Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема создания новых эффективных лекарственных средств растительного происхождения продолжает оставаться одной из актуальнейших в фармакологии.
Оптимизация тестирования на первом этапе скрининга биологически активных веществ (БАВ) чрезвычайно привлекательна для организаций, занимающихся целенаправленным поиском и разработкой препаратов. При этом ставится задача сократить время поиска, материальные и физические затраты на исследование, получить максимально достоверные данные о потенциальных возможностях изучаемого фитообъекта как БАВ и предложить направления его дальнейшего изучения с целью разработки эффективного лекарственного средства с заданной фармакологической активностью. В связи с этим предлагаются разные системы скрининга, например многоуровневая автоматизированная система (Баренбойм Г.М., Маленков А.Г., 1986; Johnson, 1987). Наиболее привлекательны и перспективны, на наш взгляд, системы первичного поиска БАВ с использованием тестов in vitro, как наиболее быстрые и экономичные. Так, система, основанная на взаимодействии изучаемых веществ с мембранными рецепторами (Blackbom et al., 1988; Prous et al, 1994), дополненная «рецепгорной технологией» (Корольченко Л.В., 1999), позволила выявить сотни потенциальных препаратов и разработать десятки новых оригинальных лекарственных средств. Однако эта система предназначена, преимущественно, для поиска индивидуальных химических соединений, продуктов химического синтеза, когда можно установить конкретную связь - вещество-рецептор, определить константу связывания, константу вытеснения эталонного лиганда.
Скрининг биологически активных веществ растительного происхождения имеет особенности, обусловленные сложностью состава извлечений из растений, в которых могут одновременно содержаться БАВ различной химической структуры и разной биологической активности. В этом случае установить связь вещество-рецептор-мишень очень сложно или вообще не возможно. Для выявления биологической активности извлечений из растений, в особенности для выявления заданной (искомой) активности, целесообразны специфические тесты in vitro с использованием бнотест-систем (тест-объектов), соответ-ствмоншч определенным пилам фармакологического действия. Мы предлагаем програм-Ms первичною биохимическою скрининга БАВ, где в качестве специфических тест-обьскиш іісію.іьімоіся ферменты. їй рающие ключевую роль в комплексе реакций, участвующих в обеспечении соогветствующих физиологических процессов. Выявление основной направленности действия изучаемого объекта на этапе первичного биохимического
4 скрининга in vitro при использовании адекватных ферментных тестов, позволяет повы эффективность, усовершенствовать и унифицировать программу поиска и оценки фа кологической активности новых БАВ природного происхождения.
Предлагаемая программа скрининга может быть применена, прежде всего, для г ка и дальнейшей разработки новых оригинальных препаратов среди фитообъектов держащих соединения флавоноидной и тритерпеновой природы. Это обусловлено, п де всего, их широким спектром потенциальных фармакологических свойств и, как пр ло, относительной безвредностью для организма. Так, показано, что флавоноиды o6j ют антиоксидантними, капилляропротекторными, желчегонными, гепатозащитными диопротекторными, противовоспалительными, антимикробными и другими видами макологических свойств (Барабой В.А., 1976; Вичк анова С.А., 1980; Барнаулов ( 1999; Амосова Е.Н. и др., 2000; Сыров В.Н. и др., 2001; Pathak et al., 1991, Formica, R son, 1995; Priollet, Boisseau, 2000; O'Brien et al., 2000). Являясь малотоксичными соед ниями, флавоноиды и препараты на их основе проявляют высокую эффективность в і ний достаточно тяжелых заболеваний. Показан ингибирующий эффект флавоноидов генина и кверцетина на рост меланомы и образование метастазов (Caltagirone et al., 2( с успехом применяются при лечении нарушений мозгового кровообращения (бол Альцгемера и др.) препарат «Танакан» и другие препараты, содержащие флавонолі, экстракт из листьев Гинкго Билоба (Суслина З.А. и др., 2000; Милопольская И.М., 2 Le Bars et al, 1997). Такая широта и выраженность фармакологических свойств биофі ноидов обусловлены, прежде всего, их блокирующим влиянием на ключевые звенья вития различных патологических процессов, в том числе на ускорение процесса сво но-радикального окисления липидов мембран и нарушение целостности сосуди стенки капилляров (Cholbi et al., 1990; Pathak et al., 1991). Поскольку по своей пр де флавоноиды являются естественными антиокислителями, представляется целесооЕ ным поиск и разработка новых антиоксидантных средств на основе флавоноидсоде] щих фитообъектов.
Не меньшим, чем флавоноидные препараты, диапазоном фармакологичеі свойств обладают растительные тритерпеновые гликозиды и препараты на их основе силенко Ю.К. и др., 1993; Платонов В.Г. и др., 1995; Уварова Н.И. и др., 2000; Ильи Т.Н. и др., 2001; Shibata, 1985; Facino et al., 1995, Uchendu, Leek, 1999; Kim et al., li Наиболее востребованы их нейротропные свойства (препараты женьшеня, аралии), в тонические, ангиопротекторные и противовосполительные свойства (препараты каш конского, солодки гладкой). В последние годы, в связи с увеличением общей стрессе ности жизни человека, обусловленной различными неблагоприятными условиями о
5 жающей действительности, возрос интерес к препаратам седативного или транквилизирующего действия как средствам, оказывающим благоприятное воздействие при неврозах и астеноневротических состояниях. Чрезвычайно высока потребность в малотоксичных и не вызывающих зависимость транквилизаторах для лечения больных с алкогольным или наркотическим пристрастием. Принимая во внимание, что нейротропные свойства три-терпеноидов часто сочетаются с их положительным влиянием на функционирование других органов и систем в организме, в частности на сердечно-сосудистую и гемокоагуляци-онную (Колхир В.К. и др., 1989, 1995, 2000; Майнсков А.В. и др., 1999), они, как правило, не оказывают токсического действия, представляется актуальным поиск и разработка се-дативных (транквилизирующих) средств в ряду тритерпенсодержащих фитообъектов.
Возможности комбинированного использования положительных качеств представителей классов флавоноидов и тритерпеноидов позволяют разработать лекарственные средства для лечения заболеваний со сложной и не всегда установленной этиологией. В первую очередь это касается такого заболевания как простатит. Хронический простатит является одним из наиболее частых заболеваний у мужчин. Возникновение воспалительных заболеваний репродуктивного тракта обусловлено инфицированием половых путей патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, нарушением гемодинамики предстательной железы, состоянием иммунологического статуса и другими, не всегда четко определяемыми, причинами (Ващенко В.В. и др., 1998; Титова Т.М. и др., 1998; Сегал А.С. и др., 2000; Мазо Е.Б., 2001). Недостаточная эффективность лечения больных хроническим простатитом и значительная частота осложнений (аллергические реакции, токсическое воздействие фармакологических препаратов на сперматогенез и др.) делает необходимым разработку новых эффективных препаратов для лечения этого заболевания. Включение лекарственных средств растительного происхождения в комплексную терапию при различных клинических формах хронического простатита и реабилитационные мероприятия для таких больных является одним из перспективных направлений в решении данной задачи (Михеев НА. и др, 1989; Виноградов В.М. и др., 1996; Кукес ВТ. и др., 1999).
Указанные причины определяют актуальность проблемы в целом.
Работа выполнена как часть плановых научных исследований, проводимых во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений.
Цель исследования. Разработка научно-методических основ первичного биохимического скрининга и прогнозов механизмов действия in vitro БАВ растительного происхождения с использованием в качестве тест-объектов ключевых ферментов, и создание ори-
гинальных фитопрепаратов, на основе флавоноидов и тритерпеноидов, нейротроп антиоксидантного, гепатопротекторного и простатотропного действия для лечения за ваний центральной нервной, дыхательной, сердечно-сосудистой, гепатобилиарной и і половой систем.
Задачи исследования.
-
Поиск и отбор приемлемых, в качестве молекулярных биотест-систем, фермен разработка блоков ферментативных тестов in vitro, соответствующих определеї видам фармакологической активности.
-
Отработка методологических подходов и принципов биохимического тестиров для выявления веществ, обладающих адаптогенными, антиоксидантньши, ашт робными, антитоксическими свойствами.
-
Поиск биологически активных веществ с целью обнаружения перспективных ( объектов для разработки фитопрепаратов.
-
Выявление доминирующей направленности фармакологического действия не рых тритерпен- и флавоноидсодержащих БАВ растительного происхождени; использования в качестве основы фитопрепаратов, таких как «Диквертин», бектан», «Простанорм», «Патримин».
-
Фармакологическое, токсикологическое изучение и клинические исследої флавоноидного препарата «Диквертин» как антиоксидантного и капилляропр торного средства, обладающего гастро- и гепатопротекторньши, гиполипидеї скими и диуретическими свойствами.
-
Фармакологическое, токсикологическое изучение и клинические исследої комплексного флавоноидсодержащего препарата «Сибектан» как желчегонні гепатозащитного средства, обладающего гастропротективными, антиоксиданті и диуретическими свойствами.
-
Фармакологическое, токсикологическое изучение и клинические исследої комплексного тритерпен- и флавоноидсодержащего препарата «Простанорм; простатотропного средства, обладающего противовоспалительными, капил. протекторными, анальгетическими, диуретический, антимикробными и андр ными свойствами.
-
Фармакологическое, токсикологическое изучение и клинические исследования терпеноидного препарата «Патримин» как седативного средства, обладающег тигипертензивными, антикоагулянгными, антиагрегащюнньши и гнпотриглиі демическими свойствами.
7 9. Разработка нормативно-технической документации на фитопрепараты «Диквер-тин», «Сибектан», «Простанорм», «Патримин».
Научная новизна. Впервые разработаны и предложены научно-методологические основы первичного биохимического скрининга in vitro, с прогнозом механизма действия, веществ растительного происхождения с использованием в качестве тест-объектов ключевых и лимитирующих ферментов, что позволило изменить схему скрининга и разработки препаратов в целом, исключив этап первичного фармакологического поиска.
Дано теоретическое и практическое обоснование использования в качестве тест-объектов ключевых или лимитирующих ферментов биохимических реакций для первичного поиска биологически активных фитообъектов, перспективных с точки зрения разработки оригинальных фитопрепаратов. Установлено, что каждый из сформированных блоков ферментативных тестов соответствует определенному виду фармакологической активности. Первичный биохимический скрининг с использованием ферментных тест-систем позволяет изменить схему скрининга и разработки препаратов в целом, исключив этап первичного фармакологического поиска.
В рамках разработанной Программы биохимического скрининга предложены способы выявления веществ, обладающих адаптогенными, антиоксидантними, антитоксическими, антимикробными свойствами.
Используя предложенные тест-системы, выявлена направленность фармакологического действия некоторых тритерпен- и флавоноидсодержащих фитообъектов, что позволило целенаправленно разрабатывать фитопрепараты с заданными фармакологическими свойствами. Показан широкий диапазон потенциальных фармакологических свойств фла-воноидов и тритерпеноидов, определяющий перспективность их дальнейшего биохимического и фармакологического изучения.
Впервые проведены доклинические исследования специфической и обгдефармаколо-гической активности и безопасности тритерпен- и флавоноидсодержащих фитопрепаратов - «Патримина», «Диквертина», «Сибектана» и «Простанорма», в основном, подтвердившие в экспериментах на животных фармакологические свойства, прогнозируемые при первичном биохимическом тестировании.
Показано, что патримин оказывает выраженный седативный эффект, повышая активность тормозных процессов в коре головного мозга и ослабляя восходящую активацию из подкорковых областей. Седативная активность препарата сочетается с его антиги-пертензивными, антикоагуляционными, антиагрегационными и гиполипидемическими свойствами. Антиагрегационная (дезагрегащ-ганная) активность патримина существенно
превосходит эффект ацетилсалициловой кислоты. Установлен высокий уровень безо ности препарата.
Экспериментально установлены специфические капилляропротекторные и антис дантные свойства диквертина, которые обусловлены как прямым антирадикальным ствием препарата, так и влиянием его иа ферменты антиоксидантной защиты и моною назной системы щпохрома Р45о- Дополнительные положительные свойства преш обеспечиваются его гастро- и гепатопротекторной, гиполипидемической и диуретине активностью, низким уровнем токсичности.
В экспериментах на животных показана высокая гепатозащитная и желчегонна тивность комплексного препарата сибектана на различных моделях поражения гепат лиарной системы. Эффект препарата во многом обусловлен присутствием в его комг ции фармакологически активных компонентов - силимара и танацехола, определяй: антиоксидантные, антирадикальные, мембраностабилизируюшие и антитоксические ( ства сибектана, дополненные противовоспалительными, гастропротективными и диу[ ческими свойствами экстрактов из зверобоя и листа березы.
В модельных экспериментах изучена простатотропная активность простанорма і казаны его выраженные противовоспалительныые, капилляропротекторные, анальгеї ские, диуретические, антимикробные свойства, сочетающиеся с гастро- гепатопротеї ной, иммуностимулирующей и антигнпоксантнои активностью, низким уровнем токси сти.
Полученные в экспериментах результаты послужили основой для проведения кл ческих исследований фитопрепаратов, где были доказаны их специфические свойст безопасность..
Практическая значимость.
Разработанная Программа первичного биохимического скрининга БАВ растител го происхождения позволила провести поиск среди более чем 200 природных соедине и выявить 20 фитообъектов, перспективных для разработки препаратов общеукрепляк го, адаптогенного, иммуномодулирующего, ноотропного, антитоксического и др. де вия. Установлены направления расширенного фармакологического изучения тритерпе флавоноидсодержащих фитообъектов.
Предложенные ферментные биотест-системы, эффективны не только в каче экспресс-тестов для первичного скрининга биологически активных веществ, но и м быть использованы в качестве методов, позволяющих выявить сходство и различия м«
близкими по фармакологическим свойствам препаратами, а также для изучения биохимических механизмов фармакологического действия веществ.
По результатам доклинического изучения и клинических исследований препаратов «Диквертин», «Сибектан», «Простанорм» и «Патримнн» оформлена нормативно-техническая документация и получено разрешение Министерства здравоохранения РФ на их медицинское применение и промышленный выпуск:
Патримина. в лекарственной форме таблетки по 0,1 г для приема внутрь, как седативного средства для профилактики и лечения заболеваний ЦНС (неврозы и невро-зоподобные состояния, сопровождающиеся повышенной возбудимостью и нарушением сна, энцефачолатин) и при комплексном лечении гипертонической болезни 1-Й степени с тромботическими и атеросклеротическими осложнениями. (Приказ МЗРФ№ от 24.02.1994г)
Диквертина. в лекарственной форме таблетки по 0,02 г для приема внутрь, как антиоксидантного и капилляропротекторного средства при бронхо-легочных заболеваниях, а также при ишемической болезни сердца и наджелудочковых нарушениях ритма сердца в составе комплексной терапии (Приказ МЗ РФ №302 от 29.07.96).
Сибектана. в лекарственной форме таблетки по 0,1 г для приема внутрь, в качестве гепатопротекторного и желчегонного средства при хроническом персисти-рующем гепатите, хроническом холецистите и гипомоторной дискенезии желчного пузыря. Сибектан применяют также в комплексной терапии цирроза печени и жировой дистрофии печени алкогольного генеза (МЗ РФ № 51 от 18.02.97).
Простанорма. в жидкой лекарственной форме и в виде таблеток по 0,2 г для приема внутрь как простатотропное, противовоспалительное и нормализующее диурез средство для лечения и профилактики обострений хронического неспецифического простатита (Р.У. 99/280/12; Р.У. № 000842/02-2001).
Подготовлены (совместно с Кукесом В.Г., Булаевым В.М. и др.) и опубликованы в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2000) «Методические указания по доклиническому изучению новых препаратов, разработанных из природного сырья».
Опюнные положения, выносимые на защиту:
Hpnip.tMMj биохимического скрининга веществ природного происхождения in sum. іде а качесівс u'er-объекгов используются ключевые ферменты, позволяет бьісіро, в режиме экспресс-тестирования, провести первичный поиск и отбор фармакологически активных фитообъектов, перспективных с точки зрения разра-
10 ботки оригинальных фитопрепаратов, в частности, на основе тритерпеноиді флавоноидов. При разработке новых фитопрепаратов установлено, что:
тритерпеноидный препарат «Патримин» оказывает седативное действие, сочс щееся с ангигипертензивньши, ангикоагулянтными, антиагрегационными и ги риглицеридемическими свойствами.
флавоноидный препарат «Диквертин» (дигидрокверцетин) обладает ангиопро торной и антиоксидантной активностью (превосходящей активность кверцеті сочетающейся с противовоспалительными, гепатопротективными, гиполипиді ческими и диуретическими свойствами.
флавонондсодержащий комплексный препарат «Сибектан» оказывает гепато; текторное, желчегонное, антиоксидантное и усиливающее процессы регенерг действие.
тритерпен- и флавонондсодержащий комплексный препарат «Простанорм» обл ет фармакологическими свойствами, характеризующими его как простатотрої средство, из которых главными являются противовоспалительные, капиллярої текторные, анальгетические, диуретические, антимикробные и андрогенные.
Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации д жены и обсуждены на Конференции «Исследования по изысканию лекарственных ере, природного происхождения» (Ленинград, 1981), V и VI Всесоюзных съездах фармак гов (Ереван, 1982; Ташкент, 1988), Национальной конференции по лекарственным ра ниям (София, 1982), Всесоюзной научной конференции «Результаты и перспективы н ных исследований в области создания лекарственных средств из растительного сы] (Москва, 1985), V Всесоюзном симпозиуме по фенольным соединениям (Таллин, 1987 III-VIII Российских Национальных Конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1 1996-2001), Ш Международном симпозиуме «Экология человека: проблемы и coctoj лечебно-профилактического питания» (Москва, 1994), Научной конференции, посвяі ной 50-ию НИИ фармации «Решение актуальных задач фармации на современном эт; (Москва,1994), 2-ом Научном конгрессе «Традиционная медицина - теоретические и п тические аспекты» (Чебоксары, 1996), 1-ой Международной конференции «Научнь практические аспекты совершенствования качества продуктов детского и геродиетиче го питания» (Москва, 1997), Международном симпозиуме «Биоантиоксидант» (Тюм 1997), Конференции «Проблемы противолучевой защиты» (Москва, 1998), XlXth Inte tional Conference on Polyphenols (Lille (France), 1998), I, II, IV и V Международных С
дах «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (С-Петербург-Выборг, С.-Петербург-Валаам, В.Новгород, С.-Петербург-Петергоф, 1997, 1998, 2000, 2001), Научно-практической конференции «Биологически-активные добавки к питанию и лекарственные препараты на натуральной основе в профессиональном лечении и реабилитации» (Москва, 2000), Юбилейной конференции, посвященной 70-ти летию ВИЛАР (Москва, 2000), X Международном Симпозиуме «Эколо-го-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2001), 1-ой Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2001), Международном Конгрессе «Здравница-2001» «Актуальные проблемы восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии» (Москва, 2001), на специализированной секции Ученого совета ВИЛАР (Москва, 2002).
Публикации.
Материалы диссертационной работы изложены в 114 научных трудах, в том числе в 17 патентах и авторских свидетельствах, 11 публикациях в общероссийских медико-фармацевтических журналах, рекомендованных ВАК РФ, 8 публикациях в иностранных журналах, 38 публикациях в других журналах и сборниках научных работ, 40 материалах Всероссийских, зарубежных и международных конгрессов, симпозиумов и конференций.
