Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Вирусные и фитоплазменные болезни земляники, состояние и перспективы их диагностики и защитных мероприятий. Обзор литературы ... 12
1.1. Биологические особенности земляники, как растения-хозяина вирусов 12
1.2. Систематика и биологическая характеристика вирусов-патогенов земляники 18
1.3. Распространенность и вредоносность вирусов, поражающих землянику 30
1.4. Характеристика и систематика возбудителей фитоплазмозов земляники 38
1.5. Методы диагностики и исследований вирусов земляники 43
1.5.1. Визуальная диагностика 45
1.5.2. Индикаторная диагностика 47
1.5.3. Индексирование вирусов земляники с помощью переносчиков 51
1.5.4. Иммуноферментный анализ 51
1.5.5. Полимеразная цепная реакция 54
1.5.6. Электрофорез 58
1.5.7. Электронно-микроскопическая диагностика 60
1.6. Методы диагностики фитоплазмозов 61
1.7. Современные направления защиты земляники от вирусных болезней 65
1.7.1. Методы оздоровления растений земляники от вирусов 66
1.7.1.1. Термотерапия, как метод оздоровления 66
1.7.1.2. Оздоровление от вирусов методом культуры меристем 68
1.7.1.3. Химиотерапия в системе защиты от вирусных болезней 71
1.7.2. Селекция на вирусоустойчивость 80
1.7.3. Защита посадок земляники от перезаражений вирусами 84
Глава II. Материалы, условия и методы исследований 90
Глава III. Анализ особенностей патогенеза при вирусных болезнях земляники 108
3.1. Распространенность вирусных болезней земляники 108
3.2. Изучение этиологии нового заболевания земляники 127
3.3. Особенности патогенеза при смешанных микозно-вирусных инфекциях на землянике 142
Глава IV. Сравнительная оценка современных методов диагностики вирусов земляники 151
4.1. Оптимизация диагностики вирусов земляники индикаторным методом... 152
4.1.1. Влияние возраста тестируемых растений на достоверность результатов 153
4.1.2. Влияние температуры на результаты тестирования в условиях теплиц ... 156
4.1.3. Совершенствование способа прививки для тестирования земляники на зараженность вирусами 163
4.1.4. Выявление новых растений-индикаторов 168
4.2. Сравнение эффективности методов индикаторного и серологического (ИФА) для выявления вирусов земляники 171
4.3. Выявление зараженности земляники вирусами методом ПНР 175
4.4. Сравнение экономической эффективности вирусологического тестирования земляники разными методами 184
Глава V. Использование биотехнологических методов в системе оздоровления земляники от вирусов 193
5.1. Анализ технологичности и эффективности оздоровления сортов земляники методом культуры меристем 194
5.1.1. Сортовая реакция земляники на культивирование верхушечных меристем in vitro 194
5.1.2. Изучение длительного клонирования земляники в культуре in vitro 198
5.1.3. Эффективность оздоровления различных сортов земляники методом культуры меристем 206
5.1.4. Влияние исходной зараженности вирусами на регенерационную способность растений и оздоровление in vitro 212
5.2. Улучшение адаптации микрорастений земляники к нестерильным условиям 215
5.2.1. Оптимизация почвенного субстрата для микрорастений земляники 216
5.2.2. Использование биопрепаратов и антибиотиков при клональном микроразмножении земляники 219
5.2.3. Эффективность применения биорегуляторов-симбионтов для повышения адаптационной способности микрорастений земляники 227
5.3. Использование ингибиторов вирусов при оздоровлении земляники методом культуры верхушечных меристем 230
5.4. Результаты изучения антивирусных свойств ретардантов на землянике...240
5.5. Результаты изучения антивирусных свойств иммуноцитофита 245
5.6. Выявление мутагенных свойств у антивирусных препаратов 252
5.7. Оценка перспективы использования ионизирующего излучения для
оздоровления и размножения земляники 254
Глава VI. Разработка новых элементов и совершенствование технологических процессов при производстве оздоровленного посадочного материала земляники в селекции и питомниководстве 262
6.1.Необходимость и преимущества оздоровления земляники ДЛЯ СЄЛЄКЦИИ...262 6.2. Совершенствование технологии производства оздоровленного посадочного
материала земляники 274
Выводы 294
Рекомендации производству 296
Библиографический список
- Систематика и биологическая характеристика вирусов-патогенов земляники
- Изучение этиологии нового заболевания земляники
- Влияние температуры на результаты тестирования в условиях теплиц
- Сортовая реакция земляники на культивирование верхушечных меристем in vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы. Земляника садовая во всем мире является доходной и популярной ягодной культурой, урожайность которой может достигать 90-100 т/га. Ее плоды являются уникальным диетическим продуктом для человека, способствующим профилактике комплекса важнейших заболеваний. Поэтому земляника должна быть доступна для широких кругов населения России в свежем или замороженном виде круглый год, желательно за счет собственного производства.
Специфика современного состояния плодоводства России состоит в том, что большинство площадей под земляникой находится в личных подсобных, мелких фермерских хозяйствах, а также питомниках, преобразованных в фирмы и акционерные организации, и находятся вне сферы государственного контроля. Массовая неконтролируемая торговля посадочным материалом способствует расширению видового состава патогенов и вредителей. Это привело к тому, что распространение грибных, бактериальных, вирусных инфекций в России носит комплексный характер и принимает угрожающие размеры, сопоставимые с уровнем паразитарного загрязнения, наблюдаемого в слаборазвитых странах Африки, Азии, Латинской Америки, способствует снижению продуктивности земляники, а нередко ее полной деградации.
Вирусы являются хроническими патогенами, ущерб от которых трудно наблюдать на фоне острых, нередко летальных микозных заболеваний, тотального уничтожения или деформации органов вредителями, стрессов абиотической природы и из-за плохой агротехники. Суммарные потери урожайности от вирусных болезней значительно труднее поддаются оценке, чем от других болезней. Поэтому многими плодоводами высказываются сомнения в наличии существенного ущерба землянике от вирусов и как следствие, об экономической целесообразности ее оздоровления. Для вегетативно размножаемых культур, к которым относится земляника,
проблема вирусных заболеваний усугубляется накоплением смешанных инфекций и передачей их последующим поколениям.
Из-за того, что вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, и цикл развития их теснейшим образом связан с обменом веществ клеток растений-хозяев, терапия заболевших растений практически невозможна [К. Смит, 1960; Ю.Н. Журавлев, 1979; Ю.Т. Дьяков, 1984; ГЛ. Сиссонс и др., 1989]. Эффективное снижение вредоносности вирусов в условиях сложившейся системы садоводства возможно посредством комплексного оздоровления от них посадочного материала и последующей защиты его от перезаражений [СМ. Соколова, 1986; Ю.И. Осипов, М.И. Джигадло, 1987; Отраслевые стандарты..., 1988; В.И. Кашин и др., 1993; Н.А. Паскеев, 2001]. Созданная в России в 70-х годах XX века система производства оздоровленного от вирусов посадочного материала земляники в настоящее время фактически разрушена, что может привести к вырождению этой ценной культуры.
Для эффективного контроля вирусных заболеваний земляники необходимо всестороннее изучение и уточнение вирусного патогенеза, информация о современном видовом составе вирусов, их взаимоотношениях с другими патогенами и вредоносности, а также наличие быстрой и достоверной диагностики.
Важнейшим требованием при производстве посадочного материала земляники является проверка исходных, а также полученных в процессе оздоровления растений на отсутствие в них вирусных патогенов. Выявление вирозов и фитоплазмозов земляники отличается большой сложностью. Практически все сорта являются бессимптомными носителями, и их визуальная диагностика невозможна. Основные специфические вирусы, поражающие эту культуру, нестойки вне клетки растения, частицы их необратимо разрушаются в экстрактах сока или в процессе очистки [СМ. Соколова, 1988; R.H. Converse, A.N. Adams et al., 1988]. Получение
антисывороток к таким вирусам для проведения серодиагностики затруднено, хотя ряд вирусов, поражающих землянику обладают хорошими иммуногенными свойствами. Широкое внедрение для тестирования иммуноферментного анализа ограничило круг выявляемых вирусов и почти полностью вытеснило универсальный метод прививки на растениях-индикаторах, требующий длительного времени и использования больших площадей в защищенном грунте. Вследствие этого стали упускать из виду специфичные для земляники ацидофильные вирусы, возбудители «вырождения» культуры в основных регионах ее возделывания.
В связи с этим в настоящее время возникла необходимость мониторинга существующего видового состава вирусов земляники, совершенствования используемых методов диагностики вирусов земляники для повышения их достоверности, снижения продолжительности и трудоемкости, а также разработки и внедрения новых современных молекулярно-генетических методов.
К 80-м годам XX века отечественная наука и практика достигли заметных успехов в диагностике вирозов земляники и мерах борьбы с ними, но за последние полтора десятилетия в РФ производство сертифицированного, чистосортного, свободного от комплекса наиболее опасных вредителей и болезней посадочного материала было практически свернуто. Была нарушена целостность и последовательность процессов оздоровления и защиты безвирусных клонов от повторного заражения. Многие используемые ранее способы и средства борьбы с вирусными инфекциями и особенно с их переносчиками, другими наиболее опасными патогенами и вредителями, были основаны на применении высокотоксичных химических препаратов для их уничтожения, что наносило серьезный ущерб окружающей среде, неблагоприятно воздействовало на биоценологические связи различных компонентов этой среды.
Поэтому актуальными направлениями борьбы с фитопатогенами являются те, которые позволяют влиять на экспрессию защитных механизмов растений, сочетая высокую эффективность и экологическую безопасность. Необходимо совершенствование и внедрение в практику высокопроизводительных биотехнологических приемов, позволяющих получать достаточное количество оздоровленных от вирусов растений земляники, разрабатывать методы защиты растений от вирусов, основанные на стимуляции их естественной устойчивости с помощью экологически безопасных биологически активных веществ, способных благотворно влиять на рост и развитие растений.
Достаточно подробно вирусные и фитоплазменные заболевания ягодных культур, в том числе земляники, изучались в 60-80 гг. XX века Ю.И. Помазковым, М.А. Келдыш, А.П. Мишиной, Л.В. Наумовой, Э.А. Власовой, Л.Н. Самсоновой, Э.И. Лариной. Много внимания уделялось распространенности, идентификации, а также способам их распространения, в частности, векторному тлями. Исследования Н.Д. Романенко, А.А. Томилина были посвящены неповирусам и их переносчикам - нематодам. Широкое распространение получил метод оздоровления растений земляники от вирусов с помощью культуры меристем [Ю.Г. Попов, А.П. Мишина, 1972; Н.М. Абраменко, 1973; Т.Д. Вердеревская, 1977; И.В. Жаркова, О.О. Белошапкина, Л.И. Чефранова, 1982; В.А. Высоцкий и др., 1984] и термотерапии [И.Г. Цуркан, 1971; В. Басак, 1977].
Настоящая диссертация, учитывая историческое развитие проблемы и ее современное состояние, посвящена теоретическому и практическому обоснованию и созданию системы производства оздоровленного посадочного материала земляники с использованием различных методов диагностики и терапии на основе анализа вирусного патогенеза с учетом видового разнообразия вирусных и фитоплазменных патогенов, их взаимоотношений и вредоносности.
Цель исследований. Теоретически обосновать и экспериментально усовершенствовать систему защиты земляники садовой от комплекса вирусных и фитоплазменных заболеваний на основе оптимизации производства оздоровленного посадочного материала.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
определить распространенность и видовой состав вирусов земляники в Нечерноземном Центре РФ, их взаимоотношения с патогенами другой этиологии;
усовершенствовать и стандартизировать методы диагностики вирусов земляники с помощью растений-индикаторов для практического тестирования, повысить их достоверность, снизить влияние факторов окружающей среды;
апробировать и оптимизировать молекулярно-генетические методы для диагностики вирусов при производстве посадочного материала земляники;
повысить эффективность оздоровления земляники от вирусов за счет применения экологически безопасных средств и способов, включая антивирусные препараты и активизацию защитных механизмов растений;
оптимизировать режимы клонального микроразмножения современного сортимента и гибридного материала садовой земляники с использованием препаратов, различных по происхождению и механизмам действия;
оценить значимость оздоровления земляники на разных этапах селекционного процесса;
обосновать и разработать современную отечественную технологию получения оздоровленного посадочного материала земляники, отвечающую требованиям мировых стандартов.
Научная новизна результатов исследований
Предложена концепция оздоровления земляники от вирусов и разработана технология производства оздоровленного посадочного материала земляники в соответствии с современными условиями и принципами экологической безопасности. Научно обоснована и экспериментально доказана целесообразность оздоровления от вирусов в селекционном процессе не только новых сортов земляники, но и исходных родительских, гибридных и элитных форм.
Установлен существующий видовой состав вирусов земляники в Нечерноземном Центре РФ, показаны его изменения за последние 20-25 лет. Выявлен характер взаимоотношений смешанных микозно-вирусных инфекций и их влияние на оценку устойчивости к болезням. Описано новое для региона фитоплазменное заболевание земляники, установлена его этиология и рекомендованы меры профилактики.
Предложена методология комплексной диагностики вирусных и фитоплазменных заболеваний земляники, повышающая достоверность их обнаружения. Выявлены и апробированы новые растения-индикаторы, предложен новый экономичный способ прививки с использованием в качестве привоев отдельных отрезков черешка листа, экспериментально обоснованы минимальный возраст тестируемых растений и сроки проведения вирусологического теста. Доказана целесообразность применения усовершенствованного молекулярно-генетического метода диагностики вирусов - полимеразной цепной реакции (ПЦР) для универсального тестирования земляники. Дана экономическая оценка разных методов диагностики вирусов.
Повышена экологическая безопасность оздоровления земляники от вирусов в питомниководстве при введении антивирусных препаратов и иммуномодуляторов в питательную среду in vitro. Впервые выявлен ряд эффективных химических и биологически активных препаратов для защиты
от комплекса вирусов, а также для повышения адаптационной способности микрорастений земляники при переводе их из пробирочной культуры в почвенный субстрат.
Основные положения, выносимые на защиту:
Методология комплексной диагностики вирусных и фитоплазменных заболеваний земляники, основанная на совершенствовании системы индикаторов и применении новейших методов тестирования (ДНК-зонды, ПЦР, электрофорез).
Современная система тестирования земляники и дифференцированный подход в зависимости от состава патогенов, их вредоносности и взаимоотношений в ценозе.
Система оздоровления и клонального микроразмножения земляники базируется на использовании новых направлений в оздоровлении от вирусов (сочетание культуры тканей с иммуномодуляторами и антивирусными препаратами) и оптимизации параметров культивирования in vitro и в период адаптации in vivo.
4. Обоснована значимость оздоровления земляники от вирусов на всех этапах
селекционного процесса.
Практическая значимость и реализация результатов исследований.
Разработана новая система оздоровления посадочного материала земляники на безвирусной основе для питомниководства и селекции.
Предложенная методология диагностики вирусов земляники позволяет повысить надежность выявления заболеваний и получения безвирусных базисных клонов. Выделенные новые индикаторные растения F. vesca f. semperjiorens, сортов Рюген и Роте Золемахер используются для тестирования растений земляники на зараженность вирусами в лаборатории
плодоводства РГАУ-МСХА. Предложенный способ прививки отдельными отрезками черешка листа в качестве привоев позволяет в 3-4 раза снизить количество отбираемых листьев и избежать ослабления тестируемых растений. Установленные оптимальные возраст микрорастений и период индикаторного теста повышают достоверность вирусологической проверки. Выявлена высокая эффективность использования ПЦР в качестве основного метода вирусологического тестирования в системе оздоровления посадочного материала земляники.
Культивирование верхушечных меристем в сочетании с химическими (ААТ, ДГТ) и биологически активными препаратами (иммуноцитофит) in vitro, а также обработка растений-доноров меристем ретардантами (пиксом, культаром, хлорхолинхлоридом), обеспечивают увеличение выхода здоровых клонов земляники. Показано улучшение адаптационных свойств микрорастений земляники при обработке их и почвенного субстрата биологически активными препаратами: никфаном, симбионтом, иммуноцитофитом, триходермином, планризом, и путем введения в субстрат цеолитов и гидрогелей.
Для ускорения и интенсификации селекционного процесса доказана необходимость оздоровления и клонального микроразмножения не только новых сортов, но и исходных родительских, гибридных и элитных форм земляники.
Усовершенствованные и разработанные новые элементы технологии производства безвирусного посадочного материала земляники используются в лаборатории плодоводства, в курсе лекций, практических занятий и в учебных пособиях РГАУ-МСХА.
Систематика и биологическая характеристика вирусов-патогенов земляники
Международным комитетом по таксономии вирусов (1CTV) с 1996 года предложена классификация вирусов по иерархической системе, включающей семейство (family), подсемейство (subfamily) с окончанием -virinae, род (genus) с окончанием - virus и далее общепринятое название вируса и его конкретного штамма. Параллельно существует Балтиморская классификация (BCV), в которой на основе строения нуклеиновой кислоты, вирусы разделены на семь классов. Фитовирусы в основном входят в III-V классы [R.I.B. Francki et al., 1991], содержащие одноцепочечные РНК с разной полярностью (+ или -), а также вирусы с двухцепочечной РНК. Ранее разделение вирусов на таксономические единицы проводилось на основе их морфологии и серологических исследований [Л.Н. Трофимец, 1988; R.I.B. Francki et al., 1991]. В настоящее время ни один из классических методов исследований вирусов не позволяет сделать вывода для определения его таксономического положения. Сравнительная характеристика вирусных РНК геномов, их фрагментов, вирусспецифических белков и отдельных антигенных детерминант делают возможным по-новому оценить генетическую вариабельность вирусов [СИ. Беликов, 2000]. Значительным этапом в изучении молекулярной структуры геномов РНК содержащих вирусов стало использование ферментов обратной транскриптазы - РНК зависимой ДНК-полимеразы. Этот фермент позволяет синтезировать кДНК на основе мРНК или любой другой РНК вируса [Т. Маниатис и др., 1984].
Для многих фитовирусов удалось получить различными методами сиквенирования полную нуклеотидную последовательность.
Сведения о видовом составе вирусов значительно различаются, что объясняется главным образом наличием нескольких штаммов у вирусов, смешанной инфекцией из серологически родственных видов вирусов, выявлением вирусов-полифагов, ранее отсутствующих, недостаточной чувствительностью и достоверностью используемых для идентификации вирусов и фитоплазм методов и рядом других причин.
К настоящему времени в мире на землянике установлено около 30 вирусов и фитоплазм [R.H. Converse, 1987, OECD Bio Track Database, 1996], ранее считалось из-за многочисленных штаммов, что их количество превышает 50 [J. Aerts, 1974; Вирусные болезни ягодных культур..., 1975]. На территории бывшего СССР регистрировали около 20 различных вирусов и фитоплазм, поражающих землянику [В.Г. Трушечкин, В.А. Высоцкий, А.П. Походенко, 1984]. На основе обобщения сведений из различных научных информационных источников нами составлена характеристика наиболее распространенных вирусов - патогенов земляники (табл. 1).
Современный молекулярный анализ генома ряда вирусов, поражающих землянику, позволяет уточнять их систематическое положение. Следует признать, что на данном этапе развития молекулярно-генетических методов и средств систематика вирусов, да и других микроорганизмов, будет постоянно изменяться, уточняться и дискутироваться. Например, вирус латентной кольцевой пятнистости земляники (ВЛКПЗ) Strawberry latent ringspot virus (SLRSV), ранее являющийся представителем семейства Comoviridae рода (группы) Nepovirus [Virus Taxonomy, 2000], после анализа первичной структуры некоторых генов этого вируса был отнесен к семейству Sequiviridae, роду SDV-like viruses [NCBI taxonomy database, 2003]. Однако, с 2004 года в соответствии с изменениями вирусной таксономии [М.А. Мауо, 2004], ВЛКПЗ выделен в новый род Sadwavirus в семействе Tombusviridae.
К этому же роду причислили и вирус крапчатости земляники Strawberry mottle virus, до 2004 года также относящийся к роду SDV-like viruses.
Вирус слабого пожелтения краев листьев земляники (ВСПКЗ), или желтухи, ксантоза Strawberry mild yellow edge virus (SMYEV) отнесен no одним источникам [N. Yoshikawa, S. Ohki, et al., 1984; OECD Bio Track Database, 1999; Virus Taxonomy, 2000] к роду Luteovirus, а по последним данным NCBI taxonomy database (2003) - к Potexvirus.
Вирус некроза табака, или некротического шока (ранее розеточности) земляники, Tobacco necrosis necrovirus (TNV), или Strawberry necrotic shock virus (SNRV), относился к группе (роду) иларвирусы Ilarvirus [S. Spiegel et al., 1993], а после уточнения первичного строения РНК был отнесен к некровирусам Necrovirus [NCBI taxonomy database, 2003].
Возбудителя паллидоза, или белесоватости, земляники - Strawberry pallidosis associated virus (SPaV), выявленного в 1957 году в США и Австралии [Вирусные болезни..., 1975] долгое время не могли достоверно отнести к какому-либо роду [N.Yoshikawa, R.H.Converse, 1990 а,б]. После секвенирования его генома и идентификации с применением молекулярно-генетического метода ПНР, он был выделен в группу Crinivirus, семейства Closteroviridae [I.E. Tzanetakis, 2004, 2005]. Причем, обнаружено очень тесное иммунологическое и генетическое родство между двумя вирусами, ассоциирующимися с поражением растений земляники паллидозом: собственно вирусом паллидоза и вирусом ложной желтухи свеклы Beet pseudo yellows virus, имеющим, как оказалось, несколько штаммов [I.E. Tzanetakis, 2004].
До последнего времени не установлен статус такого заболевания земляники, как июньская желтуха June yellows. Симптоматика ее зависит от генотипа растений; болезнь прогрессирует из года в год и в вегетативном потомстве, приводя в конечном счете растения к гибели [G.M. Darrow 1954, 1955]. Это заболевание очень опасно при проведении селекционной работы, так как его появление и динамику практически невозможно предсказать.
Изучение этиологии нового заболевания земляники
По результатам наших исследований [О.О. Белошапкина, 1986] восстановление зараженности латентной вирусной инфекции в оздоровленных от вирусов растениях земляники может начинаться уже в первый год после высадки в полевые условия. Так растения сорта Зенга Зенгана к концу первого года вегетации в поле были заражены на 6,0%, а сорта Фестивальная - на 13,7% латентным комплексом вирусов. Нарастание инфекции происходило с различной интенсивностью в зависимости от относительной устойчивости сорта. Возможными причинами быстрого появления вирусов в растениях, считавшихся по результатам тестирования здоровыми, можно считать, во-первых, насекомых-переносчиков, а во-вторых, это могло произойти за счет выявления скрытой вирусной инфекции, неулавливаемой ранее биотестами из-за низкого содержания вирусов.
Заключение. В результате проведенных исследований уточнен существующий состав вирусных заболеваний земляники и их возбудителей в Нечерноземном Центре России в Нечерноземном Центре России. Вирусные болезни садовой земляники распространены достаточно широко, встречаются повсеместно, где выращивают землянику, в том числе в питомниках. Большинство вирусов находится в латентной форме, симптомы, появляющиеся на некоторых сортах, нечеткие и быстро исчезают. Период II - III декады мая и I - II декады сентября можно считать наиболее подходящими для обследования посадок земляники в открытом фунте в Нечерноземной зоне на зараженность вирусами. Отмечены различия между сортами в пораженности вирусными патогенами. На старых (более 2-х лет) и неблагополучных по фитосанитарному состоянию посадках распространенность вирусоподобных симптомов была значительно выше, чем на молодых и ухоженных.
В среднем по сортам распространенность вирусных заболеваний в латентной форме составляла 14-60%. Наибольшее распространение из сокопереносимых вирусов имел ВЧКПТ; из всего количества протестированных ИФА растений земляники 22% оказались инфицированы этим вирусом, им были поражены 32%) обследуемых сортов. Распространенность ВЛКПЗ составила 13%), при этом были поражены 16% сортов. BMP были инфицированы 4% растений (10%) сортов). Часто растения некоторых сортов были одновременно инфицированы двумя и даже тремя вирусами.
На индикаторных клонах были выявлены вирусы крапчатости, морщинистости и слабого пожелтения краев листьев земляники. Методом полимеразной цепной реакции был выявлен вирус, относящийся к группе карлавирусов, вероятно вирус ложного слабого пожелтения краев листьев, а в образцах земляники сортов Богота и Эстафета, был выявлен вирус, относящийся к группе потексвирусов, вероятно слабого пожелтения краев листьев.
В настоящее время видовой состав вирусов, поражающих землянику в Нечерноземной зоне России, и характер поражения несколько изменились с 60-70-х годов XX века. Увеличилась частота встречаемости вирусов с широкой филогенетической специализацией, таких как вирус мозаики резухи, черной кольцевой пятнистости томата, латентной кольцевой пятнистости земляники. Еще большую распространенность получила латентная форма вирусных заболеваний и смешанные инфекции, вызванные комплексом разных вирусов.
Частую встречаемость вируса крапчатости в России можно объяснить его способностью передаваться по неперсистентному типу различными видами тлей, наряду с передачей с посадочным материалом. Так как основной вектор персистентных вирусов земляники: морщинистости и слабого пожелтения краев листьев, - белая (американская) земляничная тля практически отсутствует в Нечерноземном Центре России, их распространенность можно связать исключительно с использованием недостаточно оздоровленного посадочного материала.
Отсутствие эффективных мер защиты от нематод, пустующие, заросшие сорняками, бывшие сельскохозяйственные угодья в первую очередь способствуют естественному распространению нематодопереносимых вирусов. Возможно, в недалеком будущем, при отсутствии правильных севооборотов, будет выявлен и вирус некроза табака, или некротического шока земляники, сохраняющийся в почве и передающийся почвообитающими грибами отдела Хитридиомицеты. Количество тлей-переносчиков вирусных болезней в насаждениях земляники незначительно, нематоды имеют очаговый характер распространения; хотя они и имеют значение в естественном увеличении вирозов земляники, основная роль в распространении вирусных болезней принадлежит зараженному посадочному материалу.
Оценивая потенциал вредоносности вирусов, как хронических патогенов земляники садовой - культуры многолетней и вегетативно размножаемой, учитывая их вредоносность, является вполне оправданным регулярный мониторинг видового состава вирусов в сортах земляники различными методами диагностики и контроль за динамикой их распространения. Для предотвращения широкого распространения вирусов в посадках земляники различного назначения в России необходимо законодательно запретить использовать неоздоровленный посадочный материал, в том числе с товарных плантаций. Фитосанитарный контроль за состоянием маточников, проводить с обязательной вирусологической проверкой растений земляники, полученных клональным микроразмножением.
Влияние температуры на результаты тестирования в условиях теплиц
Надежность методов диагностики вирусов зависит не только от их технической чувствительности и достоверности, от видового состава вирусов, но и от условий окружающей среды.
Многие вирусы способны активно функционировать и распространяться при широком диапазоне температур, в большинстве случаев совпадающем с температурным оптимумом развития растений. Их инактивация начинается лишь при 34 - 40С. По сообщениям И.Г. Цуркана (1971), это происходит в результате повышения активности ряда ферментов (полифенолоксидазы, рибонуклеазы и др.), которые ингибируют репликацию вирусов, в частности синтез их нуклеиновой кислоты. По ряду данных [А.
Гиббс, Б. Харрисон, 1978], повышенная температура действует непосредственно на РНК и белковую оболочку вирусных частиц, вызывая их физическое разрушение. На этом основана термотерапия вирусных заболеваний растений земляники. Наиболее эффективной является суховоздушная термотерапия - воздействие повышенных температур (36-38 С) в течение 3-5 недель [Борьба с вирусными .., 1986].
Термостойкость целого ряда вирусов земляники чрезвычайно высока, однако элиминацию, например, широко распространенного вируса крапчатости листьев земляники отмечают уже при температуре 33С [Борьба с вирусными ..., 1986]. По данным N.W. Frazier, V. Voth и R.S. Bringhurst, (1965) эффективной против вируса крапчатости также оказалась термотерапия естественными высокими температурами в летний период, при этом у 80 % растений индикаторных клонов земляники лесной UC-1 пропали симптомы поражения данным вирусом. В.А. Шмыгля (1989) также отмечал влияние высокой температуры воздуха в теплице на концентрацию вирусов картофеля и их серологическую активность. Происходило резкое снижение процента положительных результатов серодиагностики вирусов (в первую очередь М вируса картофеля), если в течение нескольких дней температура в теплице поднималась до 35 С и выше.
Основная трудность в диагностике вирусов земляники индикаторным методом заключается не в его проведении, а в умении отличать действительно вирусные симптомы от сходных с ними, но вызванных другими причинами, например, повышенными температурами, недостатком элементов питания, неподходящей кислотностью почвенного субстрата.
По итогам нашей работы температура воздуха в теплице летом оказывала влияние на развитие вирусов в растениях земляники ряда сортов, искажая результаты вирусологического тестирования индикаторным методом.
В летние месяцы, начиная с середины мая, температура в остекленной обогреваемой теплице на Плодовой опытной станции Тимирязевской академии в дневные часы поднимается обычно до 38 - 40С, что на 5 - 10С выше, чем вне теплицы. В 1988 году по данным Метеорологической обсерватории им В. А. Михельсона, средняя температура воздуха в III декаде мая была 17,7, в июне - 19,5, в июле-21,6С, что выше средней многолетней соответственно на 3,7 , 3,1 и 3,1С. В результате в 1988 г. температурный режим в теплице был близок к режиму, применяемому при суховоздушной термотерапии.
В эксперимент для контроля были включены сортообразцы, являющиеся вегетативным потомством от зараженных комплексом вирусов растений, отобранных ранее в тестах на индикаторных клонах земляники. По результатам тестирований (I и II) у части этих растений вирусов не обнаружили (были получены ложно-отрицательные результаты), и их можно было отнести к здоровым.
Причем после действия высокий температур, наблюдавшихся в I срок тестирования, количество растений, у которых вирусная инфекция не определилась индикаторным методом, было больше почти на 20%. Произошло искажение результатов тестирования под влиянием температуры окружающей среды.
На индикаторных клонах земляники наблюдали следующие симптомы заболеваний: на листьях (особенно четко на клоне UC-4) появились мелкие 1-1,5 мм хлоротичные пятна, доли отдельных листьев были неравномерно развиты, а черешки листьев изогнуты (рис. 5), что является диагностическими признаками заболевания, вызываемого вирусом крапчатости (strawberry mottle) [N.W. Frazier, F.C. Mellor, 1970]. Растения клонов ЕМК и UC-1 были в 2 - 3 раза меньше по сравнению с нормальными экземплярами и черешки листьев были значительно короче. Кроме этих симптомов на индикаторах, особенно на ЕМК, проявлялась выраженная морщинистость на центральной жилке в верхней части долей, обычно на одном листе.
Хлоротичные пятна, морщинистость долей, карликовость появляются на индикаторных клонах земляники лесной не только при крапчатости, но и при морщинистости, окаймлении жилок, пожелтении краев листьев. Однако вирусы морщинистости считаются термостабильными, вирусы, вызывающие другие перечисленные заболевания, реже встречаются и также плохо элиминируются при термотерапии [R.H. Mullin et al., 1974]. Поскольку при первом тестировании после «термотерапии» перечисленные выше симптомы заболеваний не проявились у большинства индикаторных растений, можно предположить, что исследуемые экземпляры земляники являлись носителями термолабильных вирусов в латентной форме, вероятно, вирусов крапчатости, широко распространенных в нашей зоне, наряду с вирусами морщинистости.
Растения сорта Фестивальная (3,4,5), по-видимому, были заражены термостабильными вирусами, так как практически при всех учетах в обоих тестах отмечены устойчивые симптомы вирусного заболевания. Некоторые анализируемые растения сорта Зенит (2,3) были заражены термолабильными вирусами, которые не выявились в тесте, когда температура в теплице в течение нескольких недель была сравнимой с термотерапией. Большинство же сортообразцов были одновременно носителями и термостабильных и термолабильных вирусов. В группе растений, для которых результаты учетов были нестабильными и требовали уточнения, трудно было определить наличие или отсутствие вирусной инфекции, поскольку на привитых ими индикаторных клонах симптомы проявлялись лишь в 2 - 3 учетах.
Заключение. Экспериментально доказано, что факторы внешней среды, например, естественная высокая температура воздуха, может искажать достоверность диагностики вирусов индикаторным методом.
Растения земляники часто бывают поражены одновременно несколькими вирусами, в том числе термостабильными и термолабильными. Под влиянием естественных высоких летних температур в теплице в растениях земляники происходит снижение концентрации и торможение синтеза термолабильных вирусов до величин, не выявляемых с помощью биотестов, что может приводить к искажению результатов их индикаторной диагностики.
Сортовая реакция земляники на культивирование верхушечных меристем in vitro
Важным показателем методов диагностики вирусов является их экономическая эффективность, во многом определяющая использование в производстве.
Сравнение стоимости диагностики фитовирусов методами ПЦР и ИФА было проведено в 2005 году на основе базовых условий вирусологической диагностической лаборатории на примере ВНИИСБ. Методика диагностики фитовирусов методом ПЦР, включает четыре этапа: - выделение тотальной (общей) РНК из растительного образца; - получение тотальной кДНК (реакцией обратной транскрипции ОТ-ПЦР); - проведение собственно полимеразной цепной реакции; -визуализация результатов ПЦР-анализа методом электрофоретического разделения в агарозном геле.
Стоимость вирусологического анализа данным методом будет складываться из следующих компонентов: оплаты труда сотрудников, стоимости реактивов, необходимых для осуществления всех этапов работы, амортизации приборов, основными из которых являются ПЦР-амплификатор, центрифуга, транслюминатор, камера для электрофореза и источник тока.
Определение стоимости реактивов для каждого этапа ПЦР анализа, исходя из их потребности в расчете на тестирование 1000 образцов, в соответствии с ценами фирм-производителей, приведено в таблицах 5-8 Приложения Ж.
В результате суммирующих подсчетов оказалось, что стоимость реактивов, необходимых для последовательного проведения этапов ПЦР анализа фитовирусов составила: для выделения тотальной РНК - 11997,44 руб; для реакции ОТ-ПЦР - 26490,80 руб; для ПЦР-анализа 10568,0 руб; для проведения электрофореза - 10332,0 руб. По сумме итоговых данных по всем основным этапам вирусологического анализа 1000 образцов методом ПЦР затраты на реактивы составили 59388,24 руб. Соответственно в пересчете на рубли стоимость реактивов для тестирования методом ПЦР одного растительного образца на 1 группу вирусов (или 1 вид вирусов) составляет 59,38 руб.
Норма амортизации на основное оборудование: ПЦР-амплификатор Терцик, центрифугу Eppendorf MiniSpin, транслюминатор BioCom UVT1, камеру для электрофореза Helicon SF1 и источник тока Эльф-4, составляет 15% их балансовой стоимости. Амортизационные отчисления (А) рассчитываются по формуле: А= (Бс х На)/100, где Бс - балансовая стоимость, руб, На - норма амортизации, % A=(68250+33250+17500+5250+14700)x 15 : 100 = 20842,5 руб/год Соответствующие амортизационные отчисления за месяц будут 1736,87 руб/мес. Существующая техническая оснащенность лаборатории позволяет диагностировать примерно 400 образцов в месяц. Таким образом, в расчете на 1 образец амортизационные отчисления составят 4,34 руб/образец.
Если учесть, что оплата труда в ПЦР-лаборатории составляет в среднем 15000 руб/месяц, то затраты на оплату труда в расчете на 1 образец составляют 37,5 руб/образец.
Стоимость иммуноферментного анализа также будет складываться из стоимости реактивов, необходимых для его осуществления, амортизации приборов, основными из которых являются центрифуга, фотометр и термостат, а также оплаты труда.
Стоимость реактивов определялась, исходя из их потребности на проведение 1000 анализов, и составила 9989,56 руб (табл. 9 Приложения Ж).
Соответственно, стоимость реактивов для анализа 1 образца методом ИФА составила 9,98 руб/образец.
Норма амортизации на основное оборудование: центрифугу Eppendorf MiniSpin, планшетный фотометр ЭФОС 9305 («Сапфир») и термостат ST3 («Elmi») составляет 15% их балансовой стоимости. Амортизационные отчисления были рассчитаны по той же формуле, что и для ПЦР анализа: А=(33250+97125+20650) х 15 : 100 = 22653,75 руб/год.
Это составляет соответственно 1887,81 руб/мес. Существующая техническая оснащенность диагностической вирусологической лаборатории ВНИИСБ позволяет проверять на зараженность вирусами порядка 5000 образцов в месяц. Таким образом, в расчете на 1 образец амортизационные отчисления составят 0,37 руб/образец.
