Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы 10
1.1. Возможность использования компактина - природного ингибитора биосинтеза холестерина, в качестве биопестицида против фитопатогенов
1.1.1. Открытие первых представителей класса статинов -компактина и ловастатина 12
1.1.2. Физико-химические свойства компактина 13
1.2. Биосинтез стеринов 15
1.3. Биосинтетическая активность культур грибов и способы ее повышения 19
1.3.1. Фазы роста грибов 21
1.3.2. Питание и культивирование грибов 22
1.4. Мутагенез - метод получения высокопродуктивных штаммов
1.4.1. Получение мутантов 30
1.4.2. Методы отбора мутантов с повышенным уровнем продукции
Глава II Материалы и методы 37
2.1. Материалы 37
2.2. Методы 39
Результаты исследований и их обсуждение 52
Глава III Изучение влияния компактина на фитопатогены 51
3.1. Влияние предпосадочной обработки клубней картофеля компактином на развитие фитофтороза 51
3.2. Изучение фунгицидных свойств компактина 54
3.3. Влияние компактина на прорастание спор гриба stagonospora nodorum 57
3.4. Изучение действия компактина на устойчивость пшеницы к возбудителю септориоза {st. Nodorum) 58
Изучение действия компактина на устойчивость пшеницы 3.5. 61
К возбудителю ржавчины {puccinia graminis)
3.6. Влияние компактина на устойчивость табака к вирусу табачной мозаики при искусственном заражении 62
3.7. Изучение действия компактина на устойчивость к грибу alternaria longipes 64
3.8. Оценка действия компактина на устойчивость картофеля к х-вирусу при искусственном заражении 67
Глава IV Повышение активности гриба penicillium citrinum - продуцента компактина методом последовательного индуцированного мутагенеза и оптимизация условий культивирования 70
4.1. Оптимизация ферментационной среды для мутанта 18-12.. 73
4.2. Оптимизация условий культивирования мутанта 18-12 81
4.3. Определение кривой выживаемости клеток мицелия гриба p. Citrinum в зависимости от дозы мутагена 854
4.4. Влияние концентраций спор гриба в посевном материале на биосинтез компактина штаммом 20-01 86
4.5. Сравнение продуктивности штаммов 18-12, 20-01 и 21-34
На исходной и оптимизированной средах 87
4.6. Оптимизация агаризованной среды 88
4.7. Сравнение методик экстракции с помощью этилацета и с использованием ацетона 89
Заключение 90
Выводы 92
Список опубликованных работ по теме диссертации 93
Библиографический список использованной
Литературы 95
- Физико-химические свойства компактина
- Влияние компактина на прорастание спор гриба stagonospora nodorum
- Изучение действия компактина на устойчивость к грибу alternaria longipes
- Влияние концентраций спор гриба в посевном материале на биосинтез компактина штаммом 20-01
Введение к работе
Современное сельское хозяйство характеризуется высокой степенью использования пестицидов. На сегодняшний день экологические нарушения, вызванные применением химических средств защиты растений, настолько велики, что все более острым становится вопрос о снижении количества используемых синтетических пестицидов. В качестве альтернативы или дополнения к химическим препаратам выступают биологические методы борьбы с фитопатогенными организмами (Груздев и др., 1980; Лутова и др. 1990).
Одним из направлений биологической защиты растений, является использование микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности в качестве биопестицидов.
Изучение роли растительных стеринов для насекомых и оомицетов открыло путь к получению новых препаратов для борьбы с фитопатогенами и вредителями, действие которых заключается в изменении уровня биосинтеза стеринов. Насекомые, нематоды и оомицеты неспособны к самостоятельному синтезу стеринов. Эти организмы извлекают стерины из тканей растения-хозяина (Svoboda, Feldlaufter, 1991; Инге-Вечтомов, 1997). Было показано, что снижение содержания стеринов в растительных тканях приводит к повышению устойчивости растений к этим фитостеринзависимым организмам (Лутова и др., 1998).
Обработка клубней картофеля компактином приводила к защитному эффекту против фитопаразитических нематод (Romanenko et al., 2002).
Насекомые-фитофаги способны конвертировать растительные стерины в холестерин и другие стероиды, включая гормон линьки экдизон и экдистероиды. Отдельные реакции этих превращений высокоспецифичны для разных видов насекомых. Было показано, что снижение стеринов в пище оказывало негативное воздействие на насекомых, чье развитие зависит от фитостеринов (Ходжайова и др., 2000).
Нормальный рост и развитие оомицетов зависит от типа стеринов, так, наиболее эффективным индуктором споруляции у Phytophthora является |3-ситостерин. Было показано, что снижение содержания стеринов в растениях картофеля увеличивает устойчивость растений к Ph. infestans, уменьшение содержания стеринов у растений снижает их питательную ценность для оомицетов (Ходжайова и др., 2000).
Тесная зависимость насекомых и оомицетов от содержания стеринов в растениях является для них "ахиллесовой пятой". Нарушив эту зависимость, по образцу, происходящему в природе, можно ограничить возможности насекомых к размножению, не вызывая тотальное уничтожение вида.
Из всех известных ингибиторов биосинтеза стеринов наиболее эффективными и специфическими являются соединения, относящиеся к классу статинов. Статины являются продуктами вторичного метаболизма микробиологического синтеза и успешно используются в медицине как ингибиторы биосинтеза холестерина в качестве профилактического средства для лечения пациентов с повышенным содержанием холестерина в крови. В результате действия статинов блокируется связывание фермента З-окси-3-метилглутарил-КоА-редуктазы (ОМГКоА-редуктазы), катализирующего превращение ОМГКоА в мевалоновую кислоту, которая является предшественником стеринов (Endo et al., 1976). Вещества, относящиеся к группе статинов, различаются по эффективности воздействия на биосинтез стеринов. Среди наиболее изученных такие, как компактин, ловастатин и правастатин. Компактин - это природный ингибитор биосинтеза стеринов, относящийся к классу статинов. Продуцентом компактина является несовершенный гриб Penicillium citrinum (Thom).
Перечисленные факты дают основания для начала исследований влияния компактина на фитопатогены и изучения возможности разработки на основе компактина новых средств защиты растений от болезней.
Актуальность выбранного направления исследований обусловлена необходимостью разработки новых биопестицидов и создания соответствующих новых технологий их производства. Известные до сих пор технологии производства компактина слишком дорогостоящие, поскольку они разработаны для производства фармакологических препаратов. Для производства же средств защиты растений необходимо разработать более простые и дешевые технологии. Одним из путей снижения себестоимости целевого продукта является увеличение продуктивности штаммов-продуцентов при сохранении общих производственных затрат. В этой связи было актуально повысить продуктивность штамма гриба P. citrinum путем генетических изменений и оптимизации процессов ферментации.
Цели и задачи исследований. Целью данной работы было изучение влияния компактина на различные фитопатогены. А так же была поставлена цель существенного повышения продуктивности штаммов гриба P. citrinum -продуцентов компактина и разработка оптимальной методики глубинного культивирования вновь полученных мутантов-суперпродуцентов.
Основные задачи:
Изучение защитных свойств компактина с целью оценки возможности использования его для защиты растений от фитопатогенов.
Получение новых высокопродуктивных штаммов гриба P. citrinum методом индуцированного мутагенеза.
Оптимизация условий культивирования полученных мутантных штаммов P. citrinum на агаризованной питательной среде и в жидкой культуре.
Научная новизна исследований.
Впервые показаны защитные свойства компактина против грибных фитопатогенов.
Впервые показана способность компактина ингибировать у грибов биосинтез меланина.
3. Впервые показана антивирусная активность компактина в системах
табак - вирус табачной мозаики (ВТМ), картофель - Х-вирус
картофеля.
Впервые получен высокопродуктивный спорообразующий штамм гриба Penicillium citrinum, продуцирующий около 15 г/л компактина при глубинном культивировании в колбах.
Подобрана оптимальная питательная среда для глубинного культивирования нового высокопродуктивного мутанта.
Практическая значимость работы.
Полученные в ходе работы результаты могут быть использованы при создании фунгицидных препаратов на основе компактина для защиты растений против Stagonospora nodorum, Magnaporthe grisea, Cladosporium cucumerinum, Puccinia graminis и Alternaria longipes, a также против оомицета Phytophthora infestans. Показанные меланинингибирующие свойства компактина позволяют предположить что, полученные на основе компактина препараты будут обладать помимо контактного фунгицидного действия способностью подавлять патогенность грибов путем ингибирования меланиногенеза.
Впервые показанная антивирусная активность компактина открывает возможность разработки вирулицидов против фитовирусов.
Полученный высокопродуктивный спорулирующий штамм гриба Р. citrinwn, оптимизация питательной среды и условий культивирования для этого штамма послужили основой для разработатки полупромышленной технологии производства компактина.
Апробация работы и публикация результатов исследований.
Материалы диссертации были представлены: на Всероссийском совещании: "Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии", 16-18 июля 2003 года, на II и III Московских международных
конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 10-14 ноября 2003 г. и 14-18 марта 2005 г. соответственно; на международной конференции "Наука и бизнес", «Поиск и использование новых биомолекул: биоразнобразие, окружающая среда, биомедицина», Пущино, 10-12 марта, 2004; на Третьей международной конференции из серии "Наука и бизнес", «Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность», Пущино, 19-21 июня, 2006 г.
По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов, методов и результатов исследований, выводов, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц, 25 рисунков, 2 приложения. Список литературы включает 123 наименования, из них 70 работ зарубежных авторов.
Физико-химические свойства компактина
Защита растений от вредителей и болезней представляет огромный резерв повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Среди современных методов защиты особое внимание уделяется биологическим средствам. Биологический метод имеет огромные перспективы в закрытом и открытом грунте и не имеет альтернатив в организации органического (экологического) земледелия, поскольку позволяет снизить побочные эффекты использования химических методов защиты, которые приводят к загрязнению окружающей среды, вследствие накопления в почве и растительных остатках синтетических пестицидов.
В последнее время интенсивно изучаются соединения, относящиеся к новому поколению высокоспецифичных ингибиторов биосинтеза стеринов — так называемых статинов, продуктов вторичного метаболизма у ряда грибов (Endo, Brown et al, 1992). Действие таких соединений могло бы быть направлено на частичное блокирование или изменение путей биосинтеза в растении-хозяине, что приводило бы к нарушениям питательной цепочки в системе: растение-паразит. Подобное нарушение снижало бы питательную ценность растения для паразита (Васюкова и Платонова, 1984), и соответственно, приводило к меньшему поражению патогеном. Исходя из такого рода предпосылок, рядом авторов было высказано предположение о возможном использовании ингибиторов биосинтеза стеринов в тканях растений в качестве защитных препаратов «непрямого действия» (Тарлаковский, 1977; Метлицкий и др. 1980; Лутова и Ходжайова, 1998).
Компактин является типичным представителем группы статинов. Препараты данного класса конкурентно ингибирут фермент З-окси-3-метилглутарил-КоА-редуктазу (ОМГКоА-редуктазу), блокируя тем самым превращение ОМГКоА в мевалоновую кислоту, которая является предшественником при синтезе холестерина (ХС). Ингибирование является дозозависимым и обратимым. Применение статинов в медицине способствует снижению содержания в крови атерогенных липопротеидов низкой плотности и очень низкой плотности, увеличению содержания антиатерогенных липопротеидов высокой плотности и, в целом, исправлению атерогенной ситуации в организме (Kaneko et al., 1978; Tsujita et al.,1979; Kuroda et al., 1979; Yamamoto et al., 1980; Manzoni, Rollini, 2002; Endo, 2004).
В последнее время изучается также возможность использования статинов в качестве кормовых добавок сельскохозяйственным животным и птице для снижения содержания холестерина в мясе и яйцах. Есть публикации об успешном применении статинов в качестве кормовой добавки курам, что приводило к снижению содержания холестерина в яйцах и мясе (Tramp et al., 1997). Это направление считается очень перспективным подходом для получения диетических продуктов с низким содержанием холестерина, потребление которых может способствовать снижению уровня риска сердечно-сосудистых заболеваний.
Известно, что фитопаразитические нематоды не способны к самостоятельному синтезу стероидного ядра и предшественников гормонов линьки, необходимых для их нормального развития (Bolla, 1979) и получают предшественники стероидных гормонов из растений при питании (Лутова, др., 1990; Лутова, Ходжайова, 1998; Инге-Вечтомов, 1997; Chitwood, 1999). Изменение качественного и количественного состава фитостеринов в растении-хозяине делает такие растения менее ценными для питания нематод.
Насекомые, а также фитопатогенные оомицеты тоже (сем. Phythiaceae) не способны синтезировать стерины, необходимые для их развития и прохождения нормального жизненного цикла (Пасешниченко, 1987). Эти организмы получают стерины из растительных тканей, то есть, в этом смысле, они полностью зависят от стеринов, синтезируемых растениями-хозяевами (Svoboda, Feldlaufter, 1991). В связи с этим, было высказано предположение, что вмешательство в биосинтез фитостеринов может приводить к нарушению жизненного цикла у данных патогенов и вредителей (Ходжайова, Левашина и др., 2000). Это предположение нашло подтверждение при изучении механизмов действия ряда пестицидов. Оказалось, что некоторые широко используемые в сельском хозяйстве фунгициды являются ингибиторами биосинтеза стеринов в грибах. Эти препараты в начале были отобраны для практического применения на основании своих фунгицидных свойств, а затем было выявлено, что их защитное действие связано со способностью ингибировать биосинтез стеринов. По химическому строению среди фунгицидов, ингибирующих биосинтез стеринов, выделяют пять классов: пиримидины, пиридины, имидазолы, триазолы и морфолины. Различные классы фунгицидов инги-бируют разные ферменты, участвующие в биосинтезе стеринов на относительно поздних стадиях и механизмы таких взаимодействий хорошо изучены (Kato, 1986; Roller, 1991).
Влияние компактина на прорастание спор гриба stagonospora nodorum
Изучение защитных свойств компактина показало его способность подавлять рост мицелия ряда фитопатогенных грибов и ингибировать биосинтез меланина в мицелии этих грибов. Выявлена также антивирусная активность компактина. Переданный нами препарат компактина в лабораторию энтомологии ВНИИФ показал инсектицидную активность против тлей и белокрылки. Группа нематологов ВНИИФ изучала нематицидные свойства компактина и показала защитное действие этого соединения против золотистой цистовой нематоды. Все это, с определенной долей вероятности, позволяет предположить, что на основе компактина можно было бы создать препарат, обладающий защитным действием против фитопатогенов и вредителей.
Продуктивность исходного коллекционного штамма SANK 18767 гриба Penicillium citrinum составляла 20-35 мг компактина на 1 литр культуральной жидкости при глубинном культивировании в колбах.
Высокопродуктивный штамм 18-12, полученный в результате многолетней работы ст.н.с. Т.М. Воиновой в лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ из коллекционного штамма, был способен синтезировать 7-8 г/л компактина. Для мутантного штамма 18-12 были разработаны питательные среды, подобраны условия культивирования, а также методы анализа, выделения и очистки целевого продукта.
Однако результатом многократного мутагенного воздействия на геном гриба стала потеря его способности образовывать споры. Аспорогенность штамма 18-12 не позволяла стандартизировать посевной материал для глубинного культивирования. По-видимому, из-за этого уровень продуктивности варьировал от опыта к опыту. Так, при культивировании в ферментационной среде №1 в ряде экспериментов наблюдалась более высокая концентрация компактина (до 9 г/л). Этот факт указывал на то, что биологический потенциал штамма выше среднего значения большинства экспериментов и, по-видимому, до конца не выявлен.
Для определения максимальной продуктивности мутантного штамма 18-12 были проведены опыты по оптимизации условий культивирования. В процессе оптимизации среды было изучено влияние основных компонентов среды, используемых в процессе ферментации. Изучались также возможность повышения продуктивности мутанта 18-12 гриба P. citrinum путем генетической модификации и получение из него высокопродуктивных штаммов, способных к образованию спор.
Коллекционный штамм SANK 18767 гриба P. citrinum образовывал на агаризованной среде быстрорастущие, ровные колонии с зеленым порошистым споровым слоем на поверхности мицелия, с кольцом светло-желтого пигмента вокруг колонии.
Полученный в лаборатории мутантный штамм 18-12, синтезировавший при глубинном культивировании обычно 7-8 г/л компактина, на агаризованной среде образовывал карликовые аспорогенные рыхлые колонии желтого цвета с морщинистой поверхностью, неровными краями, с кольцом светло-желтого пигмента вокруг колонии. Диаметр 12-суточной колонии штамма 18-12 был около 30 мм, тогда как исходный коллекционный штамм после 3-4 суток роста занимал всю поверхность чашки Петри. В отличие от исходного штамма SANK 18767, который образовывал прямые гифы из длинных тонких клеток, мутант 18-12 имел закручивающиеся гифы из округлых клеток неправильной формы, с утолщенными клеточными стенками (рис. 17).
Поскольку высокопродуктивный полученный мутант значительно отличался по морфологическим свойствам, то нельзя было исключить, что он мог бы отличаться от исходного и по своим потребностям к составу питательной среды. Не исключено, что оптимизация состава питательной среды и условий культивирования могла бы еще более повысить продуктивность данного мутанта по компактину, по сравнению с исходным.
Целью дальнейшей работы было повышение продуктивности мутанта гриба 18-12 в результате ступенчатого мутагенеза, дальнейшая оптимизация ферментационной среды, а также получение спорулирующих мутантов гриба.
Изучение действия компактина на устойчивость к грибу alternaria longipes
Известно, что в процессе ферментации гриб синтезирует кислотную форму компактина, которая накапливается в клетке (Serizawa et al, 1983). Мы предположили, что при защелачивании среды происходит переход кислотной формы компактина в менее токсичную солевую водорастворимую форму, которая частично выделяется в питательную среду. Таким путем, по-видимому, снижается токсичное действие компактина на гриб-продуцент. Это, возможно, уменьшит лимитирующее действие внутриклеточного компактина и может способствовать увеличению конечного количества синтезируемого продукта. В табл. 5 представлены результаты влияния конечных значений рН среды на содержание компактина в культуральной жидкости.
Полученные результаты подтвердили предположение о том, что при щелочных значениях рН часть компактина переходит в водорастворимую солевую форму и выводится из клеток гриба в культуральную жидкость, снижая токсичное действие внутриклеточного компактина, позволяя тем самым увеличить продукцию компактина. В связи с этим можно предположить, что одним из необходимых, но недостаточных признаков высокой продуктивности мутантов должно быть естественное защелачивание среды в конце ферментации до рН 7,0-8,0. Естественное защелачивание питательной среды выше рН 8,0 приводило к разрушению компактина, что согласуется с данными Эндо и его сотрудников (Endo et al., 1976).
Зависимость продуктивности штамма 18—12 от концентрации сахарозы в среде, добавленной в процессе ферментации
В питательной среде для исходного дикого штамма P. citrinum в качестве источников углеводов использовали глицерин и глюкозу (Hosobuchi et al., 1993). Это дорогие компоненты питательной среды, поэтому в процессе отбора мутантных колоний на разных этапах мутагенеза постепенно глицерин и глюкозу полностью заменили на сахарозу. Замена глицерина сахарозой не только снизила затраты на питательную среду, но и привела к повышению продуктивности полученных мутантов.
Однако на последующих этапах мутагенеза вновь получаемые высокопродуктивные штаммы требовали больших количеств сахарозы в питательной среде. Для вновь полученного мутанта 18-12, по предварительным оценкам, предпочтительно было примерно 100 г/л сахарозы в исходной питательной среде и нам следовало определить оптимальную концентрацию сахарозы в среде, добавленной в процессе ферментации. Это могло бы привести к повышению продуктивности тестируемого штамма. На рис. 19 представлены результаты тестирования различных концентраций сахарозы, добавленной в процессе ферментации. «12 е ц U Зависимость продуктивности штамма 18-12 от концентрации в среде сахарозы, добавленной в процессе ферментации Оптимальным оказалось внесение 150 г/л сахарозы в процессе ферментации. Дальнейшее увеличение концентрации сахарозы приводило к снижению выхода компактина.
Все дальнейшие эксперименты проводились с добавлением сахарозы в процессе ферментации в концентрации 150 г/л. Суммарная концентрация сахарозы, таким образом, составляла 250 г/л.
Замена сахарозы в питательной среде на мелассу приводила к снижению биосинтеза компактина примерно на 5%-7%. Несмотря на то, что меласса является дешевым сырьем, богатым углеводами и другими ценными органическими и минеральнвми веществами, во всех дальнейших опытах использовалась сахароза, поскольку мелассу трудно стандартизировать. К тому же, использование сахарозы позволило бы определить биологическую активность штамма.
Динамика биосинтеза компактина, изменения рН и потребления сахарозы в процессе роста штамма 18-12 На рис. 20 представлена динамика биосинтеза компактина, изменения рН и потребления сахарозы в процессе роста штамма 18-12.
В первые дни культивирования гриб активно потреблял сахарозу, полностью используя ее к 72 часу, что связано с нарастанием мицелиальной массы гриба. Через 68-72 часа культивирования добавляли 150 г/л сахарозы. Активный синтез компактина начинался через 95-100 часов и продолжался до 192 часа культивирования гриба. Однако прирост компактина наблюдался до конца ферментации (264 ч), что вероятно связано с повышением значений рН среды и частичным переходом компактина в водорастворимую солевую форму.
Динамика биосинтеза компактина (А) в зависимости от изменения рН (Б) и концентрации сахарозы в среде в течение ферментации 4.1.6. Влияние различных концентраций дрожжевого экстракта в питательной среде на продуктивность штамма 18—12
Увеличение общей концентрации сахарозы до 250 г/л приводило не только к повышению продуктивности штамма, но и к понижению конечных значений рН до кислой области в пределах 5,0-6,5 что, вероятно, препятствовало переходу кислотной формы в менее токсичную солевую и выходу части компактина из клеток мицелия. Было изучено влияние ряда компонентов среды, способных поддерживать значение рН в щелочной области в конце ферментации (лимонная кислота в сочетании с карбонатом кальция, дрожжевой экстракт и нитрат натрия).
Наиболее эффективным оказалось добавление дрожжевого экстракта и повышение концентрации нитрата натрия до 5 г/л. Использование дрожжевого экстракта (1-3 г/л) в среде способствовало повышению значений рН в конце ферментации до 6,5-7,5 и повышению продуктивности штамма 18-12 до 12 г/л (табл. 6).
Влияние концентраций спор гриба в посевном материале на биосинтез компактина штаммом 20-01
В связи с отсутствием конидий у штамма 18-12, процесс инокуляции вегетативной среды был не контролируемым, так как при этом использовались обрывки мицелия, собранные с определенной площади колоний, что не давало возможности определить точную дозу посевного материала.
Получение спорообразующего штамма 20-01 позволило оптимизировать и стандартизировать процесс инокуляции вегетативной среды при использовании конидий (таблица 7). компонентов среды и аэрации на биосинтез компактина, что позволило увеличить продуктивность данного штамма с 8 до 12 г/л целевого продукта.
Штамм 18-12 был использован для получения новых мутантов с повышенной продуктивностью методом индуцированного мутагенеза. В качестве мутагенного фактора использовали УФ-лучи с длиной волны 254 нм (Auerbach, 1976). Суспензию клеток мицелия помещали на расстояние 25 см от лампы. При облучении от 10 до 40 минут выживаемость клеток мицелия была 0 - 1,4 % (рис. 24). При такой выживаемости наблюдалось максимальное количество мутантов.
После каждого облучения клеток мицелия УФ-лучами на агаризованной среде отбирали 60-100 мутантов по морфологическим признакам (цвет, форма колонии, скорость роста, наличие спорообразования и т.д.). Эти колонии тестировали на их способность продуцировать компактин в жидкой ферментативной среде определенного состава и отбирали колонию с максимальной продуктивностью. Далее эту колонию подвергали следующему облучению ультрафиолетом. Скорость роста мутантных штаммов, как правило, не отличалась от исходного штамма 18-12. Однако в ряде случаев были получены колонии с характерным для P.citrinum зеленым спорообразующим слоем поверхностного мицелия, восстановившие потерянную штаммом 18-12 функцию спорообразования, что позволило стандартизировать процесс приготовления посевного материала.
Продуктивность большинства мутантов была меньше или равна продуктивности исходного штамма 18-12. Продуктивность нескольких мутантов превышала продуктивность штамма 18-12 на 10-15%. Наиболее перспективным оказался мутант 20-01.
Зависимость продуктивности этого мутанта от концентрации сахарозы, добавленной к 68 - 72 ч культивирования, внесения дрожжевого экстракта и повышения концентрации нитрата натрия до 5 г/л была аналогична параметрам, полученным для штамма 18-12.
Мутант 20-01 формировал на агаризованной среде плотные морщинистые колонии желтого цвета, с воздушным спорообразующим мицелием светло-зеленого цвета и слабым желтым пигментом вокруг колонии. Скорость роста была идентична скорости роста штамма 18-12, но через 5-6 дней роста появлялись типичные для P. citrinum конидии. Спорообразование штамма 20-01, однако, была на порядок меньше, чем у исходного "дикого" штамма SANK 18767. На рис. 25 представлены фотографии колоний мутантных штаммов гриба P. citrinum (18-12 и 20-01).
Использование различных концентраций спор гриба в инокулюме показало, что оптимальной является концентрация 106 спор в 1 мл вегетативной среды. Прорастаемость конидий штамма 20-01 составляла 80 -85%.
Совместное использование дрожжевого экстракта, увеличенных концентраций нитратного азота и сахарозы позволило повысить продуктивность штаммов 18-12 и нового спорообразующего штамма 20-01 до 12,0-12,5 г/л.
Добавление различных минеральных солей (СаСОз, КН9РО4), а также микроэлементов (FeSC 4, ZnS04, СоСЬ, МпСЬ, FeCb) в различных концентрациях не приводило к повышению продуктивности штаммов.
Последующая обработка мутагеном и культивирование на подобранной нами среде 2 позволили впервые выделить новый спорообразующий мутант 21-34, способный продуцировать до 14,9 г/л компактина (табл. 8).
