Содержание к диссертации
Введение
Г л а в а 1. Биологические и физиолого-биохимические факторы патогенности дейтеромицетов (обзор литературы) 13
1.1. Характеристика дейтеромицетов, паразитирующих на растениях 13
1.2. Механизм заражения растений дейтеромицетами 24
1.3. Ферменты как возможные факторы патогенности дейтеромицетов 32
1.3.1. Пекто- и целлюлолитические ферменты и патогенность дейтеромицетов 35
1.3.2. Ферменты, не связанные непосредственно с расщеплением структурных компонентов клеточных стенок растений, и их возможная роль в патогенности дейтеромицетов 42
1.4. Фитотоксины как возможные факторы патогенности дейтеромицетов 44
1.5. Фитогормоны как возможные факторы патогенности дейтеромицетов., 54
1.5.1. Ауксины и их роль в патогенезе грибных болезней у растений 55
1.5.2. Другие фитогормоны и их роль в патогенезе грибных болезней у растений 61
Глава 2. Материалы и методы исследований 66
2.1. Выращивание, изучение мутационной изменчивости и определение патогенности гриба S. nodorum Berk. 66
2.2. Экстракция белка, определение активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и оксидоредуктаз гриба S. nodorum Berk и растений пшеницы 70
2.3. Выделение, очистка и идентификация фитотоксичных метаболитов гриба S. nodorum Berk 74
2.4. Определение содержания фитогормонов в культуре гриба S. nodorum Berk и растениях пшеницы 76
2.5. Изучение влияния фитогормонов на степень поражения растений пшеницы септориозом 77
2.6. Статистическая обработка данных 78
Г л а в а 3. Изучение биологических особенностей возбудителя септориоза пшеницы-гриба S. nodorum Berk. 79
3.1.. Рост и споруляция гриба S. nodorumBerk в чистой культуре 79
3.2. Физиологическая специализация гриба S. nodorum Berk. и патогенность 87
3.4. Выводы 101
Г л а в а 4. Мутационная изменчивость и патогенность гриба S. nodorum Berk 103
4.1. Морфолого-культуральные особенности и патогенность мутантов гриба S, nodorum Berk 103
4.2. Физиологические особенности мутантов гриба S. nodorum Berk, и их роль в адаптации патогена к условиям существования 125
4.3. Выводы 133
Г л а в а 5. Пектолитические и целлюлолитическис ферменты гриба S. nodorum Berk, и их роль в патогенезе септориоза пшеницы .134
5.1. Изменение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и ксиланазы в процессе роста гриба S. nodorum Berk, в чистой культуре 135
5.2. Активность пектолитических и целлюлолитических ферментов и патогенность гриба S. nodorum Berk 147
5.3. Изменение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и ксиланазы в системе "растение-хозяин - патоген"... 163
5.4. Выводы 174
Г л а в а 6. Изоферменты некоторых гидролаз и оксидорсдуктаз гриба S. nodorum Berk, и их возможная роль в патогенезе септориоза пшеницы 177
6.1. Полиморфизм белков и изозимный спектр некоторых гидролаз и оксидоредуктаз у природных изолятов и мутантов гриба S. nodorum Berk 178
6.2. Активность некоторых гидролаз и оксидоредуктаз, изоферменты и патогенность гриба 5!. nodorum Berk 189
6.3. Изменение активности и изоферментного спектра кислой фосфатазы, р - глюкозидазы и пероксидазы в системе "растение-хозяин - патоген" 202
6.4. Выводы 216
Г л а в а 7. Фитотоксины гриба S. nodorum Berk, и их роль в патогенезе септориоза пшеницы 220
7.1. Выделение, очистка и идентификация фитотоксинов гриба S. nodorum Berk 221
7.2 .Зависимость токсинообразования от условий культивирования гриба S. nodorum Berk 227
7.3. Фитотоксины и патогенность гриба S. nodorum Berk 229
7.4. Фитотоксины гриба S. nodorum Berk, и их роль в реакции взаимодействия патогена и растения-хозяина 244
7.5. Выводы 257
Г л а в а 8. Фитогормоиы как возлюжпые факторы патогеипости гриба S. nodorum Berk . 260
8.1. Синтез фитогормонов в процессе роста гриба S. nodorum Berk, в чистой культуре 260
8.2. Синтез ИУК и патогепность гриба S. nodorum Berk 266
8.3. Динамика содержания ИУК в системе "растение-хозяин - патоген" 272
8.4. Влияние экзогенных фитогормонов на прорастание спор, рост гиф и развитие септориоза у растений пшеницы, инфицированных S. nodorum Berk 273
8.5. Выводы 284
Заключение 287
Выводы 313
Список литературы
- Ферменты как возможные факторы патогенности дейтеромицетов
- Экстракция белка, определение активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и оксидоредуктаз гриба S. nodorum Berk и растений пшеницы
- Физиологическая специализация гриба S. nodorum Berk. и патогенность
- Физиологические особенности мутантов гриба S. nodorum Berk, и их роль в адаптации патогена к условиям существования
Введение к работе
Актуальность проблемы. Дейтеромицеты (Deuteromycetes) или несовершенные грибы чрезвычайно широко распространены в природе. Многие из них паразитируют на высших растениях. К возбудителям болезней сельскохозяйственных культур, оказывающим наиболее существенный вред производству, относятся грибы pp. Botrytis Mick, Verticillium Nees, Rin-chosporium, Trichothecium Lk, Piricularia Sacc, Cercosporella Sacc, Cladospo-rium Link, Alternaria Nees, Helminthosporium Lk: Fr., Drechslera Ito, Bipolar is, Curvularia Boed, Fusarium Lk: Fr. (порядок гифомицеты), p. Colletotrichum Sacc. (порядок меланкониальные) и pp. Phoma sp., Phomopsis Sacc, Ascochyta Lid. и Septoria Fr. (порядок сферопсидальные).
Возбудители септориозных пятнистостей пшеницы - грибы p. Septoria в настоящее время насчитывают свыше 10 видов. Среди них наиболее часто на посевах встречаются S. tritici Rob. et Desm. и S. nodorum Berk. Первый из них поражает, в основном, листья, а второй - колос, хотя практически S. nodorum Berk, способен поражать все надземные органы. Оба вида часто можно обнаружить на одних и тех же полях и даже растениях (Соколов и др., 1998).
В 1987 г. на европейской территории бывшего СССР 50 - 80% случаев возникновения массовых пятнистостей на пшенице было вызвано поражением её септориозом (Супрун, 1990). Сильное развитие септориоза на посевах пшеницы отмечено на Алтае и в Северном Казахстане (Васецкая, Столяров, 1988), в Сибири (Лебедева, 1964; Кашуба, 1989), на Северном Кавказе (Фис-сюра и др., 1996; Чуприна и др., 1997) и в Украине (Дубиневич, 1971; Гонта-ренко и др., 1998). Особенно широкое распространение септориоз получил с середины 80-х и начала 90-х годов (Новожилов, 1996), став доминирующим заболеванием на посевах озимой и яровой пшеницы (Павлюшин и др., 2005). Показано, что в благоприятные для развития болезни годы септори- оз вызывает снижение урожая зерна на 10 - 20, а в некоторых случаях до 30 - 50 %(Дымина, 1997; Гонтаренко и др., 1998).
Приведенные данные говорят о том, что септориоз относится к числу широко распространенных и опасных по экономическим последствиям болезней зерновых культур. Основными методами борьбы с данным заболеванием являются создание и внедрение в производство устойчивых сортов пшеницы и синтез новых эффективных и экологически безопасных химических средств защиты посевов. Решение данных вопросов сдерживается рядом причин, одной из которых является слабая изученность природы патогенности возбудителей этого заболевания. Из литературы известно, что детерминантами патогенности ряда бактерий и грибов могут служить ферменты (Тарр, 1975; Езепчук, 1977), токсины (Тарр, 1975; Йодер, 1984; Асада, 1985; Дурбин, 1985), гормоны (Тарр, 1975; Пегг, 1984; Косуге, Комаи, 1985) и другие биологически активные соединения. Сведения подобного плана в отношении грибов p. Septoria ограничены, поэтому проведение исследований, направленных на изучение пектолитических и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов как возможных биохимических факторов патогенности S. nodorum Berk, является актуальным и имеет большое научное общебиологическое и прикладное значение.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было изучение физиолого-биохимической природы патогенности S. nodorum Berk. как теоретической основы направленного поиска новых средств химической защиты растений и создания устойчивых к септориозу сортов пшеницы.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: изучить динамику роста и споруляции S. nodorum Berk, в чистой культуре, выявить зависимость их от состава питательной среды (источники азота и углерода, ростовые факторы и т.д.) и проанализировать взаимо- связь между физиологической специализацией S. nodorum Berk, и его патоген но стыо; выяснить способность S. nodorum Berk, к мутационной изменчивости, создать для экспериментальных целей коллекцию морфологических и контрастных по патогенности мутантных штаммов гриба и изучить физиологические особенности некоторых из них; проследить за динамикой активности пектолитических и целлюлоли-тических ферментов, синтеза индолилуксусной кислоты (ИУК) и фитоток-синов в процессе роста S. nodorum Berk, в чистой культуре;_провести анализ взаимосвязи между патогенностью гриба и способностью его к продуцированию ферментов, фитотоксинов и ИУК; изучить полиморфизм белков и изозимный спектр некоторых гидро-лаз и оксидоредуктаз у природных изолятов, а также у слабо- и высокопатогенных мутантов гриба S. nodorum Berk; выявить особенности динамики активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы, а также содержания ИУК в системе "растение - хозяин - патоген" в процессе развития болезни; изучить действие экзогенных ферментных препаратов, фитотоксинов и фитогормонов на характер взаимоотношений патогена и растения -хозяина; разработать схему взаимодействия на уровне пекто-и целлюлоли-тических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов (ИУК) между возбудителем септориоза - грибом S. nodorum Berk, и растениями пшеницы.
Научная новизна. Впервые проведены комплексные исследования пектолитических и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов как возможных факторов патогенности возбудителя септориоза пшеницы - гриба S. nodorum Berk. Эксперименты выполнены с использованием не только природных изолятов, но и конрастных по патогенности мутантов S. nodorum Berk, впервые полученных на основе изолята 85-254.
Впервые с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления удалось количественно оценить способность S. nodorum Berk, к синтезу фитотоксинов и ИУК при выращивании его в чистой культуре.
Установлено, что культура гриба S. nodorum Berk, обладает активным комплексом пектолитических и целлюлолитических ферментов, продуцирует ряд фитотоксичных метаболитов и фитогормоны, в частности ИУК. Максимальная активность полигалактуроназы, комплекса целлюлаз и ксиланазы приходится на 5-7 сутки роста гриба, то есть на экспоненциальную фазу, характеризующуюся наиболее высокой удельной скоростью роста патогена и переходом его к продуцированию спор. Прекращение роста и достижение максимума споруляции сопровождается снижением активности ферментов и увеличением количества ИУК с 1,5 до 6,7 нг/г сырой массы. При прорастании пикноспор резко повышается активность ферментов, возрастает содержание фитотоксинов и ИУК, одновременно усиливается секреция их в окружающую инкубационную среду.
Впервые показано, что наиболее патогенные природные изоляты и мутанты S. nodorum Berk, обладают и более высокой активностью гидролитических ферментов, особенно полигалактуроназы и Р-глюкозидазы, а также повышенной способностью к продуцированию фитотоксинов. Между па-тогенностью мутантов S. nodorum Berk, и способностью их к синтезу ИУК обнаружена обратная корреляционная зависимость.
Впервые представлены данные сравнительного анализа активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы у слабо- и высокопатогенных мутантов S, nodorum Berk., доказывающие преимущество последних по числу изоферментов эстеразы, (3-глюкозид азы, кислой фосфа-тазы и пероксидазы.
Впервые с использованием восприимчивого и относительно устойчивого к септориозу сортов пшеницы исследованы особенности динмики активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы, а также содержания ИУК в процессе развития болезни у растений, инфицированных слабо- и высокопатогенным мутантами S. nodorum Berk. Показано, что и в данном случае различия между слабо- и высоко патогенным мутантами и преимущество последнего сохраняются, особенно в опытах с восприимчивым к септориозу сортом пшеницы.
В экспериментах с изучением действия экзогенных гидролаз, фито-токсинов и фитогормонов на растения впервые доказано, что экстракты ферментов из мицелия S. nodorum Berk, вызывают на листьях повреждения, характерные для септориоза. Фитотоксины, напротив, не способны вызывать подобные внешние симптомы, однако при добавлении в споровую суспензию повышают степень поражения инокулированных растений пшеницы, а при поступлении через корни влияют на транспирацию и водный обмен. Предобработка растений пшеницы фитогормонами с последующим инфицированием их S. nodorum Berk, в значительной степени снижает развитие септориоза.
На основе полученных результатов и данных литературы предложена схема взаимодействия возбудителя септориоза - гриба S. nodorum Berk. и растений пшеницы.
Практическая значимость работы. В результате проведенных экспериментов: создана коллекция мутантов гриба S. nodorum Berk, (свыше 30 штаммов), различающихся по морфол о го-кул ьтуральным признакам и па-тогенности; выделены фитотоксины гриба S. nodorum Berk, которые могут быть использованы в работах по селекции пшеницы на устойчивость к септориозу с помощью культуры клеток и тканей; разработаны схема препаративного выделения токсинов из культуры гриба S. nodorum Bert, "Методика определения фитотоксинов гриба S. nodorum Berk, с помощью тонкослойной хроматографии" и "Методика количественного определения фитотоксинов гриба S. nodorum Berk, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления"; составлены "Рекомендации по направленному синтезу фунгици дов, предназначенных для борьбы с септориозом".
Основные положения, выносимые на защиту: наиболее патогенные природные изоляты и мутанты гриба S. nodorum Berk, обладают и более высокой активностью пектолитических и целлюлолитических ферментов, особенно полигалактуроназы (г=0,67) и р-глюкозидазы (г=0,70); высокопатогенные мутанты, как и высокопатогенные природные изоляты гриба S. nodorum Bert, превалируют по количеству продуцируемых септорина и медленна (охрацина), суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксичных метаболитов и по количеству секретеру емых фитотоксинов над слабо патогенным и штаммами; между патогенностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции фитогормона ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная зависимость; схема взаимодействия возбудителя септориоза - гриба S. nodorum Berk и растений пшеницы, предложенная на основе полученных результатов и данных литературы.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались на научно-теоретических конференциях НИСХИ МСХ СССР (пгг Гвардейский, 1981,1983,1988 ), VIII научной конференции по споровым растениям Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1989 ), научно-теоретической конференции Среднеазиатского НИИ фитопатологии МСХ СССР ( Ташкент, 1989 ), I и II Всесоюзном совещаниях по физиолога - биохимическим основам иммунитета с.-х. растений к грибным болезням (Уфа, 1988, 1990 ), заседаниях научно-технического совета при ВНИИ фитопатологии МСХ СССР (Голицыно, 1980- 1991), бюро Отделения защиты растений Россельхозакаде-мии (Москва, Санкт-Петербург, Голицыно, 1992-2002), IX Всесоюзном совещании по иммунитету растений к болезням и вредителям (Минск, 1991 ), III (Санкт-Петербург, 1993 ) и IV (Москва, 1999) съездах Всероссийского общества физиологов растений, научно-методическом совещании по селекции яровой пшеницы, посвященном 110-летию А.П. Шехурдина (Саратов, 1996), V и VI международных конференциях "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1999, 2001), международной научно-практической конференции "Биологизация защиты растений: состояние и перспективы" (Краснодар, 2000), I съезде микологов (Москва, 2002), I Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2002).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 50 работ.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, восьми глав, включающих обзор литературы, заключения, выводов, списка литературы и 36 стр. приложения. Работа изложена на 360 страницах, иллюстрирована 45 таблицами и 78 рисунками. Библиография включает 384 источника, втом числе 227 на иностранных языках. * $ #
Исследования выполнены в 1979-1999 гг. по планам НИР, утвержденным МСХ СССР, и программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований РАСХН. Место проведения экспериментов: НИСХИ МСХ СССР (ныне Национальный центр по биотехнологии Республики Казахстан НИСХИ, п.г.т. Гвардейский) и Среднерусская Н.-И. фитопатологическая станция РАСХН (ныне Филиал ГНУ Тамбовского НИИСХ РАСХН «Среднерусская Н.-И. фитопатологическая станция»), В выполнении отдельных разделов работы принимали участие М.Н. Васецкая, Г.В. Кобыльская, В.Д. Бор-зионов, А.А. Ахметов, Е.В. Бочарова, Н.М. Герцог и Е. Г, Дорохова, которым автор выражает искреннюю благодарность.
Ферменты как возможные факторы патогенности дейтеромицетов
Процесс патогенеза, как правило, регулируется комплексом внутренних и внешних факторов. Среди этих факторов важная роль отводится хими ческому составу и структуре клеточных стенок растений, являющихся по сути местом первоначального контакта патогена и растения-хозяина.
В последние годы опубликовано несколько обзоров, в которых детально проанализированы такие вопросы, как сборка и разрастание первичной клеточной стенки (Cosgrove, 1997), функциональная архитектура клеточных стенок растений (Roberts et al., 1998), белки растительной клеточной стенки и их функции (Cassab, 1998) и др.
Клеточная стенка является наиболее важным механическим компонентом, обеспечивающим форму и тургор клетки. По своей архитектуре она представляет сложную полимерную структуру, в которой микрофибриллы кристаллической целлюлозы внедрены в менее организованный полисаха-ридный матрикс. Кроме целлюлозы, в состав клеточных стенок входят геми-целлюлоза, пектин, структурные белки, вода и др.
Природа белков растительной клеточной стенки также варьирует, как и многие ее функции (Cassab, 1998). Кроме белков, обогащенных глицином, все они гликозидированы, содержат оксипролин и часто повторяющиеся последовательности. Большинство белков клеточной стенки перекрестно связаны (сшиты) с клеточной стенкой и, вероятно, выполняют структурные функции, хотя они могут также участвовать в морфогенезе. С другой стороны, арабиногалактоновые белки легко растворимы и, вероятно, играют главную роль во взаимодействиях клетки с клеткой во время развития.
Кроме структурных белков, в составе клеточных стенок, по последним данным (Cosgrove, 1997), обнаружены ферменты: эндоглюканаза, ксилозида-за, пектиназа, пектинметилэстераза и др. Этим, по-видимому, объясняется способность клеточной стенки к самосборке и такие ее свойства, особенно у растущей клеточной стенки, как синтез, обновление, стрессовое расслабление, растяжимость и реакция на подкисление. Таким образом, клеточная стенка - это динамическая структура, физические и химические свойства которой прекрасно приспособлены к ее функциям.
Среди многочисленных функций клеточной стенки одной из ее наиболее важных является функция защиты как от внешних механических воздействий, так и от фитопатогенных микроорганизмов. Первичная способность растений противостоять патогенам, прежде всего, основывается на свойствах структурной защиты. Структурные барьеры включают в себя поверхности растений (кутикулярный воск, кутикула) и клеточные стенки, которые в ин-тактном состоянии, как это хорошо известно, могут сдерживать проникновение патогена. Поэтому, естественно, что для преодоления этих барьеров фи-топатогенный гриб должен продуцировать целый комплекс ферментов (Walton, 1994). Проникновение фито патогенных грибов через кутикулу растения-хозяина может осуществляться или механически, или с помощью фермента кутиназы (Nasraoui, 1992). Кутиназа является эстеразой, продуцируемой множеством грибов и способной деполимеризовать in vitro кутин в жирные кислоты. Это гликопротеид с молекулярной массой 22-32 KD и оптимумом рН, зависящим от вида гриба. Важно подчеркнуть, что ингибирование кутиназы гриба может защитить растение от проникновения патогена и заражения.
Для гидролиза целлюлозы, входящей в состав клеточных стенок, требуется, по крайней мере, комплекс следующих ферментов: эндо-(3-1,4-глюка-наза (Сх-целлюлаза), которая осуществляет начальные стадии деполимеризации целлюлозы, разрушая аморфные участки цепочки; зкзо-Р-1,4-глюканаза (Срцеллюлаза), представленная 3-],4-глюканглюкогидролазой и Р-1,4-глю-кан-целлобиогидролазой, отщепляет остатки целлобиозы от концов цепочек целлюлозы и (3-глюкозидаза, которая расщепляет целлобиозу до глюкозы (Enari, Markkanen, 1977; Mishra, 1980).
Пектиновые вещества деполимеризуются с помощью комплекса пек-толитических ферментов. В соответствии с существующей номенклатурой и классификацией (Номенклатура ферментов, 1979) к пектолитическим ферментам относятся пектинметилэстераза (К.Ф. 3.1.1.11) и деполимеразы, различающиеся по способу действия (гидролазы и лиазы), по месту разрушения связей в субстрате (эндо- и экзоформы ферментов), а также по субстратной специфичности, предпочтительно действующие на пектин или полигалакту-роновую кислоту. Среди них наиболее распространенными являются эндопо-лигалактуроназа (К.Ф. 3.2.1.15) и экзополигалактуроназа (К.Ф. 3.2.1.67).
Гидролиз другого полимера, входящего в состав клеточных стенок растений, а именно ксилана, осуществляет фермент эндо -(3-1,4-ксиланаза ((3-1,4-D-ксилан-ксиланогидролаза, К.Ф. 3.2.1.8).
Экстракция белка, определение активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и оксидоредуктаз гриба S. nodorum Berk и растений пшеницы
Навеску мицелия (1,5-2,0 г) заливали жидким азотом, растирали в по рошок, используя кварцевый песок, а затем проводили водную экстракцию. Очистку белковой вытяжки от низкомолекулярных примесей и предвари тельное ее сгущение производили с применением «батч» - метода (Гильма л нов и др., 1981). Для изучения изоферментного спектра и активности гидролитических ферментов экстракцию белка из предварительно замороженного при -20С мицелия проводили охлажденным 0,1 М трис-НС1 буфером, рН 7,4, взятым из расчета 5 мл буфера на 1 г мицелиалыюго материала. Гомогенат переносили в центрифужные пробирки, выдерживали 1 час на холоде (+4С), а затем центрифугировали при 8-Ю тыс. об/мин в течение 15 мин. Очистку белкового экстракта от низкомолекулярных примесей и предварительное его сгущение проводили с помощью сухого сефадекса марки G-25.
Культуральную жидкость предварительно диализовали против биди-стилированной воды в течение 2-х суток, концентрировали с помощью поли-этиленгликоля (карбовакс 40) и затем использовали для анализа внеклеточных ферментов.
Белковый экстракт для определения активности кислой фосфатазы и (3-глюкозидазы растений пшеницы получали следующим образом: 1 г растительного материала растирали в фарфоровой ступке в жидком азоте с кварцевым песком. В качестве экстрагента использовали 0,2 М ацетатный буфер, рН 5,0 с 0,02 М Р" меркаптоэтанола. На 1 г растительного материала брали 6 мл буфера. Очистку и концентрирование вели с помощью сефадекса G-25 и поливинилпирролидона (Polyclar AT, «Serva», Германия).
Белковый препарат для определения изозимных спектров эстеразы, пе-роксидазы, р- глюкозидазы и кислой фосфатазы получали по той же методике, но в качестве экстрагента использовали 0,1 М трис-НСІ буфер, рН 7,4.
Содержание белка в культуральной жидкости, в экстрактах из мицелия и спор гриба S. nodorum Berk., а также из листьев пшеницы определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). В ряде экспериментов белок определяли прямым спектрофотометрированием пробы при длинах волн 280 и 260 нм на спектрофотометре PU 8600. Расчет производили по формуле, предложенной Варбургом и Христианом (Бейли, 1965): Белок, мг/мл = E2so-l 45 - Е260 0,74. Для определения активности кислой фосфатазы в культуре гриба в качестве субстрата применяли 0,25%-ный раствор р-глицерофосфата натрия, приготовленный на трис-HCI буфере, рН 6,0. Об активности фермента судили по нарастанию количества неорганического фосфора (Рн) в реакционной среде за 1 час инкубации при температуре 37С. Количество Рн определяли по методу Лоури и Лопез в модификации Хонда (Гавриленко и др., 1975). Активность ферментов выражали в мкг Р„/мг белка. В ряде экспериментов активность кислой фосфатазы, кроме того, определяли по методике, описанной М.А.Тукеевой (1977). В качестве субстрата использовали р-нитрофенилфосфат («Serva», Германия).
Определение активности эстеразы проводили по несколько модифицированной нами методике В.В.Чигрина и др. (1976), Р-глюкозидазы по методике, предложенной E.Onogur (1978), а РНК-азы - по Martinez-Honduville (1975) спектрофотометрически (Perkin Elmer 402) по поглощению продуктов распада, которые не осаждаются 0,3% уран ил ацетатом в 0,2 М хлорной кислоте. В качестве субстрата использовали дрожжевую РНК («Serva», Германия).
Активность пектолитических и целлюлолитических ферментов анализировали в экстрактах мицелия (Гусева, 1980). В качестве субстрата для по-лигалактуроназы (КФ 3.2.1.15), эндо-Р-1,4-глкжаназьг (или Сх-целлюлазы, КФ 3.2.1.4) и ксиланазы (КФ 3.2.1.8) использовали соответственно 1%-ные растворы пектина, Na-КМЦ и 2%-ный раствор ксилана. Об активности ферментов судили по приросту редуцирующих Сахаров, регистрируемых методом Хагедорна-Йенсена (Методы экспериментальной микологии, 1973). Активность экзо-р-1,4-глюканазы (или Сгцеллюлазы, КФ 3.2.1.91) определяли по количеству глюкозы (Курзина и др., 1980), образующейся в реакционной смеси, содержащей в качестве субстрата хлопковое волокно. Об активности Р-глюкозидазы (КФ 3.2.1.21) судили по интенсивности окраски нитрофенола, образующегося в результате гидролиза р-нитрофенил-р-В-глюкопиранозида (Родионова и др., 1966). Приведённые методики были использованы и при анализе активности пектолитических и целлюлолитических ферментов в растениях пшеницы.
Активность пероксидазы в культуре гриба и у растений пшеницы определяли по методу А.Н.Бояркина, описанному в "Практикуме по биохимии растений» Б.П.Плешковым (1976).
Электрофоретическое разделение белков на первых этапах проводили методом диск-электрофореза в 7,5%-ном полиакриламидном геле, рН 8,9 (Маурер, 1971), а в дальнейшем - в 7,5%-м геле в щелочной (рН 8,9) системе Орнстейна и Дэвиса (Методы экспериментальной микологии, 1982) в пластинах (слабах) на приборе GE-4 фирмы «Pharmacia» (Швеция). По окончании электрофореза слабы фиксировали 30 минут в 12,5%-м растворе трихло-руксусной кислоты и после промывки дистиллированной водой окрашивали на белок 0,2%-м раствором красителя Page blue S3 («BDH Chemicals», Англия), приготовленном в смеси: метанол (этанол) - уксусная кислота - вода, 35:10:55, Отмывку гелей от избытка красителя проводили в этой же системе, после чего их хранили в 7%-м растворе уксусной кислоты, Электрофоре-граммы (гели) фотографировали, зарисовывали и использовали для определения электрофоретической подвижности обнаруженных белковых зон (Rf).
В ряде экспериментов (исследование изозимных спектров эстеразы, кислой фосфатазы, р-глюкозидазы и пероксидазы изолята 85-254 и его му-тантных форм) электрофорез проводили также на пластинах, но с линейным от 5 до 20% градиентом акриламида.
Физиологическая специализация гриба S. nodorum Berk. и патогенность
Известно, что в процессе эволюции у ряда фитопатогенных грибов сформировались физиологические расы, основной особенностью которых является способность поражать только определенные сорта или группы сортов сельскохозяйственных культур. Существуют экспериментально найденные наборы сортов, с помощью которых можно дифференцировать популяции гриба на расы по вирулентности. В отношении возбудителя септориоза вопрос о физиологической специализации и наличии рас до сих пор еще не решен. Имеющиеся на сегодня данные, с одной стороны, позволяют говорить о существовании определенной взаимосвязи между сортами пшеницы и изо-лятами S. nodorum Berk. (Allingham, Jackson, 1981), а с другой, напротив, не дают возможности разделить штаммы на физиологические расы и биотипы (Kristiansson, 1974; Griffiths, Ао, 1980; Bronnimann, 1968; Rufty et al., 1981). He существует поэтому и общепринятого набора сортов - дифференциаторов для S. nodorum Berk..
Учитывая важность дифференциации S. nodorum Berk, по вирулентности, были поставлены предварительные опыты, в которых для этой цели использовали сорта пшеницы, известные в качестве дифференциаторов стеблевой ржавчины. Опыты показали, что все испытанные сорта поражаются сеп-ториозом. Однако степень их поражения в зависимости от использованных изолятов была различной. Так, при инокуляции пшеницы изолятами 538 Б и 166 Д степень поражения колебалась от 4,8 до 48,6%, а в случае применения изолятов 16 Д и 72 Г - от 25,2 до 100%. Особенно большие различия в реакции на данные изоляты возбудителя септориоза отмечены у сортов Маркиз, Арнаутка и Айнкорн. Поэтому эти сорта были использованы во всех дальнейших исследованиях по физиологической специализации.
Из данных 1982 года, представленных в таблице 3.6, видно, что все взятые в опыт изоляты S. nodorum Berk, обладают довольно высокими вирулентными свойствами. Степень поражения ими листьев пшеницы колебалась от 19,6 до 80,4%. Сорт Айнкорн в зависимости от изолята поражался на 33,3-74,8%, Арнаутка - на 19,6-53,3%, а сорт Маркиз - на 29,8-64,4%. Относительно дифференцированную реакцию на изоляты S. nodorum Berk, показали также сорта Алмаз и Эритроспермум 841.
На сорте Айнкорн высокую вирулентность проявили изоляты 810 В, 72 Г и 323 Е (65,5-74,8%). Изоляты 224 Е, 148 Д, 150 Д и 71 Е оказались значительно менее вирулентными. Сорт Алмаз в сильной степени поражался изолятами 25 Д и 71 Е (59,2 и 70,2% соответственно). Остальные изоляты были слабее и практически не отличались между собой по вирулентности. Изоляты 25 Д и 71 Е в сильной степени поражали и сорт Эритроспермум 841, в то же время вирулентность их в отношении сорта Арнаутка оказалась низкой (23,2 и 19,6%). Слабые различия были выявлены на сортах Скала, Ершовская 32 и Харьковская 46, которые в значительной степени поражались септориозом. Сорта Артур 71, Вера, Мэнитоу и Красноводопадская 210, проявившие менее высокую чувствительность к септориозу, практически не обнаружили дифференцирующей способности.
В течение 1983 года было проведено несколько опытов по изучению вирулентности 15 других изолятов S. nodorum Berk. При этом некоторые из изолятов использовались на одном и том же наборе сортов 2-3 раза. Сильно поражаемые септориозом сорта Вера, Харьковская 46, Ершовская 32 и Скала были исключены из тест-набора. Результаты, полученные в этих опытах, представлены в табл. 3.7.
Исследованиями установлено, что все вновь включенные в опыт изоляты обладают высокой вирулентностью. Степень поражения сортов пшеницы септориозом в среднем, как видно из табл. 3.7 (опыты 1-5), колебалась от 65,9 % (изолят 101 Д) до 80,5% (25 Д-83, средняя из двух опытов). При таком проявлении болезни дифференциация по вирулентности затруднена. Тем не менее проведенные эксперименты дают возможность условно разделить все изученные изоляты на две группы. К первой из них можно отнести изоляты, которые проявляют высокую вирулентность по отношению ко всем сортам, использованным в опытах. Это изоляты 25 Д-83, 143 Г, 83-43, 106 Ж, 83-63, 83-30, 83-92, 83-3. Так, изолят 25 Д-83 поражал сорта пшеницы на 63,0-100,0 % (табл. 3.7, опыт 3) и 69,6-92,2% (опыт 4), 143 Г - на 69,5-89,8% (опыт 4), изолят 83-43 - на 70,8-94,7% (опыт 1).
Ко второй группе можно отнести изоляты 176 Е, 83-91, 155 Е, 101 Д, 83-84 и 154 Г, которые также обладают высокой вирулентностью, но проявляют её не на всех сортах. Так, на сорте Арнаутка менее вирулентными ока 94 зались изоляты 176 Е, 83-91 (в среднем из двух опытов) и 155 Е. Относительно слабую вирулентность по отношению к сорту Айнкорн проявил изолят 101 Д (32,6%), тогда как сорта Красноводопадская 210 и Алмаз поражались этим изолятом на 50,6 и 56,6%, а Эритроспермум 841 и Маркиз - на 90,7 и 91,2%.
Следует отметить, что степень поражения некоторых сортов изолятами 83-91 (Кустанайский), 154 Г (Восточно-Казахстанский), 83-84 (Кокчетав-ский) и 191 Е (Восточно-Казахстанский) не всегда была стабильной. Так, у изолята 83-91 степень поражения сорта Арнаутка в зависимости от опыта изменялась от 13,6 до 72,8%, а у изолята 83-84 по отношению к сорту Алмаз -от 34,3 до 97,2%, к сорту Красноводопадская 210 - от 24,7 до 88,8%. По-видимому, это связано с некоторыми изменениями в температурном режиме проведения опытов в период с апреля по август.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что природная популяция возбудителя S. nodorum Berk, гетерогенна по признаку вирулентности. При этом такие изоляты, как 25 Д-83, 143 Г, 83-43, 106 Ж, 83-63, 83-30, 83-92 и 83-3 высоко вирулентны на всех сортах пшеницы, а изоляты 176 Е, 83-91, 155 Е, 101 Д, 83-84, 154 Г и 191 Е обладают вполне определенной, хотя и не всегда четко выраженной избирательностью по отношению к тем или иным сортам.
Было неясно, связана ли обнаруженная избирательность с существованием физиологической специализации у S. nodorum Berk., или обусловлена неспецифическими защитными свойствами растений пшеницы, поэтому в 1984 году были поставлены дополнительные эксперименты, в которых использовали уже испытанные ранее изоляты S. nodorum Berk. Причем опыты ставили не только в теплице, но и в полевых условиях.
Физиологические особенности мутантов гриба S. nodorum Berk, и их роль в адаптации патогена к условиям существования
Данные, приведенные в табл. 4.1, показывают, что размах изменчивости гриба S, nodorum Berk, под влиянием УФ-лучей в основном определяется природой изолята, а не дозой (продолжительностью) облучения. Наибольшее количество морфологически изменённых вариантов было получено у изолятов 83-30 (11) и 259 Г (12). По 7 - 8 мутантов было выявлено у изолятов 390 E, 154 Г, 25 Д и 83-150 , а у изолятов 323 Е, 83-6 - всего 2 и 3 мутанта соответственно. Причем у изолята 83-30 большая часть мутантов была выделена после 3-минутного, у изолята 259 Г - после 4-6 мин., а у изолятов 83-150 и 390 Е - после 6-7 - мин. облучения. Изменчивость изолятов 323 Е и 83-6 оставалась низкой и при увеличении продолжительности УФ-об-лучения до 8-12 минут.
Характерной особенностью большинства обнаруженных мутантов является их лабильность, неустойчивость. Так, у изолятов 323 Е, 83-30, 83-6 и 259 Г все морфологически измененные варианты, полученные в результате УФ-облучения споровой суспензии, оказались нестабильными. Окраска их изменялась уже после двух пассажей. Стабильные мутанты удалось получить только из изолятов 390 Е, 25 Д, 83-150 и 154 Г (табл. 4.2).
Данные мутанты полностью сохраняли свои м орфол о го-кул ьтураль-ные признаки не только после повторных пассажей на КДА, но и при выделении в чистую культуру после инфицирования ими растений пшеницы. Тёмно-синий мутант изолята 390 Е при повторном его облучении продуцировал несколько дополнительных морфологически изменённых вариантов, в том числе розовый и тёмно-синий карлики. Однако основная часть облучённых спор формировала колонии, близкие по морфологическим признакам исходному мутанту (табл. 4.1).
Из данных, представленных в табл. 4.2, видно, что мутанты тёмно-синий и телесно-светло-коричневый (карлик) отличаются от исходных изолятов не только цветом мицелия, но и размерами пикнид и спор. Размеры спор у них варьируют в более широких пределах.
Полученные мутанты отличались от исходных изолятов S. nodorum Berk, и по физиологическим свойствам (патогенности). Все мутанты, за исключением телесно-светло-коричневого карлика, проявляли более высокую патогеиность, чем исходные изоляты. Так, степень поражения листьев у пшеницы сорта Артур 71 при инокуляции её изолятом390 Е была 43,5%, а его мутантом - 90%. Изоляты 83-150 и 154 Г поражали листья на 53,8 и 49,6%, а черно-зелёный и серо-оливковый мутанты - на 90,0 и 78,6% соответственно. Патогенность изолята 25 Д (58,8%) и его мутанта (51,2%) была практически одинаковой.
Таким образом, проведённые исследования показали, что под влиянием УФ- облучения у S. nodorum Berk, происходит интенсивное образование морфологических мутантов, большая часть из которых являются реверсирующими. Стабильные мутанты отличаются от исходных изолятов по морфолого-культуральным и физиологическим признакам, в том числе и по патогенно-сти (вирулентности). Аналогичный процесс формирования новых рас и биотипов S. nodorum Berk., по-видимому, может происходить и в природных условиях.
В дальнейшем эксперименты по индуцированной изменчивости были продолжены, причем для получения мутантов наряду с УФ-лучами использовали и химические мутагены: нитрозо-1-метилмочевину (НММ) и N-метил-Ы-нитро-М-нитрозогуанидин (НГ). А в качестве одного из основных объектов в работе использовали изолят 85-254 гриба S. nodorum Berk.
Проведенные исследования показали (табл. 4.3), что при облучении спор УФ-светом в течение 300-600 сек выживаемость их резко снижается. Одновременно происходит появление в рассевах вариантов, отличающихся по морфологическим признакам. Всего нами выделено семь типов или форм. Причем в большинстве случаев доминирует оливково-песочный вариант, характерный для исходной формы изолята 85-254. За ним следует оливково-песочный с розовым ободком (18,5-50,0%) и черный (15,4-30,5%) варианты.
На долю болотно-оливковых, горчично-оливковых, серо-черных и темно-розовых вариантов приходится всего по 0,7-8,5%. В процессе пересевов обнаруженные морфологические варианты ревертировали. Удалось выделать только два варианта 85-254/1 и 85-245/2, которые в течение трех пассажей сохранили свои особенности.
УФ-облучение суспензии протопластов также приводило к появлению в рассевах изменненых вариантов (табл. 4.4). Однако количество их было ниже, чем при облучении спор. Исходный оливково-песочный вариант независимо от продолжительности облучения составлял от 64,4 до 83,4% от числа просмотренных колоний. Среди других морфологичеких вариантов доминировал черный (11,8-20,8%), а остальные были оливковые с розовым ободком, розово-лиловые и телесно-розовые. Особенностью облучения протопластов является и то, что выживаемость изолята снижалась только при продолжительности воздействия УФ-светом в течение 180-300 сек. Дальнейшее увеличение продолжительности облучения практически не влияло на выживаемость. Пока трудно сказать, связано ли это с природой протопластов или вызвано просмотром недостаточно большого количества колоний.
