Содержание к диссертации
Введение
I. Аналитический обзор литературы 9
1.1. Ботаническая характеристика ели 9
1.2. Интрогрессивная гибридизация видов рода Picea A. Dietr на территории России 10
1.3. Внутривидовая изменчивость
1.3.1. Эндогенная изменчивость 15
1.3.2. Половая изменчивость 16
1.3.3. Индивидуальная изменчивость
1.4. Сохранение генофонда 26
1.5. Кариологические исследования хвойных пород 29
1.6. Исследования генетической изменчивости хвойных методом электрофоретического анализа изоферментов 31
1.7. Исследования генетической изменчивости хвойных с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) 35
1.8. Идентификация популяций и потомств плюсовых деревьев 40
Выводы 45
II. Материалы, методы и объекты исследования 47
2.1. Природные условия района исследования 47
2.2. Объекты исследования 48
2.3. Методика и объём исследований
2.3.1. Ростклоновых потомств 50
2.3.2. Анализ формового разнообразия клоновых потомств по морфо-метрическим показателям шишек, семян и крылышек 50
2.3.3. Генетический анализ клоновых потомств ели 54
III. Анализ индивидуальной изменчивости клонового потомства ели в архиве клонов по морфометрическим показателям 57
3.1. Морфометрические показатели шишек ели в архиве клонов
3.2. Изменчивость семенных чешуи у клоновых потомств ели 64
3.3. Морфометрические показатели ели 71
3.4 Морфометрические показатели крылышек 78
3.5. Комплексный анализ признаков шишек, семян и крылышек 87
Выводы 96
IV. Формовое разнообразие клоновых потомств ели на объектах единого генетико-селекционного комплекса в Куженерском лесничестве 97
4.1. Анализ высоты клоновых потомств ели в архиве, отличающиеся по окраске макро- и микростробил 97
4.2. Анализ высоты клоновых потомств ели в архиве выделенных по типу ветвления 100
4.3. Анализ высоты клоновых потомств ели на ЛСП в Куженерском лесничестве 108
Выводы и предложения 114
V. Оценка клоновых потомств плюсовых деревьев елипо ДНК-маркерам 115
5.1. Изучение генетической изменчивости плюсовых деревьев ели в архиве клонов в Учебно-Опытном лесхозе Республики Марий Эл 115
5.2. Оценка уровня генетического разнообразия плюсовых деревьев елина лесосеменной плантации в Куженерском лесничестве Республики Марий Эл 120
5.3. Разнообразие генотипов клоновых потомств на лесосеменной плантации 124
Общие выводы 139
Предложения и рекомендации производству 141
Список литературы
- Эндогенная изменчивость
- Методика и объём исследований
- Изменчивость семенных чешуи у клоновых потомств ели
- Анализ высоты клоновых потомств ели на ЛСП в Куженерском лесничестве
Введение к работе
Актуальность темы. Ель широко распространена на территории нашей страны и играет важную роль в формировании структуры и функции лесных экосистем. В настоящее время под воздействием комплекса неблагоприятных факторов естественная среда обитания претерпевает радикальные изменения в течение достаточно короткого периода времени, что весьма отрицательно сказывается на состоянии еловых лесов. В связи с этим особую актуальность приобретает проблема сохранения и восстановления ельников. Организация лесного семеноводства на селекционно-генетической основе является одним из важных компонентов комплекса мероприятий по искусственному лесовосстановлению. При этом весьма актуальными являются научные исследования, позволяющие повысить эффективность лесного семеноводства и решающие такие вопросы, как оценка отобранного плюсового генофонда, служащего родоначальником будущих лесов и призванного обеспечить их высокую продуктивность и устойчивость.
Цель исследования – провести оценку клоновых потомств плюсовых деревьев ели в архивах клонов и лесосеменной плантации в Республике Марий Эл по комплексу морфологических и генетических признаков.
Задачи исследования:
-
выявить особенности изменчивости морфометрических признаков репродуктивной сферы плюсового генофонда ели в Республике Марий Эл;
-
оценить возможность использования комплекса морфометрических признаков шишек, семян и крылышек для видовой и клоновой идентификации рамет;
-
установить таксономическую принадлежность клонов плюсовых деревьев ели;
-
изучить формовое разнообразие клонов по типу ветвления и окраски стробил, оценить степень влияния данных признаков на рост;
-
выделить продуктивные биотипы для дальнейшего введения их в культуру in vitro;
-
оценить генетическое разнообразие и дифференциацию клоновых потомств плюсовых деревьев ели из разных географических районов в Учебно-опытном лесхозе РМЭ и на лесосеменной плантации Куженерско-го лесничества РМЭ.
Научная новизна работы. В районе исследования получены новые данные об изменчивости морфометрических признаков шишек, семян и крылышек у клоновых потомств плюсовых деревьев ели. Установлено количественное соотношение клонов плюсовых деревьев, относящихся к разным таксономическим группам ели: ель сибирская Picea obovatа Ledeb.,
ель финская Picea x fennica (Regel) Kom. с преобладанием признаков ели сибирской и ель финская Picea x fennica (Regel) Kom. с равнозначными признаками ели сибирской и ели европейской. Выявлены наиболее информативные морфометрические признаки для изучения индивидуальной изменчивости биотипов ели и установления систематической принадлежности деревьев ели в зоне интрогрессивной гибридизации. Получены данные о формовом разнообразии плюсового генофонда ели, представленного на объектах ЕГСК в Республике Марий Эл. Изучен характер взаимосвязей морфометрических признаков шишек и семян, роста и окраски стробил, роста и типа ветвления. В районе исследования впервые изучено генетическое разнообразие клоновых потомств плюсовых деревьев ели c использованием ISSR-маркеров.
Практическая значимость работы. По результатам исследований разработан комплекс рекомендаций по повышению эффективности организации семеноводства в Республике Марий Эл. В частности, даны рекомендации по оценке таксономической принадлежности ели при отборе плюсовых деревьев и инвентаризации существующих объектов единого генетико-селекционного комплекса в зоне интрогрессивной гибридизации. Показана ограниченность возможности идентификации клоновой принадлежности по комплексу морфологических признаков шишек, семян и крылышек. Обоснована необходимость использования для этой цели методов генетического анализа с обязательной паспортизацией материнского плюсового дерева. Показана высокая ценность исследованных объектов в отношении сохранения генетического разнообразия ели в районе исследований. Получены предварительные данные по уточнению лесосеменного районирования ели.
Положения, выносимые на защиту:
-
морфометрические признаки шишек и семян как основа оценки систематической и клоновой принадлежности биотипов ели на объектах единого генетико-селекционного комплекса (ЕГСК) в зоне интрогрессив-ной гибридизации;
-
разнообразие форм клоновых потомств плюсовых деревьев ели по окраске макростробил, типу ветвления и росту в Республике Марий Эл;
-
генетическое разнообразие и дифференциация клоновых потомств плюсовых деревьев ели на объектах ЕГСК в Республике Марий Эл.
Обоснованность и достоверность результатов работы обеспечена большим объемом полевого и экспериментального материала (изучено 387 деревьев по высоте и диаметру, 1240 штук шишек, 1120 штук семян, 330 образцов ДНК); использованием методов математического анализа при оценке результатов экспериментов (вариационная статистика, кластерный анализ, дисперсионный анализ); обработкой полученных результатов с
использованием общепринятых и специализированных программ
(Statisticа, QuantityOne (Bia-Rad), PopGen).
Апробация. Результаты научных исследований представлены в научных докладах на Международной научной конференции «Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений» (Красноярск, 2004, 2005, 2007, 2009), региональной научной студенческой конференции по естественнонаучным и техническим дисциплинам (Йошкар-Ола, 2006), Всероссийской научно-практической конференции (Уфа, 2007), Всероссийской научной студенческой конференции по естественнонаучным и техническим дисциплинам (Йошкар-Ола, 2007), научно-практическом семинаре (Воронеж, 2007), Международной научной студенческой конференции по естественнонаучным и техническим дисциплинам (Йошкар-Ола, 2008), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения д-ра биол. наук, проф. М. Д. Данилова (Йошкар-Ола, 2008), Всероссийской научно-практической конференции в рамках XVIII Международной специализированной выставки «АгроКомплекс-2008» (Уфа, 2008), научно-практической конференции «Проблемы экологии и лесопользования в современных условиях» (Йошкар-Ола, 2010), научно-практической конференции с международным участием «Достижения и перспективы лесной генетики и селекции» (Воронеж, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Лесовосстановление в Поволжье: состояние и пути совершенствования» (Йошкар-Ола, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 4 – в рецензируемых журналах из перечня ВАК.
Личный вклад автора. В диссертации использованы полевые и экспериментальные данные, полученные лично диссертантом на всех этапах работы. Автором проведены экспедиционные исследования и сбор растительного материала, лабораторные исследования по изучению морфомет-рических показателей шишек и семян, использован метод генетического анализа, основанного на ПЦР с ISSR-праймерами; обработаны полученные материалы, изложены и обобщены результаты.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа
выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках фе
деральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России» на 2009-2013 годы по направлению 1.3.2 «Прове
дение научных исследований целевыми аспирантами» (ГК
№ 14.132.21.1331 от 01.10.2012 г.) по теме «Исследование фенотипическо-
го и генетического полиморфизма плюсовых деревьев ели обыкновенной
(Picea abies L.) в Республике Марий Эл».
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов и рекомендаций, списка литературы и приложе-
Эндогенная изменчивость
Правильно понять современное разнообразие любой таксономической группы возможно при изучении истории развития её на всем протяжении жизни.
Род Picea A. Dietrich продолжает свою историю с мелового периода. За этот отрезок времени наша планета претерпела немало изменений: менялись очертания материков, менялась орография поверхности суши, наконец, менялся климат. То есть эволюция этого рода происходит в течение 100-120 млн. лет. Современные виды рода Picea, имевшие в прошлом общих прародителей и один общий ареал, в настоящее время распространены на континентах Северная Америка и Евразия. На современные ареалы видов ели, в преобладающем большинстве случаев изолированные друг от друга, решающее влияние оказал ледниковый период.
Многие виды растений (и животных тоже) занимали до ледникового периода ту же самую территорию, что и после ледника, но генетическая структура популяций, представленных этими видами, стала другая: во-первых, в результате того, что разорванность ареала на мелкие острова, на длительные геологические периоды, то есть изоляция, повлекла изменение генетической структуры популяций в результате ограниченности генотипов, участвующих в панмиксии в большом числе поколений; во-вторых, в результате естественного отбора, сохранившего те генотипы, которые оказались более устойчивыми в изменившихся условиях обитания в ледниковый период. Есть и третья причина, которая неизбежно должна была обусловить изменение генетики популяций, это - интрогрессивная гибридизация при вторичной встрече изолированных популяций при их миграции [4].
Интрогрессивная гибридизация на стыке ареалов ели сибирской (P. obovata Ledeb.) и европейской (P. abies (L.) Н. Karst.) наиболее интенсивно изучались с конца 60-х годов XX столетия. Предположения о гибридном происхождении еловых лесов, образованных этими видами и широко распространенных на территории Европы, высказывались много раньше. Впервые же эта гипотеза была сформулирована Ф. Федоровичем (1876).
К настоящему времени накоплен большой фактический материал, который убеждает в том, что между елью европейской и елью сибирской существует полная гамма переходов в изменчивости всех признаков [5]. Со времени К. Ф. Ледебура и Ф. Теплоухова, давших характеристику ели европейской и ели сибирской, большинство исследователей, изучавших изменчивость ели в пределах указанного выше ареала и на основании результатов своих исследований предлагавших внутривидовую систематику, главным и ведущим признаком считали строение и морфологию шишек, и особенно форму семенных чешуи [4, 5].
Особое внимание во второй половине прошлого века (после описания самого явления интрогрессивной гибридизации) уделялось зоне контакта и гибридного смешения ели сибирской и ели европейской. Было показано [Правдин, 1975; и др.], что Уральская горная цепь является восточной границей ареала гибридной ели финской (P. xfennica (Regel) Кот.), определяемой в этом регионе как P. obovata var. uralensis [6].
В крупной работе Д.Н. Данилова (1943) было показано, что при движении в долготном направлении от западных регионов к Уралу происходит постепенное и непрерывное усиление признаков Picea obovata Ledeb. и угасание признаков Picea abies (L.) Н. Karst. (закономерное увеличение угла заострения семенных чешуи, уменьшение размеров шишек).
О гибридогенном характере изменчивости ели свидетельствует различие формового состава ельников в горной части Урала. Если в пределах Полярного Урала еловые леса представлены одной только елью сибирской, то в остальных районах по форме семенных чешуи она постепенно меняется. По мере продвижения с севера на юг в составе популяций увеличивается участие гибридных форм var. uralensis (группа II по Л.Ф. Правдину). В южных популяциях уже отмечено участие группы III (гибриды с преобладанием признаков ели европейской). К аналогичному выводу о том, что в Удмуртии, Коми и Марийской республике, Пермской области и Башкирии произрастает гибридная ель финская, тяготеющая к ели сибирской, пришел и A.M. Пальцев (1989) на основании изучения формы семенных чешуи в географических культурах ели (по Путенихину и др.) [6].
Анализ популяции ели, произведенный Г. П. Морозовым в зоне интрогрессивной гибридизации на востоке европейской части России, показал, что прерывистый, «ступенчатый» характер группировки популяций ели на всем протяжении маршрута исследования можно объяснить постепенным проникновением генетического материала ели сибирской в генофонд ели европейской и различием векторов отбора на разных участках маршрута.
Всю зону можно разбить на ряд групп популяций: популяции ели сибирской (от Усть-Ишима на восток); зауральская группа (Тобольск-Н.Тагил); пермские ельники; кировско-костромские ельники; популяции ели обыкновенной (от Рыбинска и дальше на запад). Процесс гибридизации распространяется гораздо дальше на восток, чем принято считать. Некоторые признаки ели обыкновенной проникают до района Тобольска [7].
В Костромской области типичные формы ели сибирской и ели европейской встречаются практически на всей территории области, но первый вид более приурочен к северным и северо-восточным ее районам, а второй - к южным и юго-западным [8]. Из общего варьирования текущего прироста ельников 24% определяется фенотипом ели. При этом чем больше в фенотипической структуре ельников фенотипов с преобладанием признаков ели европейской, тем выше их продуктивность. Наиболее резкое повышение индивидуальной продуктивности (в 2,2 раза) происходит при переходе от гибридного фенотипа с преобладанием признаков ели сибирской (средний прирост древесины одного дерева 0,08 м /10 лет) к гибридному фенотипу с равным участием признаков обоих видов (средний прирост древесины одного дерева 0,19 м /10 лет).При дальнейшем насыщении фенотипа признаками ели европейской существенного роста продуктивности не наблюдаются [9].
В Кировской области вся масса гибридных форм делилась на 4 класса: 1-ель сибирская, 2 - ель гибридно-сибирская, 3 - ель гибридно-европейская, 4 - ель европейская. Ельники региона представлены этими формами в соотношении 12:47:41:0 [10].
Структура форм непостоянна и зависит от множества факторов. Главный фактор изменчивости - крупномасштабный процесс интрогрессивной гибридизации, обусловленный наличием двух гибридизирующих сторон: ели сибирской и европейской. Градиент нарастания доли сибирских форм направлен на северо-восток и равен в среднем 0,1 СКГФ на 100 км [11].
Популяционная изменчивость елей европейской и сибирской на обширных пространствах своего непрерывного ареала характеризуется большим своеобразием, обусловленным различиями процессов интрогрессии и естественного отбора. Здесь ясно выделяется ряд крупных популяционных систем, имеющих собственный ареал [12].
Методика и объём исследований
Измерения проведены у 1120 семян и крылышек. На основе этих измерений определяли соотношения (%) Up/Lw, Bw/Lw, Bs/Bw, Bs/Ls, Sw - площадь крылатки, по формуле Sw=(Bs+Bw) Lw. Все измерения проводили с помощью микроскопа МБС-10 с 2-кратным увеличением.
Все полученные данные обрабатывались методами вариационной статистики, с применением программы Microsoft Exsel. Вычислялись следующие показатели: среднее значение признака (х), ошибка среднего (Sx), среднее квадратическое отклонение (5), минимальные и максимальные значения, коэффициент вариации (V, %), показатель точности (Р, %), коэффициент достоверности различия (td) [139].
Для изучения клоновой принадлежности применялся дисперсионный анализ, для характеристики тесноты связи между двумя показателями использовался корреляционный показатель. Для распределения рамет по клонам по 15 признакам проводился кластерный анализ в программе Statistica. 2.3.3. Генетический анализ клоновых потомств ели
Объектом исследования являлись вегетативные потомства плюсовых деревьев ели, произрастающие на лесосеменной плантации в Куженерском лесничестве и на архиве клонов в Учебно-Опытном лесхозе Республики Марий Эл.
В качестве растительного материала, служащего источником ДНК, в эксперименте использовалась хвоя, которая была высушена при комнатной температуре. Выделение суммарной ДНК производилось по протоколу Doyle J.J. и Doyle J.L. [140].
Для разрушения клеточных стенок высушенные образцы помещались в пробирку вместе с металлическими шариками, далее пробирки помещали в гомогенизатор Speed Mill Plus (Analytic Jena). Измельченный образец заливали 1 мл экстрагирующего буфера 2хСТАВ, предварительно добавив в него 0,2% В-mercaptoethanol и встряхивали на вихревом смесителе 5 секунд. Далее проводили инкубацию пробирок при температуре 65С 30 минут и мягкое перемешивание. После инкубации пробирки охлаждали до комнатной температуры 24С.
Следующей операцией является добавление 200 мкл «wet» хлороформа (24 части хлороформа и 1 часть октанола). После мягкого перемешивания до однородной фазы образцы центрифугировали 3 минуты при 150000 об/мин. Очистку ДНК от протеинов хлороформом проводили 2 раза.
Далее добавляли 600 мкл охлажденного (-20С) изопрапонола, мягко перемешивали для осаждения СТАВ-нуклеинового комплекса. Смесь ставили при -4С. После 30-60 минут клубок СТАВ-нуклеинового комплекса осаждали центрифугированием в течение 20 минут при 13000 об/мин, при температуре -4С. После центрифугирования проводили очистку препарата ДНК промывочным буфером (wash buffer) при комнатной температуре в течение 1 ч.
После удаления промывочного буфера осадок ДНК растворяли в 50-100 мкл бидистилированной воды и хранили при -20С.
Полимеразную цепную реакцию проводили в тонкостенных пробирках объемом 200 мкл на амплификаторе MJ Mini Gradient Thermal Cycler (BIO-RAD). Для проведения ПЦР был использован набор реактивов «Encyclo PCR kit» (ЗАО Евроген).
Для изучения генетического разнообразия ели финской на ЛСП I порядка в Куженерском лесничестве использовали 2 полиморфных ISSR праймера, а на АК в Учебно-Опытном лесхозе - 9. Характеристика использованных в эксперименте ISSR-праймеров приведена в таблице 2.2.
Полимеразную цепную реакцию проводили в следующих условиях: реакционная смесь объемом 10 мкл содержала: 0,1 мкл Taq полимеразы (2 ед./мкл); 1 мкл ДНК-матрицы; 0,1 мкл праймера; 0,2 мкл dNTPs; 1 мкл буфера и добавляли стерильную воду 7,6 мкл.
Амплификация ISSR фрагментов проводилась при следующем режиме: 5 мин. денатурация при 94С; 0,5 мин. денатурация при 94С; 45 с. отжиг (60-65С); элонгация 45 с. при 72С; 7 мин. достройка цепей ДНК при 72С, 45 циклов амплификации.
Анализ продукта ПНР проводился при помощи электрофореза. Электрофоретическое разделение осуществляли в горизонтальной электрофоретической камере (Power Рас Universal (BIO-RAD)). Для электрофореза использовали ТВЕ буфер: трис - НС1 (рН=8,3) - 12,1 г; борная кислота - 5,1 г; ЭДТА (натриевая соль) - 0,37г; дистиллированная вода - 1000 мл. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили в 1,5% агарном геле, с добавлением этидия бромида при напряжении 70 mV в течение 2-3 часов. Перед нанесением образцов в ячейки геля к ним добавляли 5 мкл бХ-буфер (глицерин и краситель бромфенолсиний) для визуализации пробы и контроля передвижения ПЦР продуктов в геле.
Визуализацию ДНК, обработку и анализ полученных изображений проводили с помощью системы гель-документация GelDoc 2000 (BIO-RAD) с использованием программного пакета QuantityOne Version4.6.3. Наличие амплифицированных фрагментов ДНК в гелях установили по интенсивности окраски. Для дальнейшего определения длины амплифицированных фрагментов ДНК в крайние дорожки геля вносили стандарт, в качестве которого служит ДНК-маркер с фрагментами известной длины. В исследованиях в качестве стандарта использовали ДНК-маркер 100bp+1.5kb+3kb (ООО «СибЭнзим»).
ISSR-профили анализировали по наличию (1) или отсутствию (0) полос на геле, соответствующих фрагментам определенной длины, и математически обрабатывали в среде POPGENVersion 1.3.2 [141]. На основании полученных данных рассчитывали относительные частоты фрагментов. Полученные частоты ISSR-фрагментов использовали для оценки основных параметров генетической изменчивости клоновых потомств плюсовых деревьев ели. Для этого были рассчитаны следующие параметры оценки генетической изменчивости: наблюдаемое число аллелей - Na, эффективное число аллелей - Ne, общее генетическое разнообразие по Nei - Н, индекс Шеннона - I. Оценка генетической дифференциации изученных групп плюсовых деревьев проводилась на основе вычисления генетической дистанции Nei и построения дендрограммы.
Изменчивость семенных чешуи у клоновых потомств ели
Для оценки и группировки рамет по сходству признаков, представленных в архиве, произведен кластерный анализ. Для кластерного анализа использована характеристика каждой раметы по 15 признакам: по длине и ширине шишек, сырой массе одной шишки, массе 1000 штук семян, доле выхода семян из шишек, длине (Ls) и ширине (Bs) семени, длине (Lw) и ширине (Bw) крылышка, наибольшей ширине крылышка (Up) и их отношениям Up/Lw, Bw/Lw, Bs/Ls, площади крылышка (Sw). Кластеры создавались отдельно по рядам, заданное количество групп 5 (по числу клонов в ряду).
Кластерный анализ позволил сгруппировать раметы по близости представленных признаков (рисунки 3.11, 3.12, 3.13, 3.14).
Как видно из рисунков, признаки, по которым сгруппировали кластеры, отличаются. Если в 1-м и 4-м рядах признаки, характеризующие крылышки, у каждого кластера достаточно схожи, во 2-м и 3-м рядах каждый кластер по всем изучаемым показателям значительно различается.
Чаще всего в один кластер объединены раметы, расположенные в ряду в близкой последовательности. Например, во втором ряду в 4-й кластер вошли раметы 20, 21, 22, 23, 24, 27, 28, 30; в первом ряду в 3-й кластер вошли раметы 7, 8, 9, 10. В таких случаях все эти раметы можно отнести к одному клону. Но имеется и другое объединение рамет в один кластер. Например, в первом ряду в 1-й кластер вошли раметы 1, 2, 3, 33. Если раметы 1, 2, 3 расположены последовательно в одном ряду, и их можно отнести к одному клону, то рамета 33 находится в конце ряда и не может быть отнесена к этому клону (по схеме клоны расположены в архиве рядами по 10-20 штук одного клона). Подобным же образом объединены раметы 2, 3, 5, 8, 14, 15, 19, 33, 36 в третьем ряду в 4-й кластер, а раметы 2, 10, 12, 17, 18, 19 в четвертом ряду - 3 кластер. Очевидно, раметы, объединенные в один кластер, но по длине ряда расположенные на отдаленном расстоянии, не могут принадлежать к одному клону. Раметы, включенные таким образом в один кластер, характеризуются очень близкими показателями, но относятся к разным клонам.
С целью выявления наиболее информативных признаков из числа 18 изучаемых морфометрических показателей: высота, диаметр, тип ветвления, длина и ширина шишек, масса сырых шишек, масса 1000 штук семян, процент выхода семян, длина и ширина семени, длина и ширина крылышка, верхняя часть крылышка, от верхнего края до положения наибольшей ширины Up, отношение Up к длине крылышка (Up/Lw), отношение ширины крылышка к его длине (Bw/Lw), отношение ширины семени к ширине крылышка (Bs/Bw), отношение ширины семени к его длине (Bs/Ls), площадь крылышка (Sw), произведен кластерный анализ (рисунок 3.15).
Вывод. В результате кластерного анализа возможно объединение рамет в один кластер по близким показателям и отнесение их в один клон. В один кластер могут войти два клона и более, которые характеризуются близкими показателями, но по ряду расположены отдаленно друг от друга. С учетом имеющихся сведений о количестве клонов в рядах можно с некоторой долей точности отнести раметы к соответствующим клонам. Например, во втором ряду можно назвать 29, 60, 51, 62, а в пятом ряду клон 82 по расположению рамет в ряду не выделяется. Однако точно идентифицировать клоны использованный подход не позволил.
Таким образом, оценка клонов по 15 мофрометрическим показателям не позволяет произвести точную идентификацию клонов и безошибочную маркировку потомств плюсовых деревьев в архиве клонов. Следовательно, в архиве клонов не стоит заготавливать черенки, но необходимо его сохранить как объект генофонда плюсовых деревьев. Следует для точной маркировки потомств использовать такие методы, как изо ферментный и ДНК-анализ с обязательным составление генетических паспортов материнских плюсовых деревьев. 4.1. Анализ высоты и диаметра клоновых потомств ели в архиве клонов, отличающихся по окраске макро- и микростробилов
В архиве клонов ели в 24-летнем возрасте представлено 136 рамет 20 клонов. Во время цветения у рамет выделены формы по окраске макро- и микростробилов: ярко-красношишечная, красношишечная и зеленошишечная. Осенью при измерении высоты и длины окружности ствола у каждой раметы определены типы ветвления: гребенчатый, неправильно-гребенчатый, компактный, щетковидный и плосковетвистый.
У форм ели, выделенных по окраске макростробилов, наибольшую высоту имеют зеленошишечная и ярко-красношишечная формы, соответственно, 7,4 м и 7,2 м. Достоверно меньшая высота (td=2,l) оказалась у ели с красношишечной окраской макростробил при вероятности достоверности различия 0,95. Изменчивость высоты у ярко-красношишечной и красношишечной форм значительная (V=20,l%), а у зеленошишечной формы - умеренная (V=9,3%). При этом максимальное значение высоты у ели яркокрасношишечной - 10,0 м, а минимальная высота отмечена у красношишечной формы - 2,5 м.
Диаметр ствола у рамет варьирует от 4,1 до 24,2 см (таблица 4.1). По величине диаметра ствола раметы также отличаются значительно, минимальный диаметр ствола 4,1 см отмечен у красношишечной формы ели, а максимальный диаметр ствола 24,2 см - у ярко-красношишечной формы ели. Диаметр ствола у ярко-красношишечной и красношишечной форм составляет 11,9 и 11,8 см, чуть меньший диаметр ствола у зеленошишечной формы 11,2 см, но эти отличия не достоверны (td=0,54).
По данным дисперсионного анализа можно сделать вывод (таблица 4.2), что форма ели по окраске макростробил не влияет на показатели высоты и диаметра ствола. Это подтверждает данные В.И.Пчелина о том, что достоверные различия роста в высоту, по диаметру и объему ствола у форм ели по окраске макростробил не установлены [16].
Анализ клонов, отличающихся по типу ветвления, показал, что они представлены в архиве в следующих соотношениях: щетковидная - 42%, компактная - 26%, гребенчатая - 9%, неправильно-гребенчатая - 6%, плосковетвистая - 17%. Клоны, отличающиеся по типу ветвления, имеют неодинаковую среднюю высоту, которая варьирует от 6,3 до 8,0 м (таблица 4.3, рисунки 4.3, 4.4, 4.5).
Анализ высоты клоновых потомств ели на ЛСП в Куженерском лесничестве
Молекулярно-генетический анализ ДНК с использованием ISSR-метода показал, что самые высокие значения уровня генетического разнообразия наблюдаются у групп плюсовых деревьев из Республики Марий Эл и Нижегородской области, у которых уровень генетической изменчивости соответствует видовому уровню. Так, например, генетическое разнообразие по Nei (Н) в целом для всех изученных плюсовых деревьев составиляет 0,283, в то время как у плюсовых деревьев из Республики Марий Эл - 0,270, а из Нижегородской области - 0,286. Для плюсовых деревьев из Удмуртской Республики, Пермского края и Кировской области установлен более низкий уровень генетического разнообразия. Для этих групп плюсовых деревьев генетическое разнообразие по Nei (Н) составляет от 0,168 до 0,199, а индекс Шеннона (I) - от 0,261 до 0,299.
Коэффициент подразделенности популяций (Gst) показывает, что на межпопуляционную компоненту генетического разнообразия ели приходится 21,5% разнообразия, то есть изученные группы плюсовых деревьев сильно дифференцированы. Для оценки генетической дифференциации клоновых потомств плюсовых деревьев ели разного происхождения рассчитана генетическая дистанция (таблица 5.3), и на основании невзвешенного парно-группового метода построена дендрограмма (рисунок 5.2).
Пермский край 0,0714 0,0820 0,1934 0,0430 Все пять происхождений ели генетически дифференцированы друг от друга, при этом наиболее генетически удаленными являются группы плюсовых деревьев из Республики Марий Эл и Удмуртской Республики (0,1195). Наименьшее генетическое расстояние наблюдается между деревьями ели из Республики Марий Эл и Нижегородской области (0,0328).
Дендрограмма показывает, что изученные группы плюсовых деревьев можно разделить на три кластера: 1 - плюсовые деревья из Республики Марий Эл и Нижегородской области; 2 - плюсовые деревья из Кировской области и Пермского края; 3 - плюсовые деревья из Удмуртской Республики. Однако, несмотря на то что между изученными происхождениями установлены генетические различия, из 168 полученных фрагментов ДНК не выявлено ампликонов, присутствующих только в одной группе и отсутствующих в других.
Дендрограмма, построенная на основании коэффициентов генетической дистанции Nei, показывающая степень генетической дифференциации клоновых потомств плюсовых деревьев ели разного географического происхождения Таким образом, вычисленные на основе ISSR-анализа значения генетических параметров позволяют говорить о том, что изученные плюсовые деревья ели отличаются по уровню генетического разнообразия и имеют существенную генетическую дифференциацию. В соответствии с действующим лесосеменным районированием, все изученные районы могут быть поставщиками семян друг для друга [146]. В связи с этим обращает на себя внимание обособленность группы плюсовых деревьев из Удмуртской Республики. На данном этапе из-за ограниченного количества потомств из исследованных районов не представляется возможность рекомендовать ограничение на переброску семян из Удмуртской Республики. Для решения этого вопроса необходимы целенаправленные и более масштабные исследования популяционной структуры ели в пределах Удмуртской Республики, Республики Марий Эл, Нижегородской и Кировской областей и Пермского края.
Нижегородской области характеризуются высоким уровнем генетического разнообразия. Для данных групп установлены значения генетических параметров, сопоставимые с видовым уровнем. Так, наблюдаемое число аллелей плюсовых деревьев из РМЭ и Нижегородской области составиляет для соответственно 1,911 и 1,887 при общем значении по виду 1,970; эффективное число аллелей - 1,441 и 1,484 при общем значении по виду 1,463; генетическое разнообразие по Nei - 0,270 и 0,286 при общем значении по виду 0,283; индекс Шенона - 0,418 и 0,433 при общем значении по виду 0,439. Для групп плюсовых деревьев из Удмуртской Республики, Пермского края и Кировской областей установлено более низкое генетическое разнообразие: наблюдаемое число аллелей - 1.554, 1.577 и 1.542; эффективное число аллелей - 1.341, 1.272 и 1.286; генетическое разнообразие по Nei - 0.199, 0.168 и 0.172; индекс Шеннона 0.299, 0.261 и 0.264 соответственно по регионам.
Генетическая дистанция между проанализированными группами плюсовых деревьев варьирует от 0,0328 до 0,1195, при этом наиболее генетически удаленными являются группы плюсовых деревьев из Республики Марий Эл и Удмуртской Республики, а наименьшее генетическое расстояние наблюдается между плюсовыми деревьями ели из Республики Марий Эл и Нижегородской области. Проанализированные группы плюсовых деревьев можно разделить на три кластера: 1 - плюсовые деревья из Республики Марий Эл и Нижегородской области; 2 - плюсовые деревья из Кировской области и Пермского края; 3 - плюсовые деревья из Удмуртской Республики. Генетическая обособленность деревьев из Удмуртской Республики делает целесообразным проведение исследований по актуализации действующего лесосеменного районирования.
Оценка уровня генетического разнообразия плюсовых деревьев ели на лесосеменной плантации в Куженерском лесничестве Республики Марий Эл Объектом исследования являются вегетативные потомства плюсовых деревьев ели, произрастающие на лесосеменной плантации в Куженерском лесничестве Республики Марий Эл. Лесосеменная плантация создана в 1982 году посадкой привитых саженцев. Прививка саженцев производилась черенками плюсовых деревьев из нескольких лесхозов Республики Марий Эл. На данной лесосеменной плантации представлено 17 клонов, 270 рамет плюсовых деревьев, размещенных согласно схеме смешения.
По результатам ISSR-анализа ДНК, выделенной из хвои вегетативных потомств плюсовых деревьев ели, установлено, что два ISSR-праймера позволяют определить 41 амплифицированный фрагмент ДНК, из которых 18 фрагментов приходится на (CA)6RY и 23 фрагмента на (AG)8YT (таблица 5.4). В среднем при ISSR-анализе у ели обыкновенной праймер инициировал амплификацию 21 фрагмента ДНК.