Введение к работе
Актуальность проблемы. При решении задач, стоящих перед современной химиотерапией бактериальных инфекций, возникают две проблемы: 1) преодоление постоянно растущей устойчивости бактерий к известным антибактериальным средствам, и 2) увеличение числа патогенных микроорганизмов за счет штаммов, относившихся ранее к условно-патогенным. Это диктует необходимость поиска антибактериальных препаратов с новыми механизмами действия, в связи с чем изучение механизма антибактериального действия веществ на доклиническом этапе разработки препарата приобретает все большее значение. Определение мишени и механизма антибактериального действия позволит уже на ранних этапах исследования оценить химиотерапевтические перспективы потенциального лекарственного средства, а также прогнозировать место этого соединения на высоко насыщенном фармацевтическом рынке. Разработка адекватных моделей для изучения структурно-функциональных зависимостей соединений новых химических рядов будет способствовать проведению направленного синтеза высокоактивных антибактериальных веществ, а также может стать основой для их компьютерного моделирования.
Для фармакологических препаратов, антибактериальная активность которых является побочным эффектом, расшифровка механизмов этого эффекта позволит прогнозировать его значимость. Проведенные исследования структурно-функциональных зависимостей, базирующиеся на данных о механизме действия, а также определение фармакоформных заместителей в молекуле фармакологического препарата, ответственных за антибактериальную активность, создают предпосылки для направленного синтеза веществ, сохраняющих фармакологические свойства, но лишенных
нежелательной антибактериальной активности, или, наоборот, для создания нового антибактериального средства.
Детальное изучение механизмов действия антибактериальных препаратов проводится, как правило, на стадии внедрения препарата в практику и поз;хе Сложнейшие эксперименты с привлечением молекулярно-биологических, биохимических и других методой трудоемки и дорогостоящи, поэтому весь комплекс исследований на стадии доклинического изучения лекарственного средства обычно не проводится. Научно обоснованный и экспериментально подтвержденный выбор методо», поззолдющкх из этой стадии исследования определить мишень г> бактериальной клггхе, на которую воздействует потенциальный препарат, даст возможность ирогиозмроаять перспективу его применения в клнннхе. До последнего времени, трєбоааиуія к предоставлению данных о возможном механизме действия антибактериального препарата на этапе доклинического жныташи отсутстЕозаля. Методические рекомендации по проведению такого рода исследований представлены тольхо в одном сборнике под редакцией Г.Н. Пер'.нлна (Методы экспериментальной химиотерапии, 1971). В этом пособии гфелшххем.ч дг-а метода изучения механизма антибактериального действия сседимежііі - метод антагонизма, заключающийся d исследовании пзїтагомісгоз антибактериальной активности испытуемого соединен!",;!; л гоушшс влуіг/няіі хнміютераисатичсскнх вещестп № отдельные фгр:«еятт-іс систему. Выбор испытуемых метаболитов я ферментативных рсахций при таком подхода достаточно случаен. Развитие кодгхуллрной фг.з^опопш микроорганизмов и бактериальной генетики открыло 5 касїомдїг более широкие возможности длл систематизации нсследоваллй мехаяюмоз антибактериального деіістоия зсществ. Расширение арсенала методи1 tecхих подходов, а также необходимость соэданш конкурентоспособных антибактериальных средств, требования
современных рыночных отношений определяют актуальность разработки единых принципов изучения механизмов антибактериального действия на стадии доклинического изучения потенциальных лекарственных средств.
Целью исследовании явилась разработка методологических подходов 1С оценке механизма антибактериального действия фармакологических веществ на стадии доклинического изучения.
Задачи исследования:
-
Создание алгоритма тестирования химических соединений с целью определения механизма их антибактериального действия на примере известных антибактериальных препаратов.
-
Сравнительное изучение механизма антибактериального действия 6-фтор и 6-нитро производных 4-хинолон-З-карбоновой кислоты на основе разработанного алгоритма тестирования.
-
Углубленное изучение особенностей механизма антибактериального действия и структурно-функциональные зависимости производных 4-хинолон-3-карбоновой кислоты.
-
Выявление мишени антибактериального действия антндепрессантов - пиразидола и тетриндола, относящихся к химическому ряду пнразннокар-базолов на основе разработанного алгоритма тестирования.
-
Определение структурно-фунциональных зависимостей антибактериальной активности для соединений ряда карбазола.
Научная новизна исследования. 1. Впервые предложена схема исследования механизма антибактериального действия веществ, отличительной особенностью которой является использование генетически сконструированных и мутантных штаммов как для определения мишени действия веществ, так и для изучения их структурно-функциональных зависимостей.
-
Впервые предложено использование определение влияния веществ на скорость аккумуляции пролина и а-метилглюкопиранозида для оценки их мембранотропного действия на бактериальную клетку. С помощью этого метода выявлено влияние тиазолидиндионов на бактериальные мембраны.
-
Впервые изучена структурно-функциональная зависимость в ряду 6-нитро производных хинолон-3-карбоновой кислоты.
-
Впервые выявлены различия в механизме действия фтор- и нитропроиз-водных 4-хинолона.
-
Впервые установлена механизм воздействия антидепрессантов пиразидола и тетриндола, относящихся к химическому ряду пиразинокарбазола на бактериальную клетку. Разработаны модели для выявления структурно-функциональных зависимостей соединений ряда пиразинокарбазола и 1-аминотетрагидрокарбазола для грамположнтельных и грамотрицательных микроорганизмов.
-
Впервые выявлены фармакоформные группы, обеспечивающие высокую активность, в отношении Mycobacterium tuberculosis в ряду пиразинокарбазола и 1-аминотетрагидрокарбазола. Наиболее активными оказались соединения: 2,З.ЗаД 5,6-гексагадрс-&-адамантил-1 и-пиразино-[3,2,lj,k]Kap6a3oa (ШКИ-114) и 1-фенилэтиламино-6-циклогексил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол (Ш-1046).
Научно-практическая значимость исследования.
-
Разработана рациональная схема оценки механизма антибактериальной активности фармакологических веществ на стадии доклинического изучения.
-
Методологические подходы оценки механизмов антибактериального действия учтены в требованиях к доклиническому изучению антибакте-
риальной активности фармакологических веществ, одобренных Фармакологическим комитетом МЗ РФ в качестве официального документа.
-
Предложенная схема, а также отдельные методические подходы, были применены во Всероссийском Научном Центре по безопасности биологически активных веществ и в Институте органического синтеза Уральского отделения РАН для предварительной оценки механизмов антибактериального действия новых групп химических соединений с выраженным антимикробным эффектом. Применение разработанных в диссертационной работе методологических подходов позволило на ранних этапах исследования определить точку приложения антибактериального действия новых групп соединений.
-
Высокая антибактериальная активность и особенности механизма действия соединения РГ-10 (1-циклопропил-6-нитро-7(3-метнлпиперазинил)-1,4,дигидро-4-оксохи-нолин-3-карбоновой кислоты) с учетом его низкой токсичности, явились основанием к рекомендации этого соединения для клинических испытаний в качестве антибактериального средства.
-
Впервые выявлены фармакоформные группы в молекуле пиразинокарба-зола и аминотеграгидрокарбазола, обеспечивающие антибактериальную активность как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных бактерий.
-
Установление структурно-функциональных зависимостей активности в отношении М. tuberculosis производных пиразинокарбазола и 1-аминотетрагидрокарбазола позволило определить направление синтеза соединений с высокой противотуберкулезной активностью в ряду карбазола.
7. Существование двух сайтов связывания 4-хинолонов с молекулой гиразы, показанное в настоящем исследовании, и выявление структур в молекуле 4-хинолона, определяющих сродство к этим сайтам, открывает принципиальную возможность синтеза нового ряда соединений с антибактериальной активностью - ингибиторов бактериальной ДНК-гиразы
Апробация работы. Диссертационное исследование выполнено по
плану научно-исследовательских работ в Центре химии лекарственных
средств -Всероссийском научно-исследовательском химико-
фармацевтическом институте им. С. Орджоникидзе в 1989-1992 годах и Центрально?.! научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН в 1998- 1999 годах.
Основные положения диссертации были представлены в виде докладов и стендовых сообщений на 11 и !9 сьездах Федерации Европейских биохимических обществ в 1977, 1989 г., на Международном генетическом хонгрессе в Москве, в 1980 г., на 8 и 9 Средиземноморсхом конгрессе по химиотерапии в 1992 и 1994 годах, на 18 Международном конгрессе по химиотерапии в 1993 г., на заседаниях секции туберкулеза Всероссийского микробиологического общества в 1998 и 1999 годах, на Конгрессе "Челок;:; и лехарство" в 1998 г., на коллоквиумах и заседаниях Ученых советов ЦХЛС - ВНИХФИ и ЦШИТ РАМН, а отчетах по темам НИР ЦХЛС ВНИХФИ и ЦШШТРАМН.
Публызсашззз. По материалам диссертации опубликована 31 работа в отечественных и зарубежных научных периодических изданиях.
Струзсгура д!іссертаідз5»;шон работы. Работа изложена на 178 страницах, содержит 5 разделоз, включая "Введение", "Литературный обзор", "Экспериментальную часть", состоящую из "Общей харахтеристихи материалов и методов", четырех глав "Результатов и обсуждения", "Заключения", "Выводов" и содержит "Список цитируемой литерагуры"
В диссертационной работе представлено 24 рисунка, 15 таблиц. Список цитируемой литературы включает 245 публикации отечественных и зарубежных авторов.
Основные результаты, представленные в диссертации, получены самим соискателем и сотрудниками лаборатории экспериментальной химиотерапии инфекционных заболеваний под руководством соискателя, а также в совместных исследованиях с сотрудниками ЦХЛС ВНИХФИ профессором, д.б.н. Н.И. Фадеевой, к.х.н. Л.И. Будановой, к.б.н. Л.Ф.Стебаевой, сотрудниками института общей генетики РАМН под руководством профессора В.А. Тарасова, сотрудником института биохимии им. А.Н. Баха РАН к.б.н. В.А. Ереминым.
Бактериальные штаммы. В работе использованы штаммы Esherichia coli KI2 дикого типа, штамм KL16thy- и изогенные к нему KL164, несущий паІС мутацию и КІЛ 66, дефектный по А субъединице ДНК-гиразы (gyrA); штамм К1871, несущий температурочувствительный дефект в В субъединнце ДНК-гиразы (gyrB'!); штаммы SN15 и SN23 со сниженной проницаемостью клеточной стенки; штамм EClOOO/pJE47 (F~, Д(ргоВ-Іас) thil supE44 strA/co!El nd Ар-lac), сконструированный в институте Общей генетики РАН под руководством В.А. Тарасова для SOS-хромотеста. Кроме того, применяли штаммы дикого типа Escherichia coli АТСС25922 и Staphylococcus aureus АТСС6538р.
Среды н условия культивирования. Бактерии выращивались в жидких средах Nutrient Broth (Difco), L- бульон, среда Abbott, минимальная синтетическая среда М9 с необходимыми добавками и на агаризованных вариантах Nutrient Broth и L- бульона.
Определение антибактериальной активности веществ. Антибактериальный эффект (МИК - минимальные ингибирующие концентрации и МБК-минимальные бактерицидные концентрации, МГІК - минимальные подавляющие концентрации) определяли го общепринятой методике, а также по влиянию на рост культуры в жидкой среде, определяемой по приросту оптической плотности (ИД50 -концентрации, вызывающей 50% подавление скорости роста, определенного по приросту оптической плотности).
Накопление гетероциклических соединений в цитоплазматиче-ской и мембранной фракциях бактериальной клетки после разделения лизата центрифугированием при 16000 G на фракции фракцию. Содержание веществ во фракциях определяли методом ВЭЖХ.
Филаментацию бактериальных клеток определяли с помощью электронного микроскопирования и сравнения их длины со стандартом.
О влиянии веществ на макромолекулярные синтезы в бактериальной клетке судили по включению радиоактивно меченых предшественников макромолекул - Н3-тимидина, Н3-уридина и С14-лейцина в высокомолекулярную (кислотонерастворимую) фракцию растущей бактериальной культуры.
Индукция SOS-ответа. Индукцию SOS-ответа оценивали по абсолютным значениям активности В-галактозидазы в штамме EC1000/pJE43, инкубировавшемся в присутствии испытуемого вещества. Кроме того, для большей наглядности ДНК-повреждающего эффекта вещества, мы ввели коэффициент индукции - соотношение абсолютных значений активности фермента в присутствии ДНК-повреждающих агентов и в контрольной, неповрежденной культуре. В качестве стандартного контроля на ДНК-повреждающее действие использовали облучение культуры ультрафиолетовым светом с Л.=254 нм, 30 сек.
Уровень трансмембранного потенциала Дцц+. Об уровне трансмембранного потенциала ионов водорода судили по скорости аккумуляции |4С-пролина и МС -а-метилглюкопиранозида клетками бактерий.
Активность фосфолипаї С и D определяли на модели искусственных везикул с лецитином и лецитином и фосфатидилинозитом. Образовавшийся продукт определяли с красителем Виктория голубой R.
Статистическая обработка данных. Полученные результаты подвергались статистической обработке. Для каждой серии опытов определялась величина вероятности р, которая не превышала величины 0,001 для биохимических опытов, 0,05 - для опытов по определению длины бактериальной клетки и микробиологических исследований. Для каждой величины, предстааіенной в таблицах или на графиках, определяли коэффициент вариации.
Группы исследуемых гетероциклических соединений.
С целью отработки предлагаемой схемы в исследовании были использованы пять групп антибактериальных препаратов различной химической природы с известными мишенями - тетрациклин, сульфаниламиды, производные ди-М-окиси хиноксалина, нитрофурана и хинолон-3-карбоновой кислоты.
Для апробации предложенного алгоритма в исследованиях использовались оригинальные соединения различных химических групп, синтезированные в ЦХЛС-ВНИХФИ: нитропроизводные хинолон-3-карбоновой кислоты, производные пиразинокарбазола, среди которых были активные фармакологические препараты пиразидол и тетриндол, и производные тиазолидиндмона.
