно ограничивает возможности митохондрий головного мозга в отношении синтеза АТФ на фоне достаточного уровня сопряжения процессов окисления и фосфорилирования, а также сохранения энергетического потенциала ткани. Впервые в качестве индикатора глубины экзогенного гипоксического состояния были использованы вызванные потенциалы коры головного мозга. По данным регистрации активности нейронов соматосенсорной коры установлено, что введение вещества nQl 104 значительно повышает резистентность нервных клеток к острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной гипоксии без гиперкапнии.
Научно-практическая значимость
Связана с разработкой новых методов моделирования острых экзогенных гипоксических состояний у животных, оценкой состояния основных функциональных систем организма (кровообращения, дыхательной, нервной) при раз-
15 витии острой экзогенной гипоксии и выявлением высокоэффективных антиги-поксантов среди новых металлсодержащих антиоксидантов на различных моделях острой экзогенной гипоксии. К методам моделирования острых экзогенных гипоксических состояний у животных отнесены острая экзогенная нормо-барическая гипоксия с гиперкапнией (кошка, кролик) и острая экзогенная нор-мобарическая гипоксия без гиперкапнии (мелкие лабораторные животные). Оригинальность и новизна выполненных физиологических исследований, а также сведения, полученные в ходе изучения нового антигипоксанта под шифром 7CQ1104 (бис (N-ацетил-Ь-цистеинато) цинк(И) сульфат октагидрат), подтверждены тремя патентами РФ на изобретение (патенты на изобретение РФ № 2265608 от 26.07.2004 г., № 2251158 от 27.04.2005 г. и № 2291498 от 10.01.2007 г.). На основе установленных механизмов развития острого гипок-сического состояния представляются реальными перспективы внедрения нового высокоактивного антигипоксанта 7tQ 1104 (бис (N-ацетил-Ь-цистеинато) цинк(П) сульфат октагидрат) в клиническую практику.
По итогам исследования выдвинута гипотеза, согласно которой точкой приложения антигипоксического действия цинксодержащего антиоксиданта 7TQ1104 является цитохромный фрагмент в составе дыхательной цепи митохондрий. Предполагается, что двухвалентный цинк, являющийся основой изученного комплексного соединения, ограничивает объёмы электронных потоков в области цитохромов на участке Ь-с. Указанный феномен обеспечивает повышение экономичности процессов окислительного фосфорилирования, предотвращая преждевременное истощение внутриклеточных резервов 02 и субстратов окисления.
Использование в работе комплексного подхода к изучению фармакологических свойств перспективных антигипоксантов при проведении опытов на животных с разным уровнем организации ЦНС (мыши, крысы, кошки) позволило экстраполировать полученные результаты на физиологические закономерности
функциональной активности соответствующих гомеостатических систем человека.
Работа поддержана грантом РФФИ № 07-04-96437, полученным в рамках регионального конкурса в 2007 г. Финансирование гранта осуществлялось из средств бюджета Смоленской области.
Основные положения, выносимые на защиту:
В ходе формирования у мышей и кошек состояний острой гипоксии с гиперкапнией и острой гипоксии без гиперкапнии динамика ЭКГ, показателей внешнего дыхания, корковых вызванных потенциалов и активности отдельных нейронов соматосенсорной коры демонстрируют большую устойчивость животных к гиперкапническим состояниям в сравнении с нормокапническими.
У трёх из девяти исследованных новых металлсодержащих антиокси-дантов — веществ ttQ262, 7iQ901, tcQ1104 - выявлена антигипоксическая активность на моделях острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией (ОГ+Гк), острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии (ОГ-Гк) и острой экзогенной гипоксии с гипобарией (ОГ+Гб).
По показателям средней летальной и средней эффективной доз, рассчитанных для вещества ttQI 104, данное химическое соединение может быть отнесено к категории относительно безопасных веществ.
Вещество TtQl 104 в опытах на мышах, подвергнутых воздействию ОГ+Гк и ОГ-Гк, в большей степени повышает устойчивость животных к указанным видам гипоксии, чем эталонный антигипоксант амтизол, в то время как в опытах на мышах, подвергнутых ОГ+Гб, их эффекты одинаковы.
Вещество 7iQ1104, как и антигипоксант амтизол, относится к противо-гипоксическим веществам метаболического типа действия, что подтверждено замедлением стандартного энергетического обмена у мышей на фоне их действия, а также общим снижением электрической активности миокарда и параметров внешнего дыхания.
Механизм действия вещества uQl 104 во многом обусловлен снижением интенсивности энергосинтетических процессов в митохондриальном компар-тменте клеток головного мозга. Вызываемое введением вещества TtQl 104 уменьшение скоростей протекания окислительных реакций в дыхательной цепи митохондрий может обеспечить оптимизацию расхода кислорода и субстратов биологического окисления при острых экзогенных гипоксических состояниях.
В условиях периодической дыхательной асфиксии, при острой гипоксии с гиперкапнией и острой гипоксии без гиперкапнии профилактическое введение вещества 7EQ1104 кошкам способствует значительному пролонгированию активного состояния коры головного мозга, что подтверждается динамикой вызванных потенциалов, а также импульсной активности нейронов соматосенсор-ной коры.
Реализация результатов работы
Полученные результаты используются в учебном процессе кафедры фармакологии Санкт-Петербургской Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова (акт внедрения от 13.04.2007 г.), в лекционных курсах кафедры фармакологии и кафедры нормальной физиологии Смоленской государственной медицинской академии, в научной работе ЦНИЛ Смоленской государственной медицинской академии (акт внедрения от 11.06.2007 г.). Диссертационная работа выполнена на кафедре нормальной физиологии СГМА (заведующий - доктор медицинских наук профессор В.А. Правдивцев) в рамках плановой темы НИР, № государственной регистрации 01200409026 (протокол №7 от 1.06.2004 г.). Исследования выполнены в рамках договора о совместной научно-практической деятельности между НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Бло-хина РАМН и Смоленской государственной академией «Синтез и изучение фармакологической активности новых физиологически совместимых антиокси-дантов».
Апробация и публикация материалов исследования
Результаты и основные положения диссертации доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Загрязнение окружающей среды и здоровье населения» (Смоленск, 1999), научной конференции «Медико-биологические аспекты экстремальных состояний» (Смоленск, 1999), областной научно-практической конференции «Проблемы охраны труда в условиях рыночной экономики и пути их решения» (Смоленск, 2002), Всероссийской научной конференции с международным участием «Современные информационные технологии в медицине и экологии» - ИТМЭ-2003» (Смоленск, 2003), 2-й Международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Смоленск, 2004), XIX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова «От геномики до интегративной физиологии» (Екатеринбург, 2004), 11-й Международной конференции «Новые медицинские технологии и квантовая медицина» (Москва, 2005), 6-й Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2005), Межрегиональной научно-практической конференции «Типовые патологические процессы» (Уфа, 2005). 4-й Российской конференции «Гипоксия: механизмы адаптации, коррекция» (Москва, 2005), 6-й научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной медицины» (Смоленск, 2007), XX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), проблемной комиссии Смоленской государственной медицинской академии «Физиология и патология нервной системы» (Смоленск, 2004, 2007), ежегодных итоговых заседаниях Смоленского отделения физиологического общества (Смоленск, 2005-2007).
Апробация диссертации состоялась 24 мая 2007 г. на совместном заседании кафедр нормальной физиологии, фармакологии, клинической фармакологии, неврологии и нейрохирургии, неврологии и психиатрии ФПК, патологиче-
19 ской физиологии, общей химии, общей гигиены, медбиофизики Смоленской государственной медицинской академии.
По теме диссертации опубликовано 48 печатных работ, из них 8 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 1 монография, 3 патента на изобретения. Зарегистрировано 5 рационализаторских предложений.
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 4 главы собственных экспериментальных исследований, обсуждение результатов, выводы, научно-практические рекомендации и список литературы. Работа изложена на 311 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 53 рисунка. Библиографический указатель содержит 588 наименований, в том числе 352 отечественных и 236 иностранных.
Механизмы развития острой гипоксии и пути её фармакологической коррекции
В настоящее время считается признанным факт главенствующей роли гипоксии в возникновении и развитии многих патологических состояний, поскольку почти все они прямо или косвенно связаны с нарушением кислородного бюджета организма [6, 92, 164, 275, 356, 393, 485, 556].
Термин «гипоксия» происходит от греческого hypo - ниже и латинского oxygenium - кислород (Ог) и означает понижение напряжения 02 в тканях. При этом иногда выделяют гипоксемию - понижение напряжения 02 в крови, анок-сию - отсутствие 02 в тканях, а также аноксемию - отсутствие 02 в крови. Указанные состояния могут наблюдаться в условиях нарушения обеспечения организма кислородом и отражают степень кислородного голодания. Учитывая, что истинной аноксии и аноксемии практически не наблюдается, термином «гипоксия» принято обозначить все варианты кислородной недостаточности в организме [92, 249,413, 422, 509]. Гипоксию следует отличать от ишемии. При ишемии первично наблюдается снижение в тканях величины объемного кровотока, что закономерно сопровождается уменьшением напряжения 02 [65, 408, 475, 493]. В отличие от гипоксии, при развитии которой синтез АТФ снижается постепенно в результате уменьшения напряжения Ог в тканях, при ишемии недостаточность синтеза АТФ развивается остро и является, в основном, результатом уменьшения поступления в ткани глюкозы. Неслучайно при развитии ишемии повреждение тканей развивается быстрее, чем при гипоксии [64, 510, 518,529].
Следует отметить, что гипоксия не всегда должна рассматриваться исключительно как патологический феномен. В повседневной деятельности человек ежедневно испытывает на себе воздействие так называемой физиологической гипоксии. Физиологическая гипоксия может формироваться, например в скелетной мускулатуре при интенсивной мышечной работе [194, 411], в мозго вой ткани при значительном умственном напряжении [174, 464], а также в печени, почках, органах желудочно-кишечного тракта при чрезмерном усилении их физиологической активности [35, 39, 199]. Интересно отметить, что периодически возникающая в различных тканях организма физиологическая гипоксия зачастую выступает в качестве натурального раздражителя, активирующего разномодальные реакции, в том числе рефлекторные, существенно изменяющие активность органов-мишеней и организма в целом.
В отличие от гипоксии патологической, при физиологической гипоксии изменения активности органов и тканей носят кратковременный, обратимый характер. При этом период восстановления как правило протекает на фоне усиления аэробной составляющей энергетического обмена [208].
Многообразие проявлений гипоксических состояний в сочетании с большим количеством факторов, определяющих динамику их развития, настоятельно требовали от исследователей уточнения специфических особенностей различных видов гипоксии. В первую очередь представлялось необходимым осуществить разграничение гипоксических состояний по этиологическому и патогенетическому показателям. Неслучайно в ходе комплексного изучения проблемы постоянно предлагались многочисленные классификации гипоксии.
Отметим, что номенклатурный подход к проблеме гипоксии во многом диктовался потребностями изыскания методов коррекции строго определенных гипоксических состояний, формирующихся исключительно у человека находящегося в конкретной производственной среде обитания.
Наиболее широкое распространение в последние годы получила классификация гипоксии Н. А. Агаджаняна и А. Я. Чижова [8]. Предложенная авторами классификация базируется на фундаментальных исследованиях в области фи 22 зиологии гипоксических состояний, проведенных как отечественными, так и зарубежными исследователями [164, 177, 556, 566].
Согласно классификации Н. А. Агаджаняна и А. Я. Чижова различают 3 основных вида гипоксии: гипоксия экзогенная (I); гипоксия эндогенная (II); гипоксия биоэнергетическая или тканевая (III). I. Экзогенная гипоксия формируется в результате воздействия на организм различных факторов внешней среды. Разновидностями экзогенной гипоксии являются: экзогенная гипоксическая гипоксия (А); экзогенная гипероксическая гипоксия (Б); экзогенная экологическая гипоксия (В). А. Экзогенная гипоксическая гипоксия - развивается при уменьшении содержания Ог в окружающей среде, при затруднении поступления Ог в лёгкие, а также при нарушении альвеолярной вентиляции. Вариантами экзогенной ги-поксической гипоксии выступают: экзогенная гипоксическая нормобарическая гипоксия, развивающаяся при вдыхании газовых смесей с пониженным содержанием Ог при сохранении нормальной величины барометрического давления; экзогенная гипоксическая гипобарическая гипоксия, в частности: 1) барокамер-ная гипоксия, развивающаяся при «подъеме» в барокамере на высоту порядка 2 500 м и более в результате разряжения атмосферного воздуха и снижения в нём парциального давления Ої, 2) высотная гипоксия, возникающая при подъёме на высоту в летательных аппаратах без должной герметичности кабин, а также при отсутствии у членов экипажа специального кислородного оборудования; 3) экзогенная гипоксическая гипербарическая гипоксия - гипоксия, иногда развивающаяся при длительных глубоководных погружениях. Б. Экзогенная гипероксическая гипоксия. Экзогенная гипероксическая гипоксия подразделяется на 2 варианта: 1) гипербарическую гипоксию, формирующуюся после продолжительного вдыхания чистого Ог в условиях повышенного барометрического давления (например, при гипербарической оксиге-нации); и 2) гипобарическую гипоксию, которая может возникать у людей, находящихся в обитаемых отсеках космических станций, подводных лодок при снижении барометрического давления воздуха в условиях поддержания высокого процентного содержание в нём Ог В. Экзогенная экологическая гипоксия. Вариантами экологической гипоксии являются: 1) горная гипоксия или «горная болезнь», которая встречается в условиях среднегорья и высокогорья при снижении барометрического давления и сопряжённого снижения парциального давления Ог во вдыхаемом воздухе; 2) гравитационная гипоксия - отмечается в процессе развития невесомости; 3) полярная гипоксия — иногда развивается у людей в регионах, прилегающих к полюсам земного шара, что связано с уменьшением здесь плотности атмосферы; 4) аридная гипоксия - гипоксия в условиях засушливого (аридного) климата пустынь как следствие повышенной температуры окружающего воздуха, способствующей развитию гипертермии, гиповолемии, приводящих к ухудшению транспорта газов кровью; 5) антропогенная гипоксия - иногда наблюдается в условиях некоторых видов экологических катастроф. II. Эндогенная гипоксия развивается при нарушении доставки и утилизации 02 тканями организма. В зависимости от функционального состояния организма, вариантами эндогенной гипоксии являются: эндогенная физиологическая гипоксия (А); эндогенная респираторная гипоксия (Б); эндогенная гемиче-ская гипоксия (В); эндогенная циркуляторная гипоксия (Г); эндогенная цито-токсическая гипоксия (Д); эндогенная гиперметаболическая гипоксия (Е).
Металлсодержащие антиоксиданты и лекарственные вещества сравнения
В соответствии с целью и задачами исследования опыты выполнены на 1080 мышах-самцах линии CBF1 массой 20-25 г, на 32 крысах-самцах линии Wistar массой 170-220 г и 104 кошках-самцах массой 3,5-4,5 кг. Исследования проводились в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.). Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном световом режиме, свободном доступе к лабораторному корму и воде. В контрольные и опытные группы отбирали животных одинаковой массы. Каждая экспериментальная группа включала не менее 7 животных.
Для упрощения обозначения каждому изучавшемуся веществу был присвоен лабораторный шифр: 7tQ262, TUQ901, TIQ914, TTQ915, uQ918, TIQ1104, TIQ1105, 71QIIO8,7iQH09. Перечисленные комплексные химические соединения впервые синтезированы в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина и были любезно предоставлены нам для исследования д. х. н. Э. А. Парфёновым. Все исследованные металлсодержащие антиоксиданты являлись порошкообразными веществами. Структурные характеристики веществ и их отношение к классу металлсодержащих антиоксидантов представлены в табл. 1. Таблица 1 Исследованные металлсодержащие антиоксиданты Шифр вещества Класс металлсодержащего антиоксиданта Структурная характеристика 1 2 3 7tQ262 Модель супероксиддисмутазы Комплексное соединение меди с никотиновой кислотой 7iQ901 Модель цинксодержащих ферментов Комплексное соединение цинка с N-ацетил-L-цистеином 7iQ914 Модифицированный ионом тита-Ha(IV) ароматический кумариновый редуктон Комплексное соединение титана с пирокате-хиновым кумарином 7iQ915 Модифицированный ионом тита-Ha(IV) ароматический кумариновый редуктон Аналог TCQ9 14 7iQ918 Модифицированный аскорбат Комплексное соединение титана с аскорба-том 7iQ1104 Модель цинксодержащих ферментов Аналог 7iQ901 TIQ1105 Модель цинксодержащих ферментов Аналог 7iQ901 Окончание табл. 1 2 3 7iQ1108 Модель цинксодержащих ферментов Комплексное соединение цинка с N-ацетил-L-цистеином и никотиновой кислотой 7tQ1109 Модель цинксодержащих ферментов Аналог 7tQ 1108 Лекарственные вещества сравнения В качестве веществ сравнения были использованы такие известные анти-гипоксанты, как мексидол, амтизол и бемитил [143]. Подробная информация о спектрах и механизмах действия антигипоксических веществ представлена в главе «Обзор литературы».
Исследовавшиеся вещества и лекарственные средства сравнения всем видам экспериментальных животных вводили профилактически, однократно внутрибрюшинно, предварительно растворив субстанцию в физиологическом растворе хлорида натрия. В случае недостаточной растворимости веществ их введение осуществляли в виде мелкодисперсной суспензии, приготовленной путём добавления к растворителю твина-80. Животным контрольных групп, используя те же правила, вводили равный объём физиологического раствора или его взвесь с твином-80.
При проведении скрининга вещества вводили за 60 мин до начала опыта (период инкубации) в дозах 10; 25 и 50 мг/кг. В ходе углублённых исследований использовали дозы, оказавшиеся по результатам предварительных испытаний наиболее эффективными. В этих опытах период инкубации для мышей и крыс составлял 60 мин, для кошек - 90 мин.
В работе были использованы как общеизвестные способы моделирования острой экзогенной гипоксии, так и собственные оригинальные модели, подтверждённые авторскими свидетельствами на изобретения и рационализаторскими предложениями.
Для проведения скрининга металлсодержащих антиоксидантов на мышах руководствовались «Методическими рекомендациями по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве ан-тигипоксических средств» ФК МЗ СССР под ред. Л. Д. Лукьяновой (1990). Были выбраны две модели острой экзогенной гипоксии: 1) острая экзогенная нормобарическая гипоксия с гиперкапнией; 2) острая экзогенная гипобарическая гипоксия. С целью исключения влияния на развитие острой экзогенной гипоксии у мышей таких значимых факторов как гиперкапния и гипобария нами был специально разработан новый способ моделирования экзогенной гипоксии - «Острая экзогенная нормобарическая гипоксия без гиперкапнии», исключающий присутствие обоих названных факторов. Для углублённого изучения фармакологических эффектов перспективных антигипоксантов требовалось проведение комплексных исследований на животных с более высоким уровнем организации ЦНС (кошка), чем у мелких лабораторных животных (мышь). В связи с этим нами были предложены и внедрены новые способы моделирования состояния острой экзогенной гипоксии у кошек: 1) острая экзогенная нормобарическая гипоксия с гиперкапнией; 2) острая экзогенная нормобарическая гипоксия без гиперкапнии. Оба способа обеспечивали возможность выполнения в ходе эксперимента всех необходимых манипуляций. Все опыты, в которых осуществляли моделирование перечисленных выше видов гипоксии, были выполнены при температуре окружающего воздуха в пределах 20-22С.
Острую экзогенную нормобарическую гипоксию с гиперкапнией (ОГ+Гк) в опытах на мышах воспроизводили путём помещения животных в герметичные стеклянные ёмкости, в наших опытах - аптечные штанглазы объёмом 0,25 л, оснащёнными резиновыми пробками (рис. 1). За 60 мин до помещения экспериментальных животных в условия ОГ+Гк, исследованные вещества вводили однократно, внутрибрюшинно. Контрольным животным вводили аналогичный объём растворителя. Период от момента выполнения инъекции до момента герметизации штанглаза рассматривали как период инкубации. В дальнейшем регистрировали продолжительность жизни мышей, которую выражали в минутах. Гибель животных фиксировали в момент полной остановки дыхания [232]. 2.3.2. Острая экзогенная нормобарическая гипоксия без гиперкапнии у мышей Состояние острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии (ОГ-Гк) у мышей моделировали по авторскому способу путём помещения животных в аптечные штанглазы объёмом 0,25 л, содержащие по 20 г натронной извести (поглотитель СОг), предварительно прокалённой на электрической плитке и остуженной до комнатной температуры .
Влияние исследованных веществ на продол жительность жизни мышей и резервное время при различных видах острой экзогенной гипоксии и ректальную температуру
В ходе представленного блока исследований был изучено влияние 9 новых веществ из категории металлсодержащих антиоксидантов на продолжительность жизни мышей и резервное время в условиях острой экзогенной нормоба-рической гипоксии с гиперкапнией, острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии и острой экзогенной гипобарической гипоксии. Оценку антигипоксической активности металлсодержащих антиоксидантов проводили в спектре доз 10, 25, 50 мг/кг. Основанием для выбранного диапазона доз послужили данные других авторов о выраженности защитного эффекта веществ относящихся к категории металлсодержащих антиоксидантов при развитии острой экзогенной гипоксии [21, 200, 202]. До момента введения исследуемых веществ и непосредственно перед помещением животных в условия гипоксии проводили измерение ректальной температуры. В дальнейшем антигипоксические эффекты изучавшихся химических соединений оценивали по результатам их влияния на продолжительность жизни животных или на резервное время в условиях различных вариантов острой экзогенной гипоксии и сравнивали с эффективностью эталонных веществ (вещества сравнения) в аналогичных условиях. В качестве веществ сравнения использовали 3 известных химических соединения с установленным антигипоксическим действием: мексидол, амтизол и бемитил. Было установлено, что в условиях ОГ+Гк продолжительность жизни мышей контрольных групп в среднем составила 33 мин. Вещество под шифром 7iQ262 было эффективно во всех трёх изучавшихся дозах — 10, 25 и 50 мг/кг. В дозе 10 мг/кг данное медьсодержащее химическое соединение увеличивало продолжительность жизни мышей на 36%, в дозе 25 мг/кг - на 55%, а в дозе 50 мг/кг - на 104% в сравнении с контролем. Однако после введения вещества 7tQ262 в дозе 50 мг/кг у 2 животных наблюдали токсический эффект, результатом которого явилась их гибель в течение периода инкубации.
После введения вещества 7iQ901 было отмечено его статистически значимое положительное влияние на продолжительность жизни животных во всех применённых дозах. На фоне действия указанного цинксодержащего антиокси-данта применённого в дозе 10 мг/кг показатель увеличивался на 29%. В дозе 25 мг/кг соединение увеличивало продолжительность жизни на 72%, а в дозе 50 мг/кг - на 426% в сравнении с группой контроля. Введение вещества 7iQ901 в дозе 50 мг/кг в некоторых случаях также сопровождалось токсическим действием — 3 мыши погибли в течение периода инкубации.
Титансодержащее вещество под шифром 7iQ914 в дозах 10 и 25 мг/кг не проявило защитного эффекта при ОГ+Гк, однако в дозе 50 мг/кг способствовало увеличению продолжительности жизни мышей на 40% относительно контрольных цифр. Вещество 7tQ915 — комплексное соединение титана близкое по строению веществу 7UQ914 в дозах 10 и 50 мг/кг не обеспечивало достоверного увеличения продолжительности жизни животных в условиях опыта. Однако при его использовании в дозе 25 мг/кг отмечали прирост показателя на 23% в сравнении с группой контроля.
Комплексное соединение титана с аскорбатом вещество 7rQ918 в дозе 10 мг/кг не влияло на продолжительность жизни животных в условиях ОГ+Гк. После введения данного металлсодержащего антиоксиданта в дозе 25 мг/кг отмечали тенденцию к уменьшению показателя, а на фоне его действия в дозе 50 мг/кг продолжительность жизни мышей достоверно уменьшалась в сравнении с контролем на 32%.
Цинксодержащий антиоксидант под лабораторным шифром 7iQ1104 при его профилактическом введении в дозах 10, 25 и 50 мг/кг обеспечивал статистически значимое увеличение продолжительности жизни мышей соответственно на 43, 135 и 326% в сравнении с результатами контрольных групп. близкое веществу 71q1104 по химическому строению вещество 7eq1105 не оказывало положительного влияния на продолжительность жизни мышей при развитии ОГ+Гк в случае его применении в дозе 10 мг/кг. В свою очередь введённое в дозах 25 и 50 мг/кг, соединение способствовало развитию положительного эффекта - относительно контрольных величин показатель увеличивался соответственно на 21 и 59%.
Вещества 7iQ1108 и 7iQ1109, представляющие собой функциональные модели цинксодержащих ферментов, при их использовании во всех изученных дозах не оказали достоверного эффекта на продолжительность жизни мышей. Таким образом, полученные результаты позволили предположить наличие у 4-х изученных нами металлсодержащих антиоксидантов, а именно у веществ под шифрами 7cQ262, 7iQ901, 7tQ1104, TIQ1105 антигипоксических свойств при развитии у мышей состояния острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией. 3.1.2. Вещества сравнения Опыты выполнены на 69 мышах-самцах массой 20-25 г. Результаты данной серии опытов (табл. 4) показали, что введение препарата сравнения антигипоксанта мексидола в дозах 10, 25 и 50 мг/кг не обеспечивало достоверных изменений продолжительности жизни мышей в условиях ОГ+Гк. Таблица 4 Влияние веществ сравнения на продолжительность жизни мышей в условиях острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией № п/п Вещество Дозамг/кг Продолжительность жизни (мин) п Р 1 Контроль - 34,81±2,89 7 Мексидол 1025 50 34,57±2,68 35,18±2,91 32,43±2,76 7 7 7 р 0,05 р 0,05 р 0,05 2 Контроль - 32,52±2,46 7 Амтизол 1025 50 51,24±3,45 93,38±4,62 107,64±5,48 8 7 9 р 0,05 р 0,05 р 0,05 3 Контроль - 34,81±2,89 7 Бемитил 10 25 50 36,40±2,79 49,02±2,88 68,56±3,02 7 7 10 р 0,05 р 0,05 р 0,05 Примечание: р - достоверность различий по отношению к показателям контрольной группы животных Профилактическое введение амтизола, напротив, способствовало увеличению продолжительности жизни животных в условиях изучавшейся модели ги 87 поксии во всех применённых дозировках. В частности, в дозе 10 мг/кг амтизол увеличивал изучаемый показатель на 56%. В дозе 25 мг/кг эффект составил 187%, а при введении антигипоксанта в дозе 50 мг/кг - 231% в сравнении с контрольной группой мышей.
Введение третьего вещества сравнения антигипоксанта с выраженным ак-топротекторным эффектом бемитила в дозе 10 мг/кг не способствовало увеличению продолжительности жизни животных при развитии ОГ+Гк. Тем не менее при увеличении дозы до 25 и 50 мг/кг бемитил демонстрировал достоверный положительный эффект - продолжительность жизни возрастала соответственно на 41 и 97% относительно контрольных показателей.
Анализ приведенных результатов со всей очевидностью показал, что при развитии острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией два из трёх протестированных веществ сравнения, а именно амтизол и бемитил, оказали значимый защитный эффект сопоставимый с таковым для некоторых изученных металлсодержащих антиоксидантов - веществ KQ262, 7cQ901, KQI 104 и 7TQ1105.
Изучение фармакологических свойств наиболее активного металлсодержащего антиоксиданта - вещества teqi 104
По результатам опытов выполненных на моделях острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией, острой экзогенной гипоксии без гиперкапнии и острой экзогенной гипобарической гипоксии для дальнейших испытаний было выбрано наиболее эффективное вещество из категории металлсодержащих антиокси-дантов под шифром 7iQ1104. В новом фрагменте исследования в опытах на мышах были изучены влияния вещества 7tQ1104 на некоторые показатели состояния системы кровообращения, а также параметры внешнего дыхания. Получены сведения о влиянии данного химического соединения на величину стандартного энергетического обмена мышей, прослежена динамика изменений концентрации Ог в доступном для дыхания животных воздухе при развитии ОГ-Гк. Результаты описанных в этой главе исследований дали возможность расширить представления о фармакологических свойствах цинксодержащего вещества 7iQ1104, что в дальнейшем было использовано для обоснования возможных механизмов его антигипоксического действия.
Так как при развитии острой экзогенной гипоксии наибольшую эффективность из трёх выбранных для сравнительного анализа эталонных средств (мек-сидол, амтизол, бемитил) продемонстрировал антигипоксант аминотиолового происхождения амтизол, то было решено в дальнейшем использовать его в качестве единственного средства сравнения при исследовании некоторых фармакологических свойств вещества TCQI 104. Известно, что на фоне действия анти-гипоксантов метаболического типа действия, в ряду которых представлены и производные аминотиолов (гутимин, амтизол, бемитил, вещество 7EQ1 104), могут значительно ухудшаться показатели условнорефлекторной деятельности, что особенно важно для организмов с высоким уровнем организации ЦНС. Возникающие нарушения чаще всего находят отражение в ослаблении пове 113 денческих реакций, снижении способности животных или человека приспосабливаться к изменяющимся условиям внешней среды [143, 202]. Как правило применение антигипоксантов указанной выше фармакологической группы в эффективных дозах заметно дестабилизирует соотношения между процессами возбуждения и торможения в ЦНС, и что важно, в коре головного мозга в сторону преобладания тормозных реакций [192, 339].
Как было установлено в ходе выполненных нами предварительных исследований многие из изученных металлсодержащих антиоксидантов, включая и вещество 7iQ1104, оказывали отчётливое негативное влияние на возможности животных по осуществлению контроля над выполнением тех или иных моторных актов. Иногда введение веществ сопровождалось формированием у мышей состояния полной неподвижности. На фоне прогрессирующей лекарственной гипотермии подобного рода изменения в поведении животных могли быть расценены как последствия грубых и, возможно, необратимых функциональных или морфологических нарушений в ЦНС.
В связи с этим представлялось важным изучить влияние выбранного нами для детального исследования вещества 7UQ1104 на состояние наиболее чувствительной к воздействиям внешней среды, а также к эффектам фармакологических веществ части ЦНС - коры головного мозга. В качестве базового метода исследования был использован метод условных рефлексов, который позволил дать объективную оценку возможности реализации структурами ЦНС их высших интегративных и аналитических функций.
Чтобы получить ясное представление о том, насколько влияние металлсодержащих антиоксидантов, обладающих антигипоксическим действием, на ус-ловнорефлекторную деятельность животных соотносится с соответствующими эффектами эталонных антигипоксантов, было проведено сопоставление некоторых показателей избегательного оборонительного условного рефлекса у мышей, которые были получены в ходе применения вещества TCQ 1104 с таковыми антигипоксанта амтизола.
Согласно полученным результатам, латентный период избегательного оборонительного условного рефлекса в среднем составил 1,2±0,3 с, время активного избегания - 35,5±4,8 с (рис. 12-1).
Внутрибрюшинное введение вещества rcQl 104 в дозе 50 мг/кг приводило к отчётливым изменениям в поведении экспериментальных животных. Уже через 10-15 мин после инъекции отмечали некоторое уменьшение моторной активности мышей, ослабление их реагирования на воздействие внешних раздражителей. С этого момента животные переставали пить воду и отказывались от пищи. Тем не менее через 30 мин после введения изучавшегося химического вещества латентный период избегательного оборонительного условного рефлекса достоверно не изменялся и составлял 1,1±0,4 с, в то время как время активного избегания значимо сокращалось до 20,3±3,9 с, т. е. на 42,8% (рис. 12-2).
На протяжении последующих 30 мин двигательная активность и исследовательское поведение животных продолжали уменьшаться. Через 60 мин после введения вещества 7iQ1104 было зарегистрировано достоверное увеличение времени реагирования животных на предъявление условного раздражителя -латентный период избегательной реакции в среднем достигал 3,8±0,6 с, т. е. удлинялся в 2,7 раза (рис. 12-3). При этом время активного избегания продолжало сокращаться и на момент регистрации не превышало 14 с (в среднем -7,6±2,8 с), т. е. уменьшалось на 78,6%.
