Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Нестероидные противовоспалительные средства, механизм действия и основные побочные эффекты 10
2.2. Свободнорадикальные процессы при патологических состояниях и роль антиоксидантной системы 19
2.3. Лекарственная коррекция гастродуоденопатий, вызванных приемом нестероидных противовоспалительных средств 24
2.4. Краткая характеристика лекарственного средства димефосфон 27
3. Материалы и методы исследования 30
3.1. Экспериментальное изучение влияния димефосфона на ульцерогенное действие индометацина с определением показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови крыс 30
3.2. Ретроспективный анализ частоты встречаемости НПВС-индуцированных гастродуоденопатий у больных, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства 31
3.3. Разработка острой фармакологической пробы с индометацином (ОФПИ) с биохимическим определением показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы 31
3.4. Проведение острой фармакологической пробы с индометацином у здоровых добровольцев с биохимическим определением показателей перекисного окисления липидов, антиоксидантной системы, содержания нитрит-иона 32
3.5. Рандомизированное плацебо-контролируемое простое слепое исследование влияния димефосфона на показатели перекисного окисления липидов, антиоксидантной системы, содержание нитрит-иона при проведении острой фармакологической пробы с индометацином 32
3.6. Описание биохимических методов исследования 38
4. Результаты собственных исследований и их обсуждение 41
4.1. Экспериментальная часть работы 41
4.1.1 .Изучение влияния димефосфона на ульцерогенное действие индометацина и процессы перекисного окисления липидов, антиоксидантной системы в крови крыс 41
4.1.2. Комплексный анализ биохимических показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты котрольных крыс 43
4.2. Клиническая часть работы 45
4.2.1.Ретроспективный анализ частоты встречаемости НПВС-индуцированных гастродуоденопатий у больных, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства 45
4.2.2. Разработка острой фармакологической пробы с индометацином (ОФПИ) с биохимическим определением показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы 47
4.2.3. Изучение изменения показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при проведении острой фармакологической пробы с индометацином у здоровых добровольцев 55
4.2.4. Рандомизированное плацебо-контролируемое простое слепое исследование влияния димефосфона на показатели перекисного окисления липидов, антиоксидантной системы при проведении острой фармакологической пробы с индометацином 64
4.2.5. Изучение изменения содержания нитрит-иона при проведении острой фармакологической пробы с индометацином у пациентов, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства и здоровых добровольцев 80
5. Выводы и практические рекомендации 88
6. Список литературы 90
7. Приложение 110
- Свободнорадикальные процессы при патологических состояниях и роль антиоксидантной системы
- Рандомизированное плацебо-контролируемое простое слепое исследование влияния димефосфона на показатели перекисного окисления липидов, антиоксидантной системы, содержание нитрит-иона при проведении острой фармакологической пробы с индометацином
- Изучение изменения показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при проведении острой фармакологической пробы с индометацином у здоровых добровольцев
- Изучение изменения содержания нитрит-иона при проведении острой фармакологической пробы с индометацином у пациентов, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства и здоровых добровольцев
Введение к работе
Актуальность исследования
Нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) принадлежат к числу наиболее часто назначаемых лекарственных средств в мировой медицинской практике. Безрецептурный отпуск, неконтролируемый приём нестероидных противовоспалительных средств является причиной развития многочисленных осложнений, наиболее опасными среди которых являются эрозивно-язвенные поражения желудочно-кишечного тракта (Takagi К., Okabe S., 1986; Насонов Е.Л., 2003). Опасность НПВС-индуцированных поражений желудочно-кишечного тракта в их первоначальной клинической бессимптомности, обнаружении в критических ситуациях перфорации язв или язвенных кровотечений (Зиганшина Л.Е., 1997, Насонов Е.Л., 2000, 2003). Синтез высокоселективных нестероидных противовоспалительных средств на сегодняшний день не решил проблему гастро-, нефро- и гепатотоксичности препаратов этой группы. Необходимость длительного, часто пожизненного приема нестероидных противовоспалительных средств, несмотря на развитие у части больных таких серьезных осложнений, как эрозивно-язвенные поражения желудка и 12-перстной кишки и бессимптомные кровотечения из язв, определяет актуальность разработки новых методов повышения безопасности терапии нестероидными противовоспалительными средствами для всех групп населения. По данным разных авторов частота НПВС-индуцированных поражений ЖКТ колеблется от 6,8%-25,5% при применении высокоселективных НПВС и напроксена (Hawkey CJ; Laine L, Simon T, Quan H, Shingo S, Evans J, 2003) до 50-75% при длительной терапии НПВС (Гребенева Л.С Насонова СВ., Л.И. Цветкова, 1997). Широко известно, что повреждение желудочно-кишечного тракта происходит не у всех пациентов, принимающих НПВС, несмотря на то, что поражения ЖКТ обусловлены единым механизмом действия лекарственных средств этой группы. Поэтому при назначении НПВС особенно актуален индивидуальный подход с учетом "устойчивости"/"уязвимости" к гастротокси-ческому действию НПВС.
Недостатки существующих нестероидных противовоспалительных средств и возрастающие требования современной медицины определяют актуальность разработки подходов к прогнозированию риска развития и коррекции поражений желудочно-кишечного тракта при необходимости длительного при"янрртя тч-тяппиптг* противовоспалительных средств. В качестве одного Чй^йЛтшм/Сйеханизиов развития
\_j^Mj
2 НПВС-индуцированных поражений желудочно-кишечного тракта рассматривается активация перекисного окисления липидов (Зиганшина Л.Е., 1996, 1997, Rainsford K.D., 1989). Антиоксиданты и поглотители свободных радикалов уменьшают гаст-ротоксическое действие антифлогистиков, повышая при этом их противовоспалительную активность (Зиганшина Л.Е., 1996). Исследования показателей перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы (АОС) в прогнозировании риска развития ульцерогенного действия НПВС ранее не проводились.
Диссертация выполнена при частичной поддержке Фонда НИОКР АН Республики Татарстан №03-3.2-96/2001 (Ф).
Цель исследования
Разработать методы прогнозирования риска развития ульцерогенного действия нестероидных противовоспалительных средств и способы повышения безопасности нестероидной противовоспалительной терапии.
Задачи исследования
-
Разработать острую фармакологическую пробу с индометацином в качестве способа прогнозирования риска развития поражений желудочно-кишечного тракта у больных.
-
Изучить изменение состояния перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы, содержания нитрит-иона при проведении острой фармакологической пробы с индометацином у больных, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства, и здоровых добровольцев в зависимости от пола и возраста.
-
Исследовать возможность коррекции димефосфоном биохимических нарушений, вызванных индометацином.
Научная новизна
Впервые разработан новый метод прогнозирования риска развития НПВС-индуцированной гастропатии - острая фармакологическая проба с индометацином, основанная на определении показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы. Разработанный "индекс устойчивости" к гастротоксическому действию нестероидных противовоспалительных средств коррелирует с содержанием различных форм глутатиона крови и данными фиброгастродуоденоскопии. Впер-
вые больные, длительно принимающие НПВС, и здоровые добровольцы разделены на "уязвимых" и "резистентных" по типу биохимического реагирования на острую фармакологическую пробу с индометацином. Впервые показано снижение содержания нитрит-иона в ответ на прием индометацина в крови больных ревматоидным артритом и остеоартрозом, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства. Впервые в клинике показано влияние димефосфона на изменение уровня нитрит-иона при проведении острой фармакологической пробы с индометацином. Дано обоснование нового показания к применению димефосфона — в качестве средства, корригирующего НПВС-индуцированные гастропатии у больных, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства.
Научно-практическая значимость работы
Результаты исследований позволяют повысить безопасность нестероидной противовоспалительной терапии, обосновывая необходимость дифференцированного подхода к назначению нестероидных противовоспалительных средств на основе оценки "уязвимости"/"резистентности" пациентов. Результаты рандомизированного плацебо-контролируемого простого слепого исследования показали целесообразность применения димефосфона для повышения "биохимической устойчивости" пациентов к повреждающему действию НПВС.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Индометацин в варианте острой фармакологической пробы вызывает накопление продуктов перекисного окисления липидов в крови крыс в условиях эксперимента и в крови больных, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства.
-
По типу биохимического реагирования на острую фармакологическую пробу с индометацином больные, длительно принимающие нестероидные противовоспалительные средства, и здоровые добровольцы могут быть разделены на 2 группы: "уязвимые" - с высоким риском развития НПВС-индуцированных гастропатии, и "резистентные" - с наименьшим риском их развития. Разработанный "индекс устойчивости" к действию НПВС, а также показатели окислительно-восстановительного глу-татионового буфера могут быть прогностическими критериями возможности поражения ЖКТ нестероидными противовоспалительными средствами.
-
Однократный прием индометацина в дозе 75 мг (острая фармакологическая про-
4 ба) снижает содержание нитрит-иона в сыворотке крови пациентов, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства, а также в сыворотке крови "резистентных" здоровых добровольцев.
4. Применение димефосфона в течение 10 дней сопровождается активацией антиок-сидантной системы и повышением уровня нитрит-иона в ответ на острую фармакологическую пробу с индометацином в сыворотке крови пациентов, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства.
Апробация работы
Фрагменты диссертационной работы доложены и обсуждены на XXVIII ежегодной научной сессии Центрального НИИ гастроэнтерологии, посвященной памяти академика РАМН Анатолия Сергеевича Логинова (Москва, 2000), научно-практической конференции "Актуальные вопросы гастроэнтерологии 2003. Рациональная фармакотерапия органов пищеварения" (Казань, 2003). Материалы диссертации представлены на конференции «Современные проблемы медицинской науки и практики» (КГМА, 2000), научно-практических конференциях молодых ученых Казанской Государственной Медицинской Академии (2001, 2002), VIII и IX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2001,2002), международных конференциях «Клинические исследования лекарственных средств в России» (Москва, 2001, 2002), ежегодном собрании Американского общества по клинической фармакологии и терапии (Атланта, 2002).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 200 источников. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 рисунками, 18 таблицами.
Свободнорадикальные процессы при патологических состояниях и роль антиоксидантной системы
Молекулярный кислород является широко распространенным окислителем в живых системах. При постадийном присоединении электронов к молекулярному кислороду образуются супероксидный анион-радикал (0""2), пероксид водорода (Н202) и гидроксид-радикал (ОН ) [9].
Обладая способностью отдавать и принимать электроны, супероксид-анион может выступать и как восстановитель, и как окислитель. В клетке он обычно выступает как окислитель. Среди его мишеней небольшие органические молекулы - катехоламины, низкомолекулярные тиолы, аскорбат, тетрагидроп-терины. В кислой среде он способен образовывать гидропероксильный радикал (Н20 ) [9, 164], являющийся гораздо более активным окислителем, чем супероксидный анион-радикал. Простетические группы Fe/S-содержащих дегидратаз (аконитазы, фумаразы, дегидратаза 6-фосфоглюконата) эффективно окисляются в клетке супероксидом. Одновременно образуется гидроксид-радикал - активный окислитель, способный атаковать нуклеиновые кислоты, белки и фосфоли-пиды. Пероксид водорода Н202, образующийся при дисмутации супероксид-аниона, является практически инертной молекулой [8, 9].
Окисление мембранных фосфолипидов, которые содержат ненасыщенные жирнокислотные остатки, происходит по цепному механизму. Эти процессы приводят к быстрому нарушению целостности клеточных мембран. Молекулярными продуктами окисления фосфолипидов являются гидропероксиды жирных кислот (диеновые конъюгаты) и соединения альдегидной природы -гидроксиненали и малоновый диальдегид. При нормальных условиях функционирования концентрация этих соединений в тканях мала. Но в условиях нарушения кислородного метаболизма создается ситуация, характеризующаяся повышенной продукцией активных форм кислорода и носящая название окислительного стресса. Гидропероксиды липидов нарушают регулярную упаковку мембранного бислоя и вызывают образование в мембране дефектных зон. Малоновый диальдегид, взаимодействуя с белками и нуклеиновыми кислотами, вызывает образование внутри- и межмолекулярных сшивок [9]. Гидроперекиси липидов восстанавливаются при помощи глутатионпероксидазы [86]. Возможно и расщепление гидроперекиси фосфолипида с появлением карбонильной группы в его молекуле и созданием свободного альдегида. Карбонильный фос-фолипид, взаимодействуя с кислородом, образует малоновый диальдегид. При взаимодействии малонового диальдегида с аминосодержащими агентами (белки, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, аминокислоты и др.) образуются соединения типа шиффовых оснований [45]. Большую опасность представляет избыток активных свободных радикалов и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - альдегидов и оснований Шиффа, так как они нарушают клеточный метаболизм. Известна широкая индивидуальная вариабельность содержания различных продуктов ПОЛ у животных, обусловленная большим числом различных факторов, лимитирующих активность этого процесса [8]. Процессы ПОЛ выступают и как ранние ключевые звенья патогенеза многих заболеваний [22, 55, 70, 86].
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) является физиологическим процессом, необходимым для устранения поврежденных структур, так как целостность организма поддерживается за счет равновесия между притоком вновь синтезированных молекул и элиминацией окислительно поврежденных белков и липидов [12]. В нормальных условиях в организме течение свободноради-кальных процессов находится под строгим контролем ферментативных и неферментативных систем антиоксидантной защиты, препятствующих избыточному образованию свободных радикалов. Их согласованная работа держит под контролем образование и превращения активных форм кислорода. [9, 12].
Различные антиоксиданты играют в тканях разную роль. Супероксиддисмутаза контролирует клеточный уровень супероксид-аниона, дисмутируя его избыток в перекись водорода, которая служит субстратом каталазы, пероксидазы и глутатион-зависимых ферментов, превращающих ее в воду. При определенных условиях природные антиоксиданты способны ленных условиях природные антиоксиданты способны проявлять прооксидант-нуюроль[9, 169, 179].
Глутатион-зависимые антиоксидантные ферменты - глутатионпероксида-за и глутатионтрансферазы принимают участие в восстановлении органических пероксидов, причем глутатионпероксидаза также активно восстанавливает и Н202. Для восстановления пероксидов полиненасыщенных липидов в молекулы соответствующих спиртов используется восстановленный глутатион, а окисленный глутатион регенерируется с участием глутатионредуктазы.
Оксид азота (II) - N0, в окружающей среде рассматривается как загрязняющий фактор [50]. Отмечается наличие зависимости между загрязнением воздуха оксидом азота и образованием в нем нитрозосоединений - активных канцерогенных веществ 1-го класса опасности [54]. Находясь в воздухе, N0 может попадать в организм человека и животных городского смога [69] и табачного дыма [163].
В 1980 году американскими учеными Furchgott R.F. и Zavadski J. [123] впервые была установлена абсолютная необходимость наличия интактного эндотелия для реализации релаксирующего действия ацетилхолина на изолированные фрагменты аорты кролика. Помимо ацетилхолина эндотелийзависимую релаксацию вызывали брадикинин, серотонин, субстанция Р, арахидоновая кислота и ряд других соединений. В то же время другие вазодилататоры - проста-циклин, аденозин, натрия нитропруссид - оказались «эндотелийнезависимы-ми». Данный механизм, свидетельствующий о наличии некоторого вещества, продуцируемого эндотелиоцитами и модулирующего тонус гладких миоцитов сосудов, был назван эндотелийзависимым, а предполагаемое вещество - эндо-телийзависимым релаксирующим фактором («endothelium derived relaxant factor», или EDRF - в англоязычной литературе). В конце 80-х было экспериментально подтверждено Ignarro et al. (1987) [139] и Furchgott R.F. (1988) [122], что EDRP - двухатомный свободный реактивный радикал оксид азота (NO), а Palmer et al. [165] продемонстрировали в своих работах энзиматическую продукцию эндотелиоцитами сосудов N0 из L-аргинина, подтвердив идентичность NO HEDRF.
N0 синтезируется из L-аргинина под влиянием NO-синтазы путем присоединения молекулы кислорода к конечному атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина. NO-синтаза существует в двух главных изоформах: конститутивной и индуцируемой (индуцибельной). Конститутивная NO-синтаза -кальций- и кальмодулинзависимый фермент, имеет физиологическое значение, постоянно присутствует в эндотелиальных клетках сосудов, в нервных окончаниях адвентиции сосудов, в нейронах, тромбоцитах, нейтрофилах. Количество оксида азота, синтезируемого при его участии невелико [49, 52].
Индуцибельная NO-синтаза - кальций- и кальмодулиннезависимым фермент, регулируется на генетическом уровне под влиянием провоспалительных и иммунных факторов, интерлейкина 4, тромбоцитарного фактора роста и др. Повышение синтеза NO провоцируют также эндотоксины, цитокины IL-1, TNF, IF-y [144].При этом синтезируются большие количества NO (нмоль), которые осуществляют или относительно неспецифическую защиту организма против поступающих в него инородных или опухолевых клеток, или же способствуют развитию патологических процессов [49, 52]. Некоторые авторы [107] выделяют три вида, или три изоформы, NO-синтазы (NOS) - нейрональная NO-синтаза, конститутивная (nNOS), индуцибельная NOS (iNOS), и эндотелиаль-ная NOS, конститутивная (eNOS).
Реакция окисления L-аргинина, катализируемая NO-синтазой, приводит к образованию N0 и супероксидного анион-радикала. Продукт взаимодействия N0 и супероксида - высокореактивные соединения, среди которых наиболее исследован пероксинитрит (0N00"). Пероксинитрит - сильный окислитель, способен окислять NH- и SH-группы белков, участвует в повреждающем нейроны действии при различных острых и хронических неврологических нарушениях [83, 103].
В биологических системах N0 представлен несколькими активными формами: в виде нитроксильного аниона (N0"), нитроксониевого катиона (N0+), и нейтрального свободного радикала (NO0). На их комбинацию в различных тканях оказывает влияние уровень кислотности жидкостной среды (рН) [185, 127]. Оксид азота крайне нестабильное соединение, легко растворимое в воде и липидах, обладающее высокой диффузионной способностью за счет малых размеров и нейтрального заряда. Период полужизни этой молекулы в тканях, по данным разных авторов, от 5 до 30 секунд [142, 165, 193]. Поэтому N0 не депонируется в специфических клеточных гранулах. Межклеточная коммуникация достигается путем простой диффузии, а область действия NO ограничена областью его синтеза.
Рандомизированное плацебо-контролируемое простое слепое исследование влияния димефосфона на показатели перекисного окисления липидов, антиоксидантной системы, содержание нитрит-иона при проведении острой фармакологической пробы с индометацином
Изучение изменения показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы, содержания нитрит-иона при проведении острой фармакологической пробы с индометацином у пациентов, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства, на фоне приема димефосфона (2003 год, весна, осень, часть пациентов - 2001-2002 гг.). Проведено рандомизированное исследование, в которое было включено 50 пациентов, страдающих ревматоидным артритом (РА), П-Ш степени активности, и первичным деформирующим остеоартрозом (ОА), длительно принимающие нестероидные противовоспалительные средства, находившиеся на стационарном лечении в ревматологическом отделении городской клинической больницы №1 г. Казани и терапевтическом отделении Республиканской клинической больницы №3. Стратифицированную рандомизацию1 проводили с помощью- компьютер-генерированных таблиц случайных чисел. Одна группа пациентов (30 человек) принимала димефосфон, вторая - контрольная (20 человек) - плацебо (физиологический раствор, 1 ст. л. 3 раза в день). Средний возраст пациентов 58,03+1,79 лет (от 41 до 78 лет). Из них мужчин - 14 человек, женщин - 36 человек. В исследование были включены пациенты, принимающие нестероидные противовоспалительные средства не менее шести месяцев. Группы были сопоставимы по возрасту, длительности заболевания.
Критериями исключения пациентов являлись:
наличие почечной и печеночной недостаточности,
инфаркт миокарда, аневризма аорты, сердечно-легочная недостаточность,
беременность,
сужение и рак пищевода, варикозное расширение вен пищевода,
злокачественная гипертония,
терапия гормональными препаратами, цитостатиками, иммунодепрессантами,
бронхиальная астма.
У всех пациентов, наблюдавшихся с диагнозом ревматоидный артрит, диагноз был выставлен достоверный и определенный, в соответствии с критериями АРА. Активность заболевания устанавливалась по В. Отто, М.Г. Астапенко, рентгенологическая стадия по Штейнброкеру [56].
Лабораторные методы исследования включали в себя общий анализ крови, мочи, широкий спектр биохимических показателей, позволяющих уточнить степень активности воспалительного процесса (СОЭ, СРБ, СК и др.).
У всех обследуемых в крови определяли биохимические показатели, оценивающие интенсивность антиоксидантнои системы и системы перекисногонивающие интенсивность антиоксидантной системы и системы перекисного окисления липидов: содержание глутатиона восстановленного (ВГ), окисленного (ОГ) и суммарного (СГ), активность ключевых ферментов антиоксидантной системы - каталазы, пероксидазы, уровень первичных продуктов перекисного окисления липидов - диеновых коньюгатов ненасыщенных высших жирных кислот (ДК) и вторичных продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида (МДА), содержание оксида азота.
ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Первичный осмотр, сбор анкетных данных, информированного согласия пациента,
2. Острая фармакологическая проба с индометацином (ОФПИ)
3. 2 группы больных получают лечение 7-10 дней:
1) НПВС + димефосфон (100 мг/кг/сутки в 3 приема, что соответствует 1 ст. л. 3 раза в день)
2) НПВС + плацебо (физиологический раствор, 1 ст. л. 3 раза в день)
4. Повторно ОФПИ через 7-10 дней лечения
На проведение исследования нами было получено разрешение Этического комитета Казанского государственного медицинского университета МЗ РФ (протокол заседания №4 от 14.11.2000 года).
СОГЛАСИЕ ПАЦИЕНТА НА УЧАСТИЕ В КЛИНИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ.
Ф.И.О. пациента:
1. Пациенту были полностью объяснены цель исследования, процедуры исследования и то, что он/она должен/на делать. Врач, проводящий исследование, сообщил ему/ей обо всех возможных воздействиях на здоровье и самочувствие, которые могут возникнуть в результате участия в исследовании.
2. Пациент поставил врача в известность обо всех лекарственных средствах, которые он/она принимал (а) в течение последних 28 дней, или принимает в настоящее время или собирается принимать, независимо оттого, были ли они прописаны врачом.
3. Пациент дает свое согласие полностью сотрудничать с врачом-исследователем и немедленно информировать его, если у него/нее появятся какие-либо неожиданные или необычные симптомы.
4. Пациент не будет добровольно сдавать кровь как донор в период исследования и в течение 1 месяца после завершения исследования.
5. Пациент отдает себе отчет в том, что он/она может в любой момент отказаться от участи в исследовании и что такой отказ ни в коей мере не повлияет на его/ ее дальнейшее лечение или медицинскую помощь.
6. Предполагается, что ни в каких сообщениях по данному исследованию не будет указано имя пациента или сообщено какому-либо третьему лицу. Пациент не будет уполномочен ограничивать каким-либо образом использование результатов данного исследования. В частности, пациент согласен на сообщение полученных результатов в медицинские учреждения.
Изучение изменения показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при проведении острой фармакологической пробы с индометацином у здоровых добровольцев
Биохимический анализ показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантнои системы и последующий расчет "индекса устойчивости" до и после проведения острой фармакологической пробы с индометацином в группе здоровых добровольцев позволили установить, что по характеру изменения "индекса устойчивости" обследованные здоровые добровольцы могут быть разделены на две группы, так же как и пациенты, длительно принимающие нестероидные противовоспалительные средства (Рис. 4.8.). В то время как в целом показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантнои системы при проведении острой фармакологической пробы с индометацином у здоровых добровольцев достоверно не изменялись (приложение 1.6.).
Первая группа добровольцев, в которую вошло 15 человек (50%), условно названные "уязвимыми", характеризуется исходно высоким "индексом устойчивости" до проведения острой фармакологической пробы с индометацином, который снижался после проведения пробы на 54% (приложение 1.6.). Приводим пример расчета "индекса устойчивости" до и после проведения острой фармакологической пробы с индометацином добровольца В. из 1-ой "уязвимой" группы: биохимические показатели до проведения острой фармакологической пробы с индометацином.
В целом группа "уязвимых" добровольцев характеризуется тем, что кроме достоверного снижения уровня восстановленного глутатиона на 20% по сравнению с показателями до проведения острой фармакологической пробы с индометацином, других изменений показателей перекисного окисления липи-дов и антиоксидантной системы после проведения острой фармакологической: пробы с индометацином по сравнению с исходным уровнем, не отмечалось (Рис. 4.9, приложение 1.6.).
Во второй группе здоровых добровольцев, включающей также 15 человек (50%), названных "резистентными" добровольцами, наоборот, исходно относительно низкие показатели "индекса устойчивости" достоверно повышались на 158% после проведения острой фармакологической пробы с индометацином (Рис. 4.8, приложение 1.6.).
Приводи пример расчета "индекса устойчивости" до и после проведения острой фармакологической пробы с индометацином добровольца X. из 2-ой, "резистентной" группы.
Вторая группа ("резистентных") добровольцев в целом отличается от первой изначально более высокими величинами окисленного глутатиона (на 18%) и суммарного глутатиона (на 14%) при достоверно меньшем уровне восстановленного глутатиона (на 40%). В ответ на острую фармакологическую пробу с индометацином у добровольцев второй группы снижались по сравнению с исходной (до приема индометацина) величины суммарного глутатиона на 21% и окисленного глутатиона на 24%, тогда как уровень восстановленного глутатиона достоверно повышался на 23% (приложение 1.6., рис. 4.9.).
Ответная реакция на острую фармакологическую пробу с индометацином в «уязвимой» группе в зависимости от пола
Интересные закономерности выявились при анализе характера ответа добровольцев на острую индометациновую пробу в зависимости от пола. Оказалось, что женщины первой группы ("уязвимые") имели исходно более высокий уровень "индекса устойчивости" (примерно в 2,5 раза) по сравнению с мужчинами этой же группы, что преимущественно связано с исходно повышенным примерно в 2 раза уровнем диеновых конъюгатов ненасыщенных высших жирных кислот в крови у этих мужчин. Через 3 часа после приема индоме-тацина у "уязвимых" женщин "индекс устойчивости" оставался таюке более высоким по сравнению с мужчинами этой же группы, а уровень малонового ди-альдегида на 53% ниже, чем у мужчин.
При этом после проведения острой фармакологической пробы с индометацином у мужчин "уязвимой" группы происходило более чем двукратное повышение уровня малонового диальдегида в сыворотке крови, а активность пе-роксидазы эритроцитов, наоборот, снижается более чем в два раза.
У женщин первой группы ("уязвимые") острая фармакологическая проба с индометацином приводит лишь к снижению восстановленного глутатиона на 23%, тогда как остальные оцениваемые показатели перекисного окисления ли-пидов и антиоксидантной системы достоверно не изменяются (приложение 1.7., 1.8., Рис. 4.10.).
Ответная реакция на острую фармакологическую пробу с индометацином в «резистентной» группе в зависимости от пола
Разделение по половой принадлежности добровольцев второй ("резистентной") группы позволило установить, что в этой группе исходные показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантнои системы достоверно не отличались между мужчинами и женщинами. После проведения фармакологической пробы с индометацином в "резистентной" группе и у женщин-, и у мужчин-здоровых добровольцев отмечалось повышение "индекса устойчивости". После проведения фармакологической пробы с индометацином у женщин-здоровых добровольцев "резистентной" группы в сравнении с исходными данными достоверно повышается уровень восстановленного глутатиона на 45% и снижаются уровни окисленного глутатиона и суммарного глутатиона на 27% и 23% соответственно. У мужчин-здоровых добровольцев "резистентной" группы отмечаются подобные же тенденции, но изменения не носят достоверный характер (приложения 1.7, 1.8, рис. 4.11).
Мужчины-добровольцы первой ("уязвимой") группы отличаются от мужчин-добровольцев второй ("резистентной") группы более высокой активностью каталазы как до приема индометацина, так и после проведения острой фармакологической пробы с индометацином. Женщины-добровольцы первой ("уязвимой") группы отличаются от женщин-добровольцев второй ("резистентной") группы более высоким содержанием восстановленного глутатиона, и более низким содержанием окисленного и суммарного глутатиона как до приема индометацина, так и после проведения острой фармакологической пробы с индометацином (приложения 1.7, 1.8.).
Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о высокой степени полиморфизма генов ферментов I и II фаз биотрансформации ксенобиотиков (изоферменты цитохромов Р-450, глутатион-Б-трансферазы, глутатионперокси-дазы, каталазы, N-ацетилтрансферазы, глюкуронозилтрансферазы и др.). Наличие у индивидуума того или иного полиморфного варианта может как определять значительные индивидуальные различия в метаболизме экзогенных соединений, так и рассматриваться в качестве факторов предрасположенности к не которым заболеваниям [25, 76]. Внутриклеточный окислительно восстановительный глутатионовый буфер представляет собой один из самых активных компонентов эндогенной антиоксидантной системы. Восстановлен ный глутатион устраняет избыток перекисных соединений, при этом происходит переход восстановленного глутатиона в его окисленную форму. Высокий уровень окисленного глутатиона в сыворотке крови является одним из проявлений окислительного стресса [12, 82].
Нами было показано, что острая фармакологическая проба с индометацином у больных, длительно принимающих НПВС, позволяет прогнозировать риск развития гастропатий у них. Мы показали, что предложенный нами "индекс устойчивости" позволяет выделить группу так называемых "резистентных" больных, устойчивых к гастротоксическому действию НПВС, и группу "уязвимых", у которых развитие поражений ЖКТ произойдет с высокой вероятностью. Основываясь на результатах, описанных выше, мы можем заключить, что по характеру изменения ИУ после проведения острой фармакологической пробы с индометацином, подобные две группы можно выделить и у здоровых добровольцев.
Увеличение уровня восстановленного глутатиона и снижение суммарного и окисленного глутатиона в сыворотке крови добровольцев второй группы ("резистентных") в ответ на прием индометацина свидетельствуют о хорошем антиоксидантном потенциале, осуществляющем быстрый перевод окисленного пула глутатиона в восстановленный, что, вероятно, является наследственно обусловленной характеристикой. Снижение содержания восстановленного глутатиона в ответ на введение индометацина у добровольцев первой группы ("уязвимых") свидетельствует об истощении антиоксидантной системы глутатиона. Более высокое значение "индекса устойчивости" до проведения острой фармакологической пробы с индометацином у "уязвимых" (1 группа) добровольцев по сравнению с "резистентными" (2 группа), более низкое исходное содержание окисленной и суммарной форм глутатиона на фоне более высокого исходного содержания восстановленного глутатиона у "уязвимых" (1 группа) добровольцев, очевидно, свидетельствует об исходной напряженности у них антиоксидантнои системы. Снижение "индекса устойчивости" через 3 часа после приема индометацина в группе "уязвимых" (1 группа) добровольцев, а также более высокое при сравнении с "резистентными" (2 группа) содержание окисленного и суммарного глутатиона в этой группе может отражать срыв компенсаторных механизмов антиоксидантнои защиты. Содержание конечного продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида - после приема индометацина в группе "уязвимых" (1 группа) добровольцев на 75% выше, чем у "резистентных" (2 группа), что свидетельствует об активации процессов пероксидации липидов, т.е. повышении возможности развития НПВС-индуцированных поражений ЖКТ [184].
Изучение изменения содержания нитрит-иона при проведении острой фармакологической пробы с индометацином у пациентов, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства и здоровых добровольцев
Первоначальное содержание (до приема индометацина) нитрит-иона в группе "уязвимых" добровольцев не отличалось от такового у "резистентных" добровольцев. Через 3 часа после приема индометацина у "резистентных" добровольцев содержание нитрит-иона уменьшилось на 22% от исходного уровня. Содержание нитрит-иона через 3 часа после приема индометацина у здоровых добровольцев в "уязвимой" группе было на 20% выше, чем в "резистентной" группе. При анализе типа реагирования здоровых добровольцев на индомета-циновую пробу в зависимости от пола, выявлено, что содержание нитрит-иона после приема индометацина у женщин на 21,8% выше, чем у мужчин (Рис. 4.21, приложение 1.16.).
Содержание нитрит-иона до приема индометацина у "резистентных" мужчин выше на 25% по сравнению с "уязвимыми" мужчинами. У женщин разного типа реагирования различается содержание нитрит-иона после приема индометацина: оно выше в крови "уязвимых" женщин на 24% по сравнению с "резистентными". Содержание нитрит-иона после приема индометацина выше в сыворотке крови "уязвимых" женщин (на 30,7%), чем в сыворотке крови "уязвимых" мужчин (рис. 4.22.).
Изучение изменения содержания нитрит-иона при проведении острой фармакологической пробы с индометацином у пациентов, длительно принимающих НПВС.
У пациентов, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства, прием 75 мг индометацина внутрь приводит к снижению содержания нитрит-иона в сыворотке крови на 10%. При анализе содержания нитрит-иона в зависимости от пола и типа реагирования пациентов на индометациновую пробу выявлено снижение уровня нитрит-иона в сыворотке крови "резистентных" пациентов на 11 % (по сравнению с показателями до проведения пробы с индометацином), что происходит преимущественно за счет снижения содержания нитрит-иона в группе "резистентных" женщин (на 17%). Исходное содержание нитрит-иона у "резистентных" женщин при сравнении с аналогичной группой мужчин выше на 24%0(-црижнжійшргїек7(4имефосфона в целом предотвратил снижение уровня нитрит-иона на прием индометацина и привел к более высокому содержанию нитрит-иона, как исходному (на 19%), так и после проведения пробы с индометацином (на 28%).
В группе мужчин увеличение исходного содержания нитрит-иона составило 35%. Однако после проведения фармакологической пробы с индометацином в группе мужчин произошло снижение уровня нитрит-иона на 27%, преимущественно за счет снижения содержания нитрит-иона в сыворотке крови "уязвимых" мужчин на 19%. Через 10 дней приема димефосфона превышение уровня нитрит-иона после проведения ОФПИ над аналогичным в группе "резистентных" пациентов составило 39%, у женщин - на 41% за счет "резистентных" женщин, у которых это превышение составило 54%о. После приема димефосфона ответная реакция на индометацин характеризуется более высоким содержанием нитрит-иона у женщин на 34%, что происходит из-за более высокого аналогичного показателя у "резистентных" женщин на 63% (при сравнении с "резистентными" мужчинами) (приложение 1.17.).
После 10-дневного приема плацебо ответная реакция на прием индометацина характеризуется более низким содержанием нитрит-иона в сыворотке на 17% по сравнению с аналогичными показателями до приема плацебо. В группе резистентных пациентов это различие составляет 25% (приложение 1.18., рис. 4.23.).
При сравнении уровня нитрит-иона до и после проведения ОФПИ через 10 дней лечения в группах, получавших плацебо и димефосфон, выявлены следующие различия (приложение 1.17., 1.18, рис. 4.23, 4.24.): 1) у пациентов, получавших димефосфон, исходное содержание нитрит-иона выше на 21% в целом по группе и на 24% среди "уязвимых" пациентов; после проведения ОФПИ уровень нитрит-иона у принимавших димефосфон также выше на 29% по группе в целом и на 39% среди "резистентных" пациентов.
Оксид азота является ключевым соединением в системе регуляции микроциркуляции и общепризнанным медиатором целого ряда физиологических функций. При образовании в тканях чрезмерно большого количества оксида азота он способен оказывать цитотоксическое действие на клетки организма. В то же время, недостаток оксида азота в тканях организма может стать причиной заболеваний, связанных с недостаточностью неспецифического цитопротектор-ного действия оксида азота. Так, недостаточное образование оксида азота в слизистой оболочке желудка способствует возникновению гастритов, эрозий, язв желудка. В желудке N0 синтезируется из L-аргинина как клетками эндотелия сосудов, так и эпителиальными и тучными клетками [147]. В экспериментах на животных показан антиульцерогенный эффект L-аргинина [147], донора окиси азота - сиднофарма [27].
Синтез N0 может рассматриваться как защитный механизм, направленный против цитотоксического действия фагоцитов. Это связано с ингибирова-нием NO активации нейтрофилов [154], и способностью N0 эффективно взаимодействовать с 0"2 [155], в результате чего снижается продукция Н202, 0Н ги-погалоидов. Димефосфон способствовал повышению содержания оксида азота.
Таким образом, однократный прием индометацина в дозе 75 мг (ОФПИ) снижает содержание нитрит-иона в сыворотке крови "резистентных" здоровых добровольцев, а также в сыворотке крови всех пациентов, длительно принимающих НПВС. Применение димефосфона в течение 10 дней сопровождается повышением уровня нитрит-иона в сыворотке крови пациентов, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства.
В проведенных нами исследованиях показана способность димефосфона уменьшать степень повреждения индометацином желудков крыс, снижать содержание продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови и повышать активность ферментов антиоксидантной системы крови в наших экспериментальных исследованиях.
Показано, что индометацин в варианте острой фармакологической пробы вызывает накопление диеновых коньюгатов ненасыщенных высших жирных кислот в сыворотке крови больных, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства.
Установленное нами увеличение уровня диеновых конъюгатов ненасыщенных высших жирных кислот в крови больных после приема индометацина свидетельствует об активации процессов перекисного окисления липидов.
По изменению "индекса устойчивости" к НПВС, содержанию различных форм глутатиона в сыворотке крови пациентов в ответ на острую фармакологическую пробу с индометацином, можно судить о степени риска развития осложнений со стороны желудочно-кишечного тракта при приеме нестероидных противовоспалительных средств.
Показано, что у пациентов, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные средства, димефосфон стимулирует антиоксидантную защиту организма, повышая функциональную активность внутриклеточного окислительно-восстановительного глутатионового буфера за счет повышения суммарного содержания глутатиона в крови, повышает пероксидазную активность крови, понижает уровень продуктов перекисного окисления липидов, повышает содержание нитрит-иона в сыворотке крови пациентов.
В последние годы появились сообщения, показывающие, что при длительном приеме НПВС у некоторых пациентов развивается так называемая "толерантность" к гастротоксическому действию препаратов [171, 189]. Наши исследования показали, что по сравнению с больными, длительно принимающими НПВС, здоровые добровольцы отличаются более низкими значениями "индекса устойчивости" до пробы, а также более низким содержанием диеновых конъюгатов ненасыщенных высших жирных кислот и восстановленного глутатиона и более низкой активностью пероксидазы после приема индометацина. Установленные нами различия в ответе на прием индометацина у пациентов, длительно принимающих НПВС, и здоровых добровольцев разного типа реагирования, а также различия ответной реакции систем ПОЛ-АОС мужчин и женщин, очевидно, обусловлены генетически детерминированными особенностями метаболизма ксенобиотиков и, в частности, антиоксидантной системы, отвечающей также за гастропротекцию. Наиболее чувствительным маркером биохимического реагирования ("резистентности"/"уязвимости") на индометацин является окислительно-восстановительная система глутатиона.
Таким образом, проведенные нами экспериментальные и клинические исследования обосновывают необходимость индивидуализированного, на основании типа биохимического реагирования, подхода к терапии нестероидными противовоспалительными средствами. Результаты исследований позволяют рекомендовать димефосфон в качестве средства для повышения устойчивости к повреждающему действию НПВС.
