Содержание к диссертации
Введение
1. История развития состояния изученности методов терапии плодовых культур от вирусных инфекций 9
1.1. Состояние изученности метода термотерапии плодовых растений от вирусов 9-24
1.2. Современные представления о механизмах термоинактивации фитопатогенных вирусов 24-27
1.3. Состояние изученности химиотерапии многолетних растений от вирусных заболеваний 27-32
1.4. О механизме действия химических веществ на вирусную инфекцию 32-39
2. Материалы и методы.
2.1. Материалы исследований 40-41
2.2. Методы исследований .
2.2.1. Методы термотерапии плодовых культур 41
2.2.1.1. Классический метод термотерапии по A. Campbell (1962) 41-42
2.2.1.2. Термотерапия по методу G. Nyland (I960)
и L.Welsh, G.. Nyland (1965). 42-43
2.2.1.3. Методы микропрививки апексов на сеянцы 43-44
2.2.1.4. Метод укоренения косточковых пород после термотерапии в культуре in vitro 44-46
2.2.2. Подготовка растений косточковых пород к термотерапии 45-46
2.2.3. Подготовка почвенной смеси 46
2.2.4. Применение макро и микроудобрений 46
2.2.5. Применение гиббереллиновой кислоты по I#IacofcE974). 47
2.2.6. Определение теплотолерантности и динамики роста косточковых пород во время термотерапии 47
2.2.7. Методика переноса чистого изолята вируса НКП на травянистые и древесные индикаторы 48-50
2.2.8. Тест методы ...50-51
2.2.8.1. Тест на индикаторе Широфт^ен
2.2.8.1. Иммуно-ферментный метод (Элиза-тест)
2.2.9. Испытание антивирусных веществ 51-52
2.2.10. Методика определения активности рибонуклеази (РНКазы) 52-53
2.2.11. Методика определения количества белка в растениях огурца 53-55
2.2.12. Методика электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГе) 55-57
3. Разработка методов терапии косточковых пород от вирусных заболеваний 57
3.1. Совершенствование устройства термокамеры типа ЕА.Т-3... 57-63
3.2. Изучение факторов, влиявдих на рост и выживание растений косточковых пород в период их термообработки 63-64
3.2.1. Изучение влияния почвенной смеси на выживание растений вишни, черешни, сливы в процессе термообработки 64-70
3.2.2. Влияние макро и микроудобрений на рост растений вишни, черешни и сливы во время термообработки 70-72
3.2.3. Влияние стимулирующих веществ на рост растений вишни, черешни, сливы в период термообработки 72-82
3,2А. Изучение динамики роста и теплотолерантности сортов вишни, черешни и сливы в период термообработки 82-93
4 3.3. Разработка способа сохранения и укоренения материала, полученного в результате термообработки 93-95
3.3.1. Результаты инактивации вирусной инфекции в спящих латеральных почках вишни,черешни, сливы по M#F.Welsh HG. Nyland (1962, 1965) 95-102
3.3.2. Разработка метода микропрививок апексов на безвирусные сеянцы , 102
3.3.3. Разработка совместного применения метода термотерапии и культуры тканей 102-108
4. Разработка метода химиотерапии косточковых пород 109
4.1. Изучение воздействия некоторых химических веществ на вирус НКП в тканях косточковых пород I09-II9
4.2. Изучение механизма действия химических веществ виру са НКП в тканях растений II9-I27
Выводы 128-129
Список литературы
- Состояние изученности химиотерапии многолетних растений от вирусных заболеваний
- Метод укоренения косточковых пород после термотерапии в культуре in vitro
- Изучение факторов, влиявдих на рост и выживание растений косточковых пород в период их термообработки
- Изучение механизма действия химических веществ виру са НКП в тканях растений
Введение к работе
Введение 6-8
1. История развития состояния изученности методов терапии плодовых культур от вирусных инфекций 9
1.1. Состояние изученности метода термотерапии плодовых растений от вирусов 9-24
1.2. Современные представления о механизмах термоинактивации фитопатогенных вирусов 24-27
1.3. Состояние изученности химиотерапии многолетних ,растений от вирусных заболеваний 27-32
1.4. О механизме действия химических веществ на вирусную инфекцию 32-39
2. Материалы и методы.
2.1. Материалы исследований 40-41
2.2. Методы исследований .
2.2.1. Методы термотерапии плодовых культур 41
2.2.1.1. Классический метод термотерапии по A. Campbell (1962) 41-42
2.2.1.2. Термотерапия по методу G. Nyland (I960)
и L.Welsh, G.. Nyland (1965). 42-43
2.2.1.3. Методы микро прививки апексов на сеянцы 43-44
2.2.1.4. Метод укоренения косточковых пород после термотерапии в культуре in vitro 44- 2.2.2. Подготовка растений косточковых пород к термотерапии 45-46
2.2.3. Подготовка почвенной смеси 46
2.2.4. Применение макро и микроудобрений 46
2.2.5. Применение гиббереллиновой кислоты по IIacofcE974).
2.2.6. Определение тепло толерантности и динамики роста косточковых пород во время термотерапии 47
2.2.7. Методика переноса чистого изолята вируса НКП на травянистые и древесные индикаторы 48-50
2.2.8. Тест методы .50-51
2.2.8.1. Тест на индикаторе Широфт ен
2.2.8.1. Иммуно-ферментный метод (Элиза-тест) 2.2.9. Испытание антивирусных веществ 51-52
2.2.10. Методика определения активности рибонуклеази (РНКазы) 52-53
2.2.11. Методика определения количества белка в растениях огурца 53-55
2.2.12. Методика электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГе) 55-57
3. Разработка методов терапии косточковых пород от вирус ных заболеваний 57
3.1. Совершенствование устройства термокамеры типа ЕА.Т-3... 57-63
3.2. Изучение факторов, влиявших на рост и выживание растений косточковых пород в период их термообработки 63
3.2.1. Изучение влияния почвенной смеси на выживание растений вишни, черешни, сливы в процессе термообработки 64-70
3.2.2. Влияние макро и микроудобрений на рост растений вишни, черешни и сливы во время термообработки 70-72
3.2.3. Влияние стимулирующих веществ на рост растений вишни, черешни, сливы в период термообработки 72-82
3,2А. Изучение динамики роста и тепло толерантности сортов ,вишни, черешни и сливы в период термообработки 82-93
\/ 3.3. Разработка способа сохранения и укоренения материала, полученного в результате термообработки 93-95
3.3.1. Результаты инактивации вирусной инфекции в спящих латеральных почках вишни, черешни, сливы по M F.Welsh HG. Nyland (1962, 1965) 95-102
3.3.2. Разработка метода микро прививок апексов на безвирусные сеянцы , 102
3.3.3. Разработка совместного применения метода термотерапии и культуры тканей 102-108
4. Разработка метода химиотерапии косточковых пород 109
4.1. Изучение воздействия некоторых химических веществ на вирус НКП в тканях косточковых пород I09-II9
4.2. Изучение механизма действия химических веществ вируса НКП в тканях растений II9-I27
Выводы 128-129
Список литературы I3I-I62
Состояние изученности химиотерапии многолетних растений от вирусных заболеваний
Химиотерапия как метод специфического лечения инфекционных заболеваний химическими веществами возникла на рубеже XIX-XX веков (Парибок В.Л., 1961), Пауль Эрлих (I9II) охарактеризовал химиотерапию как избирательное действие на возбудителей средствами, которые с одной стороны воспринимаются определенными паразитами и способны убивать их, а с другой стороны переносятся организмом без большого вреда для него в дозах, необходимых для умертвления паразита.
Первые сообщения о веществах, способных препятствовать переносу вирусной инфекции от одних восприимчивых растений к другим встречаются в работах Н.А. Allard (1918). Он показал, что с соком мозаичных растений лаконоса ( Phytolacca decandra L. ) можно заразить здоровые растения того же вида, но нельзя передать инфекцию на растения табака.
R#E.F«Matthews и J.D. Smish (1955), а в нашей стране АД. Бобырь (1976)Сформулировали химиотерапию, как снижение или инги-бирование до некоторой степени размножения вируса или развития болезни. Большинство веществ, обладающих некоторой активностью против вирусов растений и животных, являются ингибиторами только тогда, когда вводятся до или на ранних стадиях заражения, и их действие лучше считать профилактическим.
Сегодня химиотерапия с успехом применяется в борьбе с вирусными заболеваниями человека и животных. Однако в борьбе с растительными вирусами этот метод не нашел пока широкого применения в практике.
Определенные успехи достигнуты в разработке методов химиотерапии хорошо изученных: с окопереносимых вирусов табака, томатов, картофеля, огурца, фасоли (Даль E.G. и др., 1978), Бобырь А.Д., 1976, Fazio G. et al 1978, Schuster H. и др. 1979, 1981, 1982, 1983). Инактивацию или замедление репродукции вирусных частиц в этих растениях могут вызывать вещества различной природы: ферменты (Мартынова Р.В., РейфманВ.Г., 1971, 1977, Marchoux G. ,1970, WEnzel G. , 1971); физиологические активные вещества (Імурко Л.Н. Бобырь А.Д., 1971, Aldvinskle Herb S. , 1975, Praser R.S.S., Whenham P. J» , 1978) в том числе регуляторы роста ( Shukla R.f Ioshi R« D» , 1981, Daft м«І. , 1965) фенольные соединения (Крылов A.B., Усольцева Л.В., 1976, Regenmorfel et al.t 1971); антибиотики (Бобырь А.Д., 1972, 1976, Маркові., 1980, Kassamo M«H.,Shimomura Т., 1982), различные природные и синтетические химические вещества (Костин В.Д. и др., 1974, Крылов А.В., Усольцева I.B., 1976, Fasio G. et al. , 1978, Schuster H. , 1979). Однако следует сказать совершенно определенно, что ни одно из названных веществ и химиотерапия в целом не нашли пока широкого применения как метод борьбы и профилактики вирусных заболеваний растений.
В области химиотерапии вирусов многолетних культур, даже лабораторные разработки весьма немногочисленны. Правда, имеется немало работ об успешном применении антибиотиков против микоплаз-менных заболеваний, т. Ishiie и др. (1967) одними из первых показали, что тетрациклин угнетающе действует на развитие растительных микоплазм, этот факт используется в настоящее время для доказательства микоплазменной природы заболеваний с невыясненной этиологией (Якушина Г.А. и др. 1977).
На плодовых культурах антибиотики применяются против микоплаз менных заболеваний яблони и груши - пролиферации ( Proliferetion deseuses ) и отмирания груши ( Pear decline ). В.Сейдл и В.Комаркова (1977) показали, что обработка метельчатых побегов зараженной пролиферацией яблони, перед окулировкой на сеянцы раствором антибиотиков в концентрации 100 и 200 мг/л в течение 24 и 48 часов снижала поражение саженцев этим заболеванием с 59,6% в контроле до 0,5% в опыте. G« Nyland и Y.William (1973) вводили в пораженные деревья груши водные растворы тетра
щшлина в концентрации от 25 до 200 мг/мл при помощи специальных приспособлений. Было установлено сильное снижение инфекции и увеличение размера плодов. J.A Sanchez - Сариспіпои др. (1979) применяли тетрациклин против пролиферации яблони и наблюдали снижение инфекции в течение трех лет после обработки. Такую же закономерность установили и некоторые другие авторы (Zawadzca Б«, Ка-minskaM. , I973,Flegg G.L., Crosse G.E. , I977,Gheorghiu E.,I977, Dude К«11« et al. , 1977, Mclnture J.L« et al. ,1978, Westphalen H«J.,Hess H«W, 1980, Scheper U«, Seemuller E. , 1982).
Достаточно детально исследовано применение антибиотиков на косточковых породах, в частности, против Х-болезни персика. G.Nyland (1975) вводил окситетрациклин - HCI в концентрации 50-100 мг/л в ствол дерева. Обработанные таким образом деревья оставались без симптомов в течение трех лет.
Метод укоренения косточковых пород после термотерапии в культуре in vitro
В проводимых опытах изучалась возможность окоренения в культуре in vitro верхушек, девяти сортов трех косточковых пород. Прошедшие термообработку верхушки побегов длиной 1-2 см срезались с растений по окончании термообработки. У них были удалены все листья. Затем верхушки помещали в 0,15? дезинфицирующий раствор диаци-да на 5 минут. После этого в течение I часа выдерживали в стерильной дистиллированной воде и хранили в стерильных чашках Петри.
Выделение апикальных верхушек размером около I мм осуществлялось глазным скальпелем под бинокуляром в пылезащитных камерах ПЗК-4.
С помощью медицинского пинцета меристематическая верхушка помещалась на питательную среду Джонса ( Jones О. и др., 1979),состоящую из макро- и микроэлементов по MypacHre-CKyro(Myrashige т. SKoog F., 1962) с добавлением тиаминхлорида (витамин By) - 0,4 мг/л; мезоинозитола - 100 мг/л; ШП.1 - I мг/л; ИМК - 0,5 мг/л; гибберел-лина - 0,1 мг/л; флороглюцина - 162 мг/л; сахарозы - 30 гр/л; агара ДЦФК0 - 7 г/л, которая предварительно была стерилизована в автоклаве при I атмосфере в течение 25 минут.
Первичные эксплантаты культивировались в пробирках размером 14x1,5 см и 14x2 см с 10 мл среды. Пассажи осуществлялись в колбах ЭрлеЯмейра объемом 250 мл со 100 мл среды. На укоренение побеги высаживались на ту же среду Джшса, но без ЕіШа и с ИМК-5 мг/л. Пассажи на питательную среду того же состава делались через 3-5 недель, в зависимости от степени заполнения культивационного сосуда новооб-разовавщимися побегами. Культивирование осуществлялось в специальной комнате с температурой воздуха 24-25С, 16 часовым фотопериодизмом и интенсивностью освещения около 3 тыс.люксДг. Полученные регенеранты пересаживали в перлит и выдерживали при 100% влажности 7-Ю дней. В течение 30 дней влажность постепенно снижали и растения пересаживали в теплицу, где после короткой адаптации их высаживали в почвенную смесь, состоящую из листового перегноя, торфа, речного песка в соотношении 1:1:1 (Богуш Л.Ю., Чернец A.M. 1983; Чернец A.M. 1983). Полученные данные математически обрабатывали по Б.А.Доспехову (1979).
Подготовка растений косточковых пород к термотерапии.
Весной 1980-1982 гг. сеянцы вишни магалебской (Prunus maga-leb L. ), черешни (Prurms avium L ), алычи ( Primus cerasifera %. высаживали в 3-х литровые гончарные горшки с почвенной смесью и размещали в теплице. Осенью на укорененные сеянцы окулировали сорта, подлежащие оздоровлению от вирусов путем термотерапии. На каждый сеянец прививали по 2 почки. Выращенные из этих окулянтов сажен цы до весны следующего года содержались в теплице для образования хорошей корневой системы. Перед помещением растений на термообработ ку их обрезали на 2 или 10 почек (в зависимости от варианта опыта) и обрабатывали 0,1-0,3% раствором пликтрана для защиты от паутинного клеща.
Для приготовления почвенной смеси использовали листовой перегной, торф, речной песок. В опыте их смешивали в соотношении 1:1:1. В контроле использовали почвенную смесь, которая с успехом применяется для термотерапии семечковых пород. Названные компоненты в ней соединяются в соотношении 2:1:0,5. Для повышения доступности растениям питательных веществ и придания смеси большей однородности ее просевали через сито с отверстиями 3 мм (Юдин Ф.А., 1980).
Почвенную смесь помещали в 3-х или 10-и литровые горшки, предварительно промытые водопроводной водой и 4$ раствором КмпО . В каждый горшок набивали от 3 до 10 кг смеси. Влажность почвы в сосудах доводили до 60$ полной влагоемкости.
На термообработку растения помещали по схеме опыта (3 растения опытных, 2 - контрольных). Положительное действие почвенной смеси определяли по увеличению прироста в опыте по сравнению с контрольными растениями. Полученные данные обрабатывали математически по Б.А.Доспехову (1979).
В процессе термотерапии растения подкармливались макро и микроэлементами по схеме: 3 растения опыт, 2 - контроль. Состав и количество макроэлементов определяли, согласуясь с работами N.Minoiu (1974), Ю.И.Помазкова (1977), Ф.А.Юдина (1980). Их вносили в следующих дозах: аммиачная селитра - 2 г/л; калийная соль - 3 г/л; суперфосфат - 5 г/л; сульфат магния - 5 мг/л; азотнокислый кальций - 10 г/л. Полученный раствор вносили по 250 мл на 3 кг почвы через каждые 10 дней термообработки.
Соотношение микроэлементов определяли, исходя из данных работ N. Minoiu (1974, 1977). Был использован и следующий состав микро- элементов: LiS04 - 0,0278 г/л; 0uS04 - 0,0556 г/л; ZnS04 - 0,0556 г/л; H BO. -0,0611 г/л; MnSO - 0,0556 г/л; Ni2S04 - 0,0556 г/л; FeSO -0,0556 г/л; KJ - 0,0278 г/л; КВг - 0,0278 г/л.
Растения подкармливали микроудобрениями 3 раза за цикл термообработки. Раствор наносили опрыскиванием до полного обмывания листьев. Действие макро- и микроудобрений определяли по увеличению прироста в опыте по сравнению с контролем. Математическая обработка данных проводилась по Б.А Цоспехову (1979).
Изучение факторов, влиявдих на рост и выживание растений косточковых пород в период их термообработки
Широкое распространение на косточковых породах ИЛАР-вирусов сделало почти невозмошшм выделение исходных безвирусных растений методом отбора и поставило перед нами задачу получения их путем терапии полностью зараженных сортов и подвоев.
Для семечковых пород метод термотерапии3именуемый иногда классическим, разработан достаточно хорошо (Шиманский X., 1977, ОатрЪеП A. , 1961, 1962, 1968, 1970, Kegler Н. , 1967, Meer P.D., van der , І970а,В, Мілоіи N. , 1977, ВАШАШ G. , 1983) И в Молдавской ССР впервые использован И.Г.Цурканом (1973, 1975, 1979).
Однако применение классического метода термотерапии для получения безвирусных клонов косточковых пород, как правило, дает неудовлетворительные результаты: растения, помещенные в термокамеру, дают слабый прирост и быстро отмирают; верхушки, отросшие за время термообработки, как правило, хлоротичны и вытянуты; приживаемость их после прививки на безвирусные сеянцы обычно очень низкая; у нас она не превышала Ъ%, Все эти факторы удлиняют и удорожают работы, связанные с оздоровлением косточковых пород от вирусов, и нередко при производстве безвирусных клонов определенных сортов ставят исследователей в тупик ( Janeckova М., Blabtny 0., 1980).
Приступая к разработке метода термотерапии косточковых пород, мы проанализировали причины неудач наших предшественников и пришли к выводу, что в существующих методиках имеются два "узких" места: - сильное угнетение растений в термокамере, что вызывает их слабый рост и быстрое отмирание; - крайне слабая приживаемость полученных в результате термо терапии верхушек привитых на безвирусные сеянцы.
Установив лимитирующую роль названных факторов, мы приступили к разработке мероприятий, направленных на их преодоление.
1. Для улучшения роста и выживания растений в термокамерах были запланированы следующие исследования: - изучение влияния почвенной смеси на рост и выживание растений; - изучение воздействия макро- и микроудобрений на рост расте ний в термокамере; - изучение влияния ростовых веществ в период адаптации и самой термообработки на рост и развитие растений в термокамерах; - определение сравнительной температурной выносливости сортов вишни, черешни, сливы и динамики роста побегов в процессе термотерапии.
2. Для успешного сохранения и укоренения материала, получен ного в результате термотерапии: - изучение эффективности термотерапии по методу G# Nyland , (1962); - использование микропрививки апексов на безвирусные сеянцы косточковых пород; - совмещение классического метода термотерапии с культурой изолированных тканей на искусственных питательных средах.
Изучение влияния почвенной смеси на выживание растений вишни, черешни, сливы в процессе термообработки.
Изучая литературу, мы обратили внимание, что если такие факторы как освещенность, газообмен, температура и влажность воздуха и почвы достаточно полно исследованы и описаны ( Campbell д., 1970, Groot А. , 1970, Jacob Н. , 1974, Цуркан И.Г., 1975, Lenz F.et al., 1983), то влияние почвенной смеси на рост и жизнедеятельность растений при термотерапии почти не изучено. Между тем плодовода,изучающие рост косточковых пород в условиях открытого грунта показали, что деревья этих пород лучше растут на более легких почвах (Шитт П.Г., 1958, Илларионова Н.П., 1977). Мы предположили, что почвенный фактор должен иметь еще большее значение для роста и жизнедеятельности растений в экстремальных условиях термокамеры.
Для изучения влияния почвенного состава на прирост и выживание растений при высоких температурах были испытаны две смеси. В опытах использовали легкую по механическому составу смесь (листовой перегной: торф : песок - 1:1:1), а в контроле почвенную смесь обычно применяемую при термотерапии семечковых пород (листовой перегной : торф : песок - 2:1:0,5). Растения вишни, черешни, сливы (по три сорта каждой породы) перед термотерапией в течение года выращивались в условиях теплицы на этих почвенных смесях (рис. 4,5,6).
Затем их обрезали на 2 почки, обрабатывали 0,2$ раствором шшктрана против паутинных клещей и помещали в апреле месяце на обработку в термокамеру (рис.7). Влияние почвенной смеси на рост растений определяли по величине прироста, образовавшегося во время обработки. Результаты представлены в табл. I.
Анализ таблицы показывает, что у большинства сортов вишни,черешни и сливы лучший рост был на легкой почве в опыте. Исключение составил сорт черешни Молдавская черная, у которой не наблюдалось существенной разницы с контролем. Сравнивая прирост у различных сортов, мы отметили, что сорт вишни Подбельский был наиболее отзывчив на изменение почвенной смеси (33,3 см).
Изучение механизма действия химических веществ виру са НКП в тканях растений
Получив терапевтический эффект в результате введения в зараженные вирусом НКП растения черешни и вишни названных выше препаратов: ДНТ и стероидных глжсозидов мы стремились объяснить это яв ление. Как мы уже сообщали в литературном обзоре, по этому вопросу существуют различные мнения. Однако большинство авторов полагают, что химические вещества действуют не прямо на вирус, а кос 120 венно, через метаболизм растений (Бобырь А.Д., 1976; Kassanis White ,1977; Marchoux G. , 1970). Есть сведения о том, что на инактивацию вирусов влияют вещества белковой природы, которые блокируют синтез РНК (Коваленко А.Г,, 1983), Д.В.Липсиц, В.Д.Князев, А.П.Николаева (1971) показали, что в тканях устойчивых сортов картофеля, в ответ на заражение Х-вирусом картофеля, значительно повышается содержание ингибиторов белковой природы. Сходные данные получили чешские ученые ( Jermijev Е., Albrechtova L., 1965, 1966 а,в). М.Е.Ладыгина и др. (1973) показали, что чем растения устойчивей к вирусам, тем больше белковых ингибиторов присутствуют в их тканях, а оинтез РНК в устойчивых растениях более стабилен чем у восприимчивых.
Большую роль среди ингибиторов вирусной инфекции играют ферменты, особенно нуклеазиды. Факт, что РНКаЗа обладает ингибирую-щим действием на вирусы, сообдалось многими авторами (Салганик Р.И. и др., 1966; Мартынова Р.В., Рейфман В.Г., 1969). Особый интерес представляют работы, в которых показана зависимость между степенью развития инфекции и активностью РНКазы ( Marchoux G. , 1970; непе V.L. , Thornberry H.H. ,1970). Однако в некоторых исследованиях введение в зараженные растения панкриатичес-кой РНКазы не снизило концентрации вируса и не изменило активности фермента ( Wenzel G. ,1971).
Среди факторов, влияющих на образование приобретенной устойчивости у вирусных растений, обработанных химическими веществами, называют образование новых белков. Предполагают, что растения образуют специфический белок, блокирующий синтез вирусной РНК (Kassanis В. , White R.F,I977).
Учитывая все сказанное выше, нами были проведены исследования по определению количества белка и активности РНКазы в растениях, зараженных вирусом НКП и обработанных антивирусными препаратами, а также изучение образования в тканях этих растений специфических белков.
Нами было определено количество белка в растениях огурцаздоровых и зараженных чистым изолятом вируса НКП, а также в больных растениях, обработанных химическими веществами, обладающими виро-цидной активностью. В этих опытах были испытаны 4 препарата: ДНТ (2,4 диоксигексо 1,3,5-триазин) и CKB-II30, химические препараты, описанные в ГДР как ингибиторы вирусной инфекции табака и картофеля, а также томатонин ж пурпуриогитозид - природные стероидные глюкозиди, обладающие антивирусными свойствами. Ранее нами установлено, что все эти препараты могут также инактивировать вирус НКП.
Названные вещества использовали в следующих концентрациях: 0,1; 0,05; 0,01; 0,005; 0,001$. В растворы этих веществ помещали на 24 часа здоровые и зараженные чистым изолятом вируса НКП растения огурца. После этого определяли в них количество белка. Результаты показаны на диаграмме 4. Из диаграммы видно, что в зараженных вирусом растениях содержание белка было выше, чем в безвирусных,что легко объясняется накоплением в растениях вирусного белка (Ладыгина М.Е. и др., 1973; ІИПСИЦ Д.В., 1971; Germoljev, Albrechtova , 1966, 1967). Однако в растениях,обработанных антивирусными веществами 19 случаях из 20 количество белка было выше, чем в зараженных вирусом. Наиболее высокое содержание белка наблюдалось при обработке растений препаратом ДНТ в концентрации 0,01$ (299,7 мг/гр), то есть в том варианте, где было отмечено наибольшее ингибирование вируса НКП в соответствующих опытах. Мы предположили, что увеличение белка в обработанных химическими веществами растениях может быть
Как ми уже писали выше, в научной литературе среди факторов, определяющих приобретенную устойчивость растений к вирусным заболеваниям, называют образование специфического белка с молекулярной массой приблизительно равной 16 000. Полагают, что этот белок блокирует синтез вирусной РНК (Коваленко А.Г., 1983; Kassanis В., White R.F. , 1977; Gessler О., Kuc J. , 1982).
Для изучения возможной роли найденного нами белка в механизме антивирусного действия химических веществ был проведен электрофорез в ПААГе растений огурца, зараженных изолятом вируса НКЇЇ, после обработки их антивирусным препаратом ДНТ в концентрации 0,01; 0,005; 0,001/6. Электрофорез проводили через 2,6,12,24,48,72,96 часов с момента обработки растений ДНТ. Предполагаемый специфический белок удалось обнаружить через 24 часа с момента обработки ДНТ в концентрации 0,001%.
Результаты показаны на электрофореграмме I. Из данных элект-рофореграммы видно, что в обработанных ДНТ растениях появляется дополнительная полоса с Pf - 0,69. В контрольных образцах такой полосы не наблюдалось. Молекулярная масса этого белка приблизительно равнялась 50-60 тыс., исходя из .того, что молекулярная масса свидетеля - альбумина равна 45 000 и находилась в зоне Pf = 0,75.
