Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1 Вегетативное размножение хвойных пород.
1.2 Современное состояние исследований культуры клеток и тканей растений in vitro .
1.3 Микроклонирование хвойных растений.
1.4 Каллусогенез, ризогенез и морфогенез в культуре in vitro.
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть
3.1 Выживаемость черенков некоторых хвойных пород в условиях in vivo.
3.2 Влияние рост регулирующих веществ на приживаемость черенков некоторых хвойных пород в условиях in vivo .
3.3 Каллусогенез и ризогенез в условиях in vivo.
3.4. Подбор условий стерилизации черенков для выращивания в условиях in vitro .
3.5 Влияние сроков черенкования и регуляторов роста на жизнеспособность черенков.
3.6 Микроразмножение секвойядендрона гигантского (Sequoiadendron qiqantеum Lindl.) и биоты восточной (Biota orientalis L.) in vitro .
3.7 Каллусогенез, морфогенез и рост меристемы секвойядендрона гигантского и биоты восточной в условиях in vitro.
Заключение
Выводы
Список использованной литературы
- Современное состояние исследований культуры клеток и тканей растений in vitro
- Влияние рост регулирующих веществ на приживаемость черенков некоторых хвойных пород в условиях in vivo
- Подбор условий стерилизации черенков для выращивания в условиях in vitro
- Микроразмножение секвойядендрона гигантского (Sequoiadendron qiqantеum Lindl.) и биоты восточной (Biota orientalis L.) in vitro
Современное состояние исследований культуры клеток и тканей растений in vitro
Большие успехи в биологии растений достигнуты методами культуры клеток и тканей. Во многих работах отечественных и зарубежных учёных
( Уайт, 1949; Бутенко, 1964; Глеба, Сытник, 1984; Pierik, 1987; Болвелл, Вуд и др., 1989) подробно описана история развития исследований по культуре клеток и тканей. Этими же авторами обсуждены проблемы культивирования клеток и тканей различных растений in vitro, что зависит от ряда факторов. Это, в первую очередь, реакция генотипа, возраст, физиологическое состояние и условия выращивания материнского растения, возраст органа или ткани, сезон года, расположение экспланта на растении, размер экспланта, режим выращивания и т.п.
Методы биотехнологии растений основываются на уникальной способности соматических клеток растений – их тотипотентности, т.е. восстановлении целостности живого организма из отдельной соматической клетки.
Для доказательства тотипатентности отдельной изолированной клетки необходимо было провести серию экспериментов, включающую: а) изоляция отдельных клеток; б) размножение изолированной клетки; в) выращивание целого растения из отдельной изолированной клетки. Объектами культуры in vitro могут быть клетки и ткани, взятые из различных частей растений. Наиболее часто выращивают в изолированной культуре прокамбиальные части стебля, ткани, содержащие первичный и вторичный камбий, ткани завязи, первичные меристемы стебля и корня. Значительно реже встречаются указания на культивирование in vitro тканей лепестков цветка, листьев, пыльников. Трудным объектом в смысле проявления тотипотентности у многих растений оказались клетки зелёных листовых пластинок, для злаковых изолированные протопласты. Среди высших растений однодольные растения считаются наиболее трудными объектами биотехнологии культуры клеток и тканей, по сравнению с двудольными. Нужно отметить, что ограниченным в культуре in vitro является использование голосеменных. Некоторые трудности возникают также при культивировании соматических клеток и тканей многолетних растений (Pierik, 1987; Болвелл, Вуд и др., 1989).
Оздоровление вегетативно размножаемых растений от патогенов путём культуры апикальных меристем, каллусов и тканей является одним из наглядных примеров применения методов биотехнологии в практике сельского хозяйства. В работах некоторых исследователей (Camaron, 1950; Бутенко, 1964; Paul, 1970; Street, 1973; Kruse, Patterson, 1973; Quak, 1977; Wang,1983; Г.С. Муромцев и др., 1988 и других) подробно описана техника культуры меристем, которая заключается в вычленении верхушки стеблей или меристемных клеток и их культивирование на питательной среде в асептических, регулируемых искусственных условиях.
По данным Р.Г. Бутенко (1985), практически любую часть растения можно успешно культивировать in vitro и получить регенераты, если эксплант отобран на соответствующей стадии развития. Незрелые ткани и органы всегда более пластичны с точки зрения способности к морфогенезу in vitro, чем зрелые ткани и органы. Более того, при выборе материала следует отдавать предпочтение меристематически активным тканям и органам, поскольку они удобнее при клонировании, легче выживают в культуре, обладают большой скоростью роста и тотипотентностью.
Выбор экспланта зависит от вида используемого растения. Немаловажное значение могут иметь сезон года, фазы развития родительского растения при определении реакции экспланта, что в свою очередь зависит от того, из какого органа растений эксплант вычленен (Болвелл, Вуд и др., 1989). Отдельные генотипы различаются коэффициентом размножения, способностью к дифференциации побегов, требованиями к длине светового дня, к питательным средам и их составным частям, в частности к гормонам (Бутенко, 1985; Pierik, 1987).
С удалением верхушки наблюдалось более усиленное образование дополнительных побегов груши и сливы. У цитрусовых экспланты, вычлененные из средней части побегов, образовали большой процент почек, чем из базальной почки. Экспланты эпикотиля и корня, вычлененные из участков проростка апельсина возле семядольного узла, имели больше почек, чем экспланты из дистальных участков (Campbell, Durzan, 1975; Norton, 1986).
Наиболее пригодными при размножении древесных растений считаются ювенильные ткани. Так, при микроклональном размножении хвойных используют проростки, зародыши и их фрагменты, ткани сеянцев (Aitken, 1981; Amerson, 1985; Biotechnology of perennial fruit crops, 1993).
Специальных исследований по влиянию сезона на регенерационную способность древесных растений немного, и они указывают на то, что оптимальные сроки изоляции эксплантов не одинаковы у разных видов. На это указывают немногие специальные исследования по влиянию сезона на регенерационную способность древесных растений. У ряда растений (яблоня, груша, ель, персик) побеги лучше развиваются из почек, отобранных в декабре – феврале, то есть в период покоя, когда ещё не начался активный рост (Dane, 1979; Selby, Harvey, 1985). У почек ели, изолированных в апреле – мае, уменьшается жизнеспособность, увеличивается количество некрозов тканей, падает способность к закладке вегетативных почек и формированию из них побегов.
Влияние рост регулирующих веществ на приживаемость черенков некоторых хвойных пород в условиях in vivo
Объект исследования: для вегетативного размножения в условиях in vivo использовались представители местных и интродуцированных хвойных пород, в частности: кипарисовник Лавсона, туя западная, туя складчатая, пихта испанская, можжевельник экселза (высокий), можжевельник зеравшанский, кипарис аризонский, секвойядендрон гигантский и биота восточная.
Для микроразмножения в условиях in vitro были отобраны следующие представители хвойных растений: Sequoiadendron giganteum Lindl. (Секвойядендрон гигантский) и Biota orientalis (L).Endl. (Биота восточная. Секвойядендрон – одна из ценных и редких пород хвойных, фитонцидное, эфироносное, привлекательное для животных, птиц и насекомых дерево. Очень красивое декоративное растение с оригинальной монументальной кроной, в молодости пирамидальной, идущей от земли, в зрелости поднятой на высоту до 50 м. Особенно привлекательна голубовато-зеленая (до пепельно-сизой) окраска хвои и стройная плотная крона. Как декоративное дерево разводится во многих странах мира. Оно пригодно для биоконструкций. Секвойядендрон гигантский тяжело выращиваемое растение, размножается преимущественно семенами, но возможно и черенковое размножение. Деревья начинают плодоносить в 20 лет, при этом шишки могут оставаться на дереве в течение 8-12 лет, большая часть семян обладают всхожестью. Семена полностью высыпаются только тогда, когда шишка падает с дерева. В каждой шишке содержится до 230 семян, но они обладают слабой всхожестью (1-5%), поэтому именно этот объект стал ключевым в наших исследованиях.
В качестве экспланта были использованы апикальные побеги и меристема взрослых растений. Объекты исследования были собраны в саду Таджикского аграрного Университета. Методы исследований.
Для вегетативного размножения хвойных пород в условиях in vivo черенки кипарисовика Лавсона и кедра гималайского взяты с деревьев, произрастающих в центральном ботаническом саду. В качестве эксплантов использовали верхушечные сегменты стебля различной длины от 3-5 до 15-20 см. Предварительно черенки перед посадкой обмывали 2-3 мин слабым раствором перманганата калия. Черенки для посадки подготовили, срезая нижние веточки и верхушку роста, и сажали в кюветы и ящики с грунтом.
Кюветы засыпали почвой, приготовленной в соотношении почва с песком (3 см почва + 2 см песка). Ящики заполняли грунтом, следующим образом: дырочки дна ящика прикрывали веточками, засыпали песком, затем слой земли и опять песок, после чего засыпали листовой землей, навозом, землей дёрн и просеянным песком (1:1:1). Грунт залили водой до полного всасывания воды. Черенки в ящики с грунтом рассаживали рядами под небольшим наклоном (углом) на заранее приготовленные ямки на расстоянии 1-2 см друг от друга, глубиной не более 5 см.
В каждом опыте с различными видами хвойных было высажено от 40 до 100 черенков. Отдельные опыты продолжались в течение года. Варианты опыта были следующие: Опыт 1. Приживаемость черенков некоторых хвойных пород в условиях in vivo. Вегетативное размножение хвойных пород проводилось с различными видами хвойных в парниках холодного типа. В вариантах опыта использовали 40-75 черенков. Опыт 2. С целью ускорения процесса укоренения и роста черенков в условиях in vivo было испытано влияние различных концентраций ИМК (0,005%; 0,01%; 0,03%; 0,05%) и гетероауксина (0,005%; 0,01%; 0,02%). Обработка черенков проводилась в течение определенного времени (от 2-3 ч до 24 ч) до посадки черенков в грунт. Для поддержания умеренной и ровной влажности грунта гряды теплиц и парников, а также ящики и кюветы для черенкования были хорошо дренированы. После высадки черенков в кюветы и ящики, кюветы помещались в культуральную комнату, а ящики переносились на опытный участок. В каждом варианте опыта было по 25 - 75 черенков. Повторность всех опытов была 3-х кратная. Опыт 3. Для получения большего количества укорененных черенков были использованы различные виды черенков: 1. черенки «с пяткой»; 2. черенки «с пяткой» и разгрузкой верхушечного побега; 3. черенки с кусочком старой древесины; 4. черенки без «пятки» с повреждённой древесиной. Опыт 4. Подбор эффективной среды для стерилизации черенков хвойных. Использованы различные химические реагенты: этиловый спирт, диацид, меркурий хлорид, мыльный раствор, раствор белизны. Подбиралась концентрация реагента, последовательность воздействия и длительность выдерживания черенков в каждом отдельно взятом реагенте.
Опыт 5. Для выращивания меристем в условиях in vitro питательная среда МС была модифицирована следующим образом: количество микросолей - 1 увеличили в два раза (20 мл), ИМК была заменена раствором кинетина и гибберелловой кислотой (0,01 г в 100 мл воды) в количестве 10 мл и 20 мл на 1 литр раствора соответственно.
Ежемесячно экспланты переносили на свежую питательную среду и еженедельно оценивали их жизнеспособность, рост и развитие. Опыт 6. Для культивирования эксплантов в условиях in vitro использовались искусственные питательные среды приготовленные на основе минеральных растворов по Мурасиге и Скугу (Murashige, Skoog, 1962).
Подбор условий стерилизации черенков для выращивания в условиях in vitro
Большое влияние на укоренение черенков оказывают сроки черенкования. Оптимальный период для зеленого черенкования всех видов – период активного роста побегов. Черенкование можно проводить в разные сезоны года, но его сроки должны совпадать с определенными фазами развития растений. Существуют определенные сроки, когда побеги обладают наибольшей способностью к укоренению: весной до начала роста, т. е. в фазе набухания почек (она приходится в умеренной зоне на конец апреля), либо летом (в июне) в период интенсивного роста. В этот период хорошо укореняются формы туи, можжевельника, кипарисовника, тиса, а также в период окончания роста побегов и начала одревеснения, наиболее благоприятные для укоренения форм ели летом (в августе), либо осенью (сентябрь - ноябрь) - одревесневшими черенками.
Для хвойных растений наиболее лучшим является весеннее черенкование, при котором значительная часть черенков укореняется в первый год, тогда как при летнем черенковании в первый год образуется лишь каллус, массовое укоренение происходит на второй год. Различные формы хвойных растений имеют разную продолжительность периода укоренения: от 1 до 4,5 месяцев. Рост и развитие черенков различных видов протекают по-разному. Так, у ели и лиственницы вначале образуются верхушечные побеги, затем корни, у сосны - одновременно и побеги, и корни, у можжевельника образование корней опережает появление побегов. Образование каллуса и корней происходит также в различные сроки. У форм ели и сосны в первый год появляется каллус, во второй год - корни.
При весеннем черенковании поддерживается относительная влажность воздуха свыше 70%, при летнем - до 80%. При черенковании весной минимальная температура воздуха от +4 до +7 С, максимальная - в июле -августе от +21 до +34 С. Для определения жизнеспособности черенков секвойядендрона гигантского при их выращивании в условиях in vitro были разработаны искусственные питательные среды на основе среды Мурасига Скуга и подобрана наиболее эффективная среда для выращивания данной породы.
На первом этапе наших опытов проводили стерилизацию материала следующим образом: экспланты обрабатывались в течение 5 мин 75%-ным этиловым спиртом, затем промывались 3-5 кратно по 2 мин стерильной дистиллированной водой.
В качестве первичных эксплантов использовали верхушечные сегменты стебля исследуемого секвойядендрона гигантского различных размеров (от 0.3 см до 3.0 см). Готовый растительный материал помещали в пробирки с питательной средой и ставили в культуральную комнату. Для выращивания эксплантов использовали питательную среду по прописи МС, а в качестве физиологически активных веществ были использованы реагенты (2,4Д, НУК, гетероауксин), взятые в различных концентрациях.
С целью выявления наиболее оптимальных сезонов взятия черенков для вегетативного размножения секвойядендрона гигантского, в условиях in vitro проводилось значительное число опытов в различные сезоны года. Для этого было отобрано по 100 шт. черенков секвойядендрона гигантского, которые помещали в пробирки с искусственной питательной средой и ставились в светотрон при фотопериоде 16 ч. день и 8 ч. ночь, при температуре 22-24С.
Результаты наблюдения показали, что длительность сохранения жизнеспособности черенков секвойядендрона гигантского в условиях in vitro в светотроне зависит от сроков черенкования. В этой серии опытов более продолжительно сохранялись черенки, взятые поздно осенью (2009). Эти черенки сохранили свою жизнеспособность в течение 89 дней (таблица 3.5.1).
Продолжительность сохранения жизнеспособности черенков определялась в течение 4-х лет. Результаты оказались самыми различными в разные сезоны года. Так, в 2009 году черенки, взятые в осенний сезон, сохраняли жизнеспособность более длительный период, до 138 дней. Процент сохранившихся черенков за этот срок достигал 66.7-73.3%, однако укоренения черенков не происходило. Весенние сроки черенкования показали, что в начале весны 70,9% черенков способны сохранять жизнеспособность в течение 86 дней без образования корешков, а в конце мая черенки за очень короткий срок (18 дней) погибли.
В 2010 году повторно были проведены исследования по продолжительности и определению процента жизнеспособности черенков в различные сезоны года. Оказалось, что весной черенки сохраняют жизнеспособность до 78.8%, однако в конце второго месяца весны очень быстро, за 28 дней, погибают. В первый месяц весны результаты 2010 года подтверждает показатель предыдущего года. Результаты осенних сроков черенкования в 2009 и 2011 годах показывают, что продолжительность жизни черенков составляет более 4-х месяцев.
Микроразмножение секвойядендрона гигантского (Sequoiadendron qiqantеum Lindl.) и биоты восточной (Biota orientalis L.) in vitro
Секвойядендрон гигантский (Sequoiadendron giganteum Lindl.) интродуцированное растение, в Таджикистане широко используется в качестве солитёра в парках отдыха, для оформления фасада зданий, в зоне озеленения при административных зданиях и т.д. Как и все хвойные размножается в основном семенами. Однако, сроки семенного плодоношения интродуцированных растений секвойядендрона весьма длительны. Наиболее эффективным способом быстрого размножения хвойных пород является использование современных методов на основе биотехнологии. Поскольку в настоящее время методы по ризогенезу хвойных в условиях in vitro не отработаны, это требует поиска новых подходов.
Одним из этих методов, с помощью которых можно будет ускоренно размножать ценные формы лесных древесных растений, сохраняя их генетическую идентичность, является микроклональное размножение in vitro. Для этого необходимо разработать технологию эффективного микроклонального размножения in vitro секвойядендрона гигантского (Sequoiadendron giganteum Lindl.) и биоты восточной (Biota orientalis L.).
По нашим сведениям работ по регенерации в условиях in vitro перечисленных хвойных пород недостаточно. Кроме того, регенерация этих растений in vitro не проста. Поэтому, возникает необходимость поиска новых способов, способствующих процессу регенерации данных видов.
Для этого был продолжен поиск эффективного способа стерилизации черенков секвойядендрона и биоты. В связи с этим было испытано несколько вариантов стерилизации: - мыльный раствор–дистиллированная вода–раствор белизны автоклавированная вода-70%-ный этиловый спирт - автоклавированная вода; - диацид – вода – 96% этиловый спирт – вода; - стерилизация раствором меркурий хлорид, 0.1% - 15 минут -промывание автоклавированной водой 3 раза по 5 минут, 70%-ный этиловый спирт - 15 секунд - промывание автоклавированной водой 2 раза по 2 минуты. В первых двух вариантах стерилизации черенки быстро пожелтели и погибли. В третьем варианте была обеспечена 100%-ная стерилизация черенков секвойядендрона гигантского и биоты восточной. В наших исследованиях растения размножали на питательной среде Мурасига-Скуга (МС), содержащие различные компоненты. В качестве экспланта использовали черенки первого года роста взрослых растений. К питательной среде МС были добавлены: тиамин – 10.0мг/л; пиридоксин – 5мг/л; никотин – 10 мг/л; аскорбиновая кислота – 10 м/л; микроэлементы FeS04 – 0,550 г/л; ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота – 0.745г/л. Питательная среда МС содержала фитогормонов в различной комбинации. В частности: 6-бензиламинопурин -(6-БАП) – 1 мг/л; индолилмасляная кислота (ИМК) – 2 мг/л; кинетин – 3 мг/л; нафтилуксусная кислота (НУК) – 1 мг/л; гибберелловая кислота (ГК) – 1 мг/л и 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) – 3 мг/л.
Подготовка исходного материала производились следующим образом: апикальные побеги первого года взрослых растений секвойядендрона гигантского и биоты восточной длиной 0.8-1 см были изолированы весной в период вегетации. Черенки после стерилизации были посажены в разные варианты питательной среды. В состав испытанных питательных сред входили реагенты в следующих комбинациях: 31.05.12
Исследования по укоренению черенков секвойядендрона гигантского и биоты восточной проводились в разной комбинации всех выше перечисленных компонентов, однако такие составы питательной среды оказалась не пригодными для укоренения черенков хвойных.
В связи с этим продолжались поиски нового состава с гормональной добавкой. В результате был разработан новый состав гормональной добавки к питательной среде Мурасига Скуга среда № 1: МС + кинетин (0,1мг/л) + нафтилуксусная кислота (НУК) (2мг/л) + поливинилпирамидол (ПВП) (1г/л);
Среда №2: МС + индолилмасляная кислота (ИМК) (1мг/л) +ПВП(1г/л). Из этих двух испытанных вариантов питательной среды с добавлением гормонов, первый оказался благоприятным для ризогенеза черенков секвойядендрона гигантского и биоты восточной в условиях in vitro. Субкультивирование проводили в новой питательной среде соответственно схеме, изображенной на рис. 3.3.
Согласно этой схеме за весь период эксперимента черенки пересаживались 3 раза. В ходе эксперимента часть черенков образовали каллус после второго субкультивирования, а другая часть, после очередного третьего пассажа образовала корни. Культивирование проводилось при 16-часовом фотопериоде и температуре 23-25 С. Пересадка эксплантов на свежие питательные среды проводилась ежемесячно. После 3-х пассажей образовавшиеся множественные побеги изолировались с экспланта и пересаживались на свежую питательную среду. При дальнейшем культивировании микропобегов наблюдались процессы роста черенков, процессы каллусогенеза и ризогенеза. На рис. 3.3 изображены все последовательные этапы культивирования черенков секвойядендрона гигантского и биоты восточной в условиях in vitro.
В новом составе питательной среды процесс корнеобразования у секвойядендрона гигантского произошел на 110-ый день выращивания после неоднократного пересаживания, а начало ризогенеза у биоты восточной наблюдалось уже на 40 день после второго пассажа (фото 6, 7).