Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 12
Выбор метода обращенно-фазовой ВЭЖХ для анализа многокомпонентных анальгетиков. 12
Теоретические основы метода обращенно-фазовой ВЭЖХ. 13
Определение параметров и сравнительных характеристик НФ. 30
Оптимизация условий хроматографического разделения как практическое приложение закономерностей сорбции. 33
Методы хроматографического разделения компонентов ненаркотических анальгетиков . 38
Экспериментальная часть 41
Приборы и материалы. 41
Препараты и реактивы. Приготовление растворов. 42
Условия проведения хроматографирования . 43
Расчеты и обработка результатов. 44
Определение метрологических характеристик методики. 45
Обсуждение результатов 46
Определение характеристик хроматографических систем и хроматографических колонок. 46
Определение свободного объема, и дисперсии зоны вещества в хроматографической системе. 46
Определение характеристик хроматографических колонок. 47
Определение термодинамических характеристик колонок на малосорбирующихся веществах. 54
3.2. Закономерности удерживания І - V. 58
3.2.1. Зависимость удерживания и дисперсии I - V от скорости ПФ. 58
3.2.2. Влияние ионной силы ПФ на удерживание I - V. 59
3.2.3. Зависимость удерживания и дисперсии I - V от рН и содержания органического модификатора в ПФ. 60
3.2.4. Сравнительная оценка различных сорбентов по удерживанию и селективности разделения I - V. 66
3.2.5. Термодинамические характеристики удерживания I - V. 72
3.3. Зависимость дисперсии зоны сорбата от параметров ПФ и физических условий хроматографического эксперимента. 75
3.4. Выбор оптимальных условий разделения I - V. 82
3.4.1. Поверхности удерживания и оптимальных разрешений. 82
3.4.2. Выбор унифицированных условий для различных сорбентов. 86
3.5. Описание и параметры эффективности оптимизированной методики. 89 3.6 Метрологические характеристики оптимизированной методики. 93
3.7. Методология выбора и оптимизации условий хроматографического разделения смесей сорбатов в условиях обращено-фазовой ВЭЖХ. 94
Выводы. 97
Список использованных источников.
- Теоретические основы метода обращенно-фазовой ВЭЖХ.
- Методы хроматографического разделения компонентов ненаркотических анальгетиков
- Условия проведения хроматографирования
- Определение свободного объема, и дисперсии зоны вещества в хроматографической системе.
Введение к работе
Лекарственные средства представляют особый объект с точки зрения процессов контроля качества при производстве и распространении. Многокомпонентные ненаркотические анальгетики в виде готовых форм лекарственных средств, изготовленных с применением различных вспомогательных веществ (МНА) широко используются в клинической практике. В частности, существует ряд анальгетиков, содержащих парацетамол (N-ацетил-п-аминофенол), кофеин и ацетилсалициловую кислоту в различных соотношениях, например «Цитрамон», «Цитрамон П», «Аскофен П», «Кофицил», «Кофицил-плюс», число таких препаратов и объем их производства в России постоянно увеличиваются, [1,2,3,4]. Важной задачей в этой связи становится разработка точных и экспрессных методов оценки качества данных лекарственных препаратов, одновременно надежных и воспроизводимых в различных условиях.
Среди широкого спектра аналитических методов, применяемых для анализа многокомпонентных лекарственных препаратов на различных этапах фармобращения, в том числе и в производственном контроле, по совокупности преимущества хроматографические методы, ив большей степени метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ), занимают устойчивое первое место. Этим в первую очередь обусловлено массовое применение методов ВЭЖХ в данной области, что в свою очередь приводит к широкому набору вариантов методик анализа, условия которых существенно различаются и в большинстве случаев далеки от оптимальных. Метрологические характеристики методики напрямую зависят от выбора условий разделения. Оптимальные условия с широким диапазоном надежности можно установить только путем детального изучения закономерностей удерживания разделяемых компонентов.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Практическая эффективность методов ОФ ВЭЖХ зависит от оптимального выбора условий хроматографического эксперимента. Широкий спектр методик, применяемых для анализа МНА методом ОФ ВЭЖХ, свидетельствует об отсутствии систематического подхода к изучению физико-химических закономерностей поведения компонентов МНА.
Создание точных, эффективных, удобных, экспрессных и надежных методик анализа многокомпонентных лекарственных препаратов, которые могут применяться и в производстве, и в последующем контроле, является важной практической задачей.
В связи с этим актуальным и закономерным становится необходимость детального изучения физико-химических характеристик удерживания данных веществ при совместном определении в условиях ОФ ВЭЖХ, что позволяет с достаточно высокой точностью построить модели удерживания и оптимизировать практические ОФ ВЭЖХ аналитические методики по параметрам хроматографического эксперимента.
Цель работы: выявление областей глобального оптимума условий хроматографического разделения компонентов действующих веществ и основных примесей многокомпонентных ненаркотических анальгетиков: п-аминофенол (I), N-ацетил-п-аминофенол (II), кофеин (III), ацетилсалициловая кислота (IV), салициловая кислота (V) при их совместном определении в условиях ОФ ВЭЖХ на основе экспериментально установленных закономерностей удерживания, посредством многопараметрических оптимизационных процедур.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Определить параметры хроматографических систем и сорбентов, их зависимость от параметров подвижной фазы (ПФ) и влияние на основные характеристики удерживания компонентов МНА.
2. Выявить закономерности удерживания компонентов МНА от условий хроматографического эксперимента: композиционного состава ПФ, физических параметров, характеристик неподвижной фазы (НФ).
3. Установить закономерности дисперсии зон вещества в ходе хроматографического разделения в зависимости от условий хроматографического эксперимента и характеристик удерживания сорбата.
4. Определить параметры хроматографического эксперимента, имеющие наибольшее влияние на удерживание компонентов МНА при совместном их определении. Построить поверхности удерживания и разделения компонентов МНА, и оптимизировать параметры хроматографического эксперимента с целью достижения максимальной эффективности разделения вышеуказанных компонентов.
5. Разработать универсальную методику одновременного определения I - V в МНА с оптимизированными условиями, устойчивыми к относительно небольшим изменениям параметров хроматографического эксперимента и свойств сорбента.
Научная новизна работы. Проведено систематическое исследование параметров хроматографических систем и колонок по удерживанию нитрата калия, нитрометана, ацетонитрила и воды в широком диапазоне содержания органического модификатора - ацетонитрила в ПФ. Показано существование заметного удерживания данных веществ, считающихся условно несорбирующимися, определены закономерности удерживания и дисперсии этих веществ в зависимости от состава ПФ, характеристик НФ и физических условий хроматографического эксперимента.
Предложен способ определения параметров хроматографической системы и колонки по удерживанию нитрата калия и одного из наиболее широко применяемых модификаторов ПФ - ацетонитрила, при изменении состава ПФ. Показана возможность оценки фазового отношения колонки и получения сравнительных характеристик сорбентов различных марок по экспериментально определяемой зависимости удерживания органического модификатора ПФ - ацетонитрила от состава ПФ.
Проведено исследование физико-химических характеристик удерживания компонентов МНА на сорбентах Нуклеосил 100 С-18, Nova Pack С18, Symmetry С18 в широком диапазоне рН и содержания ацетонитрила в ПФ. Предложен метод линеаризации нелинейной зависимости характеристик удерживания компонентов МНА от рН ПФ, позволяющий рассчитывать индивидуальные параметры удерживания нейтральной и ионной форм и константы ионизации.
Получен ряд линейных и биноминальных зависимостей характеристик удерживания и дисперсии компонентов МНА в условиях ОФ ВЭЖХ от параметров ПФ, позволяющих прогнозировать их хроматографическое поведение, построить поверхности удерживания и оптимизации с точностью, достаточной для разработки универсальной методики, воспроизводимой на различных марках однотипных сорбентов.
Практическая значимость работы. Предложен способ определения параметров хроматографической системы, колонок, сравнительных характеристик сорбентов, позволяющий получить исходные данные для прогнозирования поведения сорбатов в условиях ОФ ВЭЖХ и более точного расчета характеристик удерживания. Определены закономерности хроматографического поведения компонентов МНА в условиях ОФ ВЭЖХ на основе сольвофобной модели в многопараметрическом пространстве условий хроматографического эксперимента. Данные закономерности позволяют рассчитывать поверхности удерживания сорбатов, поверхности оптимизации разделения при их совместном определении.
Сформулирован алгоритм выбора условий хроматографического разделения сорбатов различных классов при совместном определении в условиях ОФ ВЭЖХ как на одном сорбенте, так и на ряде однотипных сорбентов.
Разработана и охарактеризована путем метрологических испытаний универсальная методика совместного определения компонентов МНА в лекарственных препаратах, пригодная для использования различных марок сорбентов на основе силикагеля, модифицированного октадецилсиланом.
Работа является самостоятельным фрагментом комплексной научно-исследовательской тематики кафедры физической химии и химической технологии Курского государственного технического университета
Внедрение результатов работы.
На основании проведенных исследований разработана и внедрена в практику процедура сравнительной метрологической характеристики аналитических методик, применяющихся в фармацевтической промышленности, в соответствии с требованиями правил организации производства и контроля качества лекарственных средств ГОСТ Р" 52249-2004. При помощи предложенной процедуры оптимизации разработана методика анализа препарата «Парацетамол детский суспензия для приема внутрь 2,4%», включенная в Государственный стандарт качества лекарственного средства ФСП 42-0550-427604.
Апробация работы. Результаты работ были представлены и одобрены на I Российской школе-конференции «Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине» (Саратов 2002), IV Международной научно-технической конференции «Медико-экологические информационные технологии - 2003» (Курск 2003), 6-й Международной конференции «Оптико-электронные приборы и устройства в системах распознавания образов, обработки изображений и символьной информации. Распознавание - 2003» (Курск 2003). Разработанные на основании проведенных исследований универсальная методика анализа лекарственных средств, содержащих N-ацетил-п-аминофенол, кофеин и ацетилсалициловую кислоту с одновременным определением примесей п-аминофенола и салициловой кислоты, методика количественного определения N-ацетил-п-аминофенола, метил-п-оксибензоата и примеси п-аминофенола в препарате «Парацетамол детский суспензия для приема внутрь 2,4%» прошли полные метрологические испытания в рамках валидационных процедур.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе государственный стандарт качества лекарственного средства.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части с приложением, главы обсуждения результатов, выводов, списка использованных источников, включающего 148 источников, в том числе 86 зарубежных авторов, приложения. Работа изложена на 142 листах машинописного текста, иллюстрирована 64 рисунками и 46 таблицами.
На защиту выносятся следующие положения:
- способ полуэмпирической оценки характеристик неподвижной фазы и определения параметров хроматографической колонки по удерживанию условно несорбирующихся веществ;
способ линеаризации нелинейной зависимости удерживания ионогенных сорбатов от рН подвижной фазы, расчета характеристик удерживания форм сорбата и констант ионизации;
корреляция между параметрами удерживания и дисперсии компонентов МНА и их ионизированных форм с параметрами: хроматографического эксперимента (состав ПФ, свойства НФ, физические условия);
модели удерживания неорганических солей, органических модификаторов ПФ и компонентов МНА в условиях ОФ ВЭЖХ;
схема алгоритма оптимизации условий хроматографического разделения смеси сорбатов;
- универсальная методика совместного определения компонентов МНА в лекарственных средствах.
Теоретические основы метода обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Актуальность вопросов контроля качества лекарственных средств усиливается с ростом числа зарегистрированных в России препаратов: за последние пять лет - с 3,5 тысяч до 13,5 тысяч при существенном увеличении количества их производителей. Методы контроля качества лекарственных средств в этих условиях должны обеспечивать максимальное соответствие своему предназначению по основным критериям, таким как информативность, специфичность, чувствительность, воспроизводимость, правильность, экспрессность, экономичность [5].
Контроль качества многокомпонентных лекарственных средств может производиться при помощи различных химических и физико-химических методов анализа, например, спектрофотометрическими методами, в том числе одновременное количественное определение на основе модифицированного метода Фирордта [6,7,8], В то же время, при высокой точности спектрофотометрические методы обладают очень низкой специфичностью при использовании в качестве объектов многокомпонентных смесей с близкими спектральными характеристиками. Применение методов разделения и последовательное определение компонентов химическими и физико-химическими методами [9,10,11] сопряжено с потерей экспрессности и ухудшает метрологические характеристики метода в целом.
Как отмечает большинство авторов, возможности ВЭЖХ для анализа сложных многокомпонентных объектов по сравнению с другими методами по совокупности характеристик (экспрессность, объективность, универсальность, точность и воспроизводимость а также простота разработки методик) остаются непревзойденными [6,12,13]. Этим в первую очередь объективно обусловлено широкое применение современных методов аналитической ВЭЖХ для контроля производства лекарственных препаратов и их качества на различных этапах фармобращения [12,14,15,16,17].
Наиболее распространенные классические варианты ВЭЖХ, классификация которых наиболее обоснована с точки зрения физической химии, следующие: - нормально-фазовая хроматография - когда подвижная фаза менее полярна, чем неподвижная, и доминирующим фактором удерживания является взаимодействие сорбата с неподвижной фазой; - обращенно-фазовая хроматография - когда ПФ более полярна, чем НФ и удерживание определяется в основном сольвофобными взаимодействиями сорбата с ПФ [18,19].
Методическая простота, универсальность, высокая предсказуемость поведения сорбатов делают вариант ОФ ВЭЖХ наиболее привлекательным. По разным оценкам в настоящее время этим методом пользуются в 70-90% случаев для качественного и количественного ВЭЖХ анализа [12, 20]. Теоретические основы метода обращенно-фазовой ВЭЖХ. Современная хроматография представляет собой с одной стороны метод сорбционного разделения смесей в динамических условиях, а с другой — комплексную научную дисциплину, изучающую закономерности сорбции и массопередачи в динамических условиях, включающая в себя методологические и прикладные исследования, направленные на создание общих подходов и конкретных режимов разделения, создание материальных основ хроматографии [12,13,21].
Современное состояние практической хроматографии и ее теоретических основ отражено в различных обзорах [22-28]. В то же время, сложность описываемых процессов не позволяет создавать достаточно точного физико-химического описания, в основном опираясь на феноменологическое моделирование [12, 29]. Взаимосвязь удерживания сорбата с условиями эксперимента в настоящее время достаточно хорошо описана, в то время как описание зависимости удерживания от структуры сорбата в основном базируется на полуэмпирическом моделировании [12].
Наиболее часто применяемая модель для описания такого динамического процесса - представление его в виде многократного повторения актов сорбции и десорбции [30]. Для изучения закономерностей данного процесса необходимо знать, в частности, фазовое отношение хроматографической системы ((3) или отношение объемов неподвижной (Vs) и подвижной (Vm) фаз, последний определяют экспериментальным путем, измеряя время удерживания условно несорбирующихся веществ (tm) [13, 31].
При построении моделей сорбционных взаимодействий в хроматографии рассматривают несколько различных по природе межмолекулярных взаимодействий: ориентационные, основанные на постоянном дипольном моменте (1.1), индукционные - наведенный дипольный момент (1.2), дисперсионные - основанные на непостоянстве электрической плотности (1.3), водородные связи, координационные, кулоновские [32, 33].
Методы хроматографического разделения компонентов ненаркотических анальгетиков
Методы ВЭЖХ анализа ненаркотических анальгетиков как в лекарственных препаратах, в том числе комбинированных, так и в различных биологических объектах, последние 30 лет являются одним из объектов исследований [125, 126]. В частности, для разделения N-ацетил-п-аминофенола (II), кофеина (III), ацетилсалициловой кислоты (IV) и салициловой кислоты (V) методом ОФ ВЭЖХ приводится широкий набор условий с использованием различных сорбентов, модифицированных октилсиланом, октадецилсиланом. Применяются различные органические модификаторы - ацетонитрил, метанол, изопропиловый спирт, тетрагидрофуран. Для поддержания ионной силы и в качестве буферных компонентов используются неорганические соли, соли слабых органических кислот и оснований. В широком диапазоне варьируется рН подвижной фазы.
В таблице 1.7 приведены наиболее типичные варианты условий разделения II - V на силикагелях, модифицированные октадецилсиланом, с ПФ на основе МеОН или MeCN.
Чаще всего разделение проводится при рН от 2,5 до 5, который поддерживается фосфатными или ацетатными буферными растворами. Содержание органического модификатора в ПФ - от 8 до 50%, что позволяет судить о довольно широком диапазоне показателей экспрессности и эффективности этих методик [12, 13, 127]. В совокупности с широким набором используемых марок сорбентов (см. табл. 1.7), это создает определенные ограничения по выбору варианта методики, наиболее пригодного для анализа фармацевтических препаратов, в том числе и в условиях производства.
Наиболее важным требованием к такой методике является ее устойчивость к изменениям условий (в определенном диапазоне), в том числе к изменению сорбента - основные показатели, определяющие способность методики воспроизводиться в различных лабораториях различными аналитиками на различных приборах. Выбор таких условий невозможно произвести методом случайного поиска, так как в данном случае необходим глобальный оптимум параметров ПФ [13]. В связи с этим перед нами стояли задачи детального изучения закономерностей сорбции исследуемых веществ в условиях ОФ ВЭЖХ на наиболее типичных марках сорбентов с различными характеристиками, зависимостей параметров сорбции от условий хроматографического эксперимента, в первую очередь состава ПФ, построения поверхностей удерживания на основе выбранных моделей и проведения оптимизационных процедур.
В работе использовали следующие хроматографические системы: Система 1: хроматограф Alliance 2690 фирмы «Waters» (4-х компонентный градиентный насос подачи ПФ с встроенным вакуумным дегазатором, термостат колонок, автоинжектор с варьируемым объемом пробы 0-100 мкл с шагом 0,1 мкл, абсолютная погрешность объема пробы 0,04 мкл, компьютерная программа регистрации и обработки данных Millennium 2000) с двухлучевым спектрофотометрическим детектором УФ и видимой области Waters 2487 (спектральный диапазон 190 - 900 нм, разрешение 1,0 нм, объем кюветы 4 мкл) [141].
Система 2: хроматограф Alliance 2690 фирмы «Waters» (модификация аналогично системе 1) с диодно-матричным УФ детектором Waters 996 (спектральный диапазон 190 + 900 нм, разрешение 1,2 нм, частота сканирования 25 мсек, объем кюветы 4 мкл).
Разделение проводили на хроматографических колонках из нержавеющей стали, заполненных сорбентами различных марок (силикагель, модифицированный октадецилсиланом).
Параметры хроматографических систем приведены в таблице 2.1, параметры хроматографических колонок - в табл. 2.2. Среднее значение дисперсии зоны вещества в свободном объеме колонки находили, используя принцип суммирования дисперсий [12]: (а2 = а!2 + о22+...) (2.1) Термодинамические характеристики колонок определяли, используя экспериментальную зависимость Ink MeCN от Смеслм биноминального типа из уравнения (1.23).
Препараты и реактивы. Приготовление растворов. Для приготовления подвижной фазы использовались: ацетонитрил «для хроматографии» фирмы «Merck», калия фосфат однозамещенный «чда» («ЭКРОС» ТУ 6-09-5324-87), кислота ортофосфорная «чда» (ГОСТ 6552-80).
Подвижную фазу (ПФ) - смесь ацетонитрила и 0,025М буферного раствора калия фосфата однозамещенного с добавлением ортофосфорной кислоты до заданного значения рН (потенциометрически), фильтровали через фильтр Владипор МФА-А №1 ТУ 6-05-1924-82, средний размер пор 0,45 мкм, дегазировали вакууммированием.
В качестве стандартов использовали нитрометан («для хроматографии». Мерк), калия бромид («ч.д.а»), калий азотнокислый («ч.д.а.»). Для приготовления испытуемых растворов использовали парааминофенол (I) и фармакопейные субстанции: парацетамол (II) (ФС 42 3292-96), кофеин (III) (ФС 42-2426-86), ацетилсалициловая кислота (IV) (ФС 42-2688-94), салициловая кислота (V) (ГФ X, ст. 21), а также готовые препараты «Аскофен П», «Цитрамон П» и «Кофицил плюс» производства ОАО «Фармстандарт - Лексредства». Параметры сорбатов приведены в таблице 2.3. Испытуемые растворы готовили, растворяя точную навеску порошка растертых таблеток (или соответствующие навески субстанций I, II, III, IV и V) в подвижной фазе с последующей фильтрацией через фильтр Владипор и дегазацией вакууммированием.
Условия проведения хроматографирования
Полученные результаты позволили более объективно оценить, характеристики исследуемых сорбатов, поскольку наблюдаемые параметры удерживания и размывания сорбата в хроматографической системе складываются из внеколоночных и колоночных составляющих [33, 39], для более точного определения хроматографических характеристик веществ важно знать не только параметры колонок, но и параметры хроматографической системы [142].
Определение характеристик хроматографических колонок.
Установлено, что поведение разных условно несорбирующихся веществ, рекомендуемых различными исследователями [12, 85, 118, 120], на одном сорбенте при одинаковых условиях хроматографирования заметно различается. Наименьшее удерживание наблюдается для солей (КЫОз, ІСВг) в 10% водном MeCN. Ацетонитрил и нитрометан имеют близкие времена удерживания, приблизительно в 2 раза большие, чем время удерживания нитрата калия. Такой же эффект наблюдается при инжекции чистой воды (с отрицательным пиком, см. рис. 3.2). Удерживание KNO3 при введении в состав ПФ соли увеличивается (см. табл. 3.1).
Наложенные хроматограммы тестов по определению свободного объема колонки NS, и =1 мл/мин, Vmj=5 мкл, ПФ: 10% MeCN в воде (w) или в 25mM КН2Р04 (Ь). Это свидетельствует о наличии довольно существенного удерживания компонентов, считающихся «условно несорбируемыми». При этом механизмы удерживания различны для органических растворителей и для солей. Нитрометан и ацетонитрил удерживаются вследствие различной полярности ПФ и НФ, и их сорбция описывается линейной изотермой (нормальная асимметрия пиков, см. рис. 3.2).
Механизм удерживания нитрата калия на колонке NS более сложный, о чем свидетельствует обращенная асимметрия пиков (отрицательная изотерма сорбции) и ярко выраженная зависимость формы пика и объема удерживания от скорости потока ПФ (см. рис. 3.3, 3.4). , 50% MeCN, 5 мкл, и=1,5; 1,2; 1,1; 1,0; 0,8; 0,6; 0,4 мл/мин (слева направо).
При варьировании состава ПФ, скорости потока ПФ и объема пробы удерживание нитрата калия линейно уменьшается с увеличением концентрации MeCN в ПФ, скорости ПФ и с уменьшением объема пробы (см. табл. П-2, П-3). Все это свидетельствует в пользу бимолекулярного механизма сорбции нитрата калия: вследствие слабых катионообменных свойств остаточных силанольных групп, на поверхности сорбента задерживаются ионы калия, при этом на НФ создается положительно заряженный слой, который и удерживает нитрат-ионы. Этот эффект проявляется в большей степени при низких скоростях ПФ и при низких концентрациях MeCN в ПФ именно потому, что процесс имеет ионную природу, двухстадийный и достаточно медленный.
Зависимость объема удерживания KNO3 от скорости ПФ, колонка NS, ПФ - 10, 30 и 50% MeCN, точками обозначены измеренные значения, цифры — концентрация MeCN.
Значимая корреляция Vm нитрата калия и Т наблюдается только при низких Смесив при этом суммарная дисперсия пика KN03 линейно возрастает с увеличением температуры со скоростью до (0,6±0,2) мкл/К (см. табл. П-4). Заметное снижение изменения парциальной энтальпии сорбции нитрата калия при увеличении концентрации MeCN в ПФ (см. рис. П-2) также подтверждает гипотезу об ионной природе сорбции KNO3.
Определение свободного объема колонки является важным этапом начальной стадии исследования закономерностей удерживания в условиях ВЭЖХ [12, 114]. Используя вычисленные зависимости объемов удерживания нитрата калия от параметров хроматографирования, путем экстраполяции был найден теоретический свободный объем колонки NS, который составил 554±21 мкл или около 30% полного объема колонки. Регрессионный анализ сразу от трех переменных также дает хорошие результаты с высокой степенью корреляции и достоверности. Рассчитанная величина не существенно отличается от полученной ранее (546,5±6,5 мкл, см. табл. П-5). Аналогичным образом рассчитана величина дисперсии при нулевом объеме пробы, нулевой скорости потока и отсутствии сорбции, которая составила (13,9±2,6) мкл (см. табл. П-5). Для объема пробы 5 мкл; при условии отсутствия сорбции зависимость суммарной дисперсии несорбирующегося вещества от скорости потока выражается уравнением: а = (20,7+ 1,5) + (15,7 ± 1,3)-и
По принципу суммирования дисперсий (2.1) показано, что расчетная дисперсия в свободном объеме колонки не зависит от скорости ПФ (г=0,25), что согласуется с уравнением Ван-Деемтера. Иначе говоря, размывание малосорбиругощегося вещества в колонке определяется в основном вихревой диффузией (см. рис. 3.5).
Дополнительным подтверждением наличия сорбции нитрата калия служит выполнение уравнения (1.18) [12, 13] в применении к удерживанию данного вещества. При использовании в расчетах величины Vm = 550 мкл получена удовлетворительная линейная зависимость lgk нитрата калия от объемной концентрации ацетонитрила в ПФ [142]
Определение свободного объема, и дисперсии зоны вещества в хроматографической системе.
Показано, что для сорбатов с высоким удерживанием III, IV и V наблюдается заметное линейное уменьшение к с увеличением скорости ПФ (см. табл. П-7 в приложении). Наблюдаемое изменение удерживания при изменении скорости потока вызвано тем, что процессы массообмена, протекающие при хроматографировании, можно считать равновесными: только при бесконечно малых скоростях потока ПФ [12, 32]. Компенсационный эффект, показывающий общность механизмов сорбции [30, 33], выражается в данном случае во взаимной корреляции коэффициентов линейной зависимости k(u). Таким образом, с некоторым приближением зависимость коэффициентов емкости веществ от скорости потока ПФ можно описать уравнением: k=ko-(l-0,05u), (3.7) где и - объемная скорость потока ПФ (мл/мин), к0 - равновесный коэффициент емкости вещества (зависит от природы вещества, сорбента и состава ПФ).
Зависимость суммарных дисперсий пиков I-V от скорости ПФ достаточно четкая и линейная. Дисперсия в НФ для I практически не зависит от и, слабо для II, для III - V более явно, причем с достаточно высокими регрессионными коэффициентами. Установлено, что только для малоудерживаемого п-аминофенола (I) ВЭТТ практически не зависит от скорости потока ПФ, для остальных веществ зависимость достаточно явная см. рис. 3.9). При этом и значение ВЭТТ для I также аномально выше, чем для II-V, что связано с большим вкладом в размывание пика I свободного объема хроматографической системы и колонки. Для остальных веществ с коэффициентами емкости более 3 возрастает вклад дисперсии сорбции в суммарную дисперсию. нецелесообразно. В данном случае соль в ПФ в основном выполняет функцию буферного компонента, а значит можно использовать небольшие концентрации (например, 25тМ), чтобы не создавать риска загрязнения системы.
Зависимость удерживания и дисперсии I - V от рН и содержания органического модификатора в ПФ.
Зависимость к сорбата от рН ПФ выражается нелинейным уравнением (1.29), по мнению авторов [13] не линеаризуемым обычным способом. Нами было предложено для определения рКа вещества и коэффициентов емкости протонированной и депротонированной форм вещества использовать двухпараметрическую линейную регрессию для преобразованной формы уравнения (1.29) [143]: Чн1=кЛн+]-к-[н+] + кА.Ка (3 8)
Уравнение (3.8) хорошо описывает изменение к для I, IV и V (см. табл. П-8), так как для данных веществ наблюдается существенное отличие гидрофобности протонированной и депротонированной форм. Эти различия настолько ярко выражены, что при изменении рН ПФ от 2,5 до 4,5 наблюдается трижды изменение порядка элюирования компонентов. Для III и IV эти различия менее выражены, что выражается в меньшей зависимости к от рН, особенно при высоких концентрациях MeCN в ПФ (см. рис. ЗЛО). При этом для всех компонентов наблюдается линейная зависимость логарифмов коэффициентов емкости протонированной и депротонированной форм от объемной концентрации ацетонитрила в ПФ (1.18), т.е. в данной области концентраций ацетонитрила выполняется модель Хорвата (см рис. 3.11).
Биноминальные уравнения не намного точнее описывают экспериментальные данные, коэффициенты квадратичного члена имеют значения от 10"3 до 10"6. Коэффициенты корреляции линейных уравнений
Изменения наблюдаемых рК., в рассматриваемом диапазоне состава ПФ не превышают 10%, что не оказывает существенного влияния на изменение удерживания при варьировании рН, поэтому нами было принято постоянство констант ионизации исследуемых сорбатов в рассматриваемом диапазоне содержания ацетонитрила в ПФ.
Как для различных форм 1-V, так и для всего массива рассчитанных коэффициентов уравнения (2.4) на всех колонках выполняется принцип «веерообразности», что выражается в корреляции коэффициентов а и b между собой (см. рис. 3.12, 3.15, 3.16, табл. 3.6). Это свидетельствует об общности механизмов удерживания I - V, несмотря на то, что сравниваются соединения различных классов [12, 13].
Показано, что для разных сорбентов уравнения (2.4) почти параллельны (см рис. П-4 - П-8).Это согласуется с принципом общности механизма удерживания в ОФ ВЭЖХ [12, 13, 32] и позволяет применять оптимизированные методики на различных колонках. Взаимная зависимость к различных форм I - V (см. табл. 3.7) выражается уравнением: lgkHA = a-lgk4 +b (3.9)
За исключением малоудерживаем о го I на колонке NP, в остальных случаях lgk разных форм хорошо коррелируют. Причем на колонке NP для 11 и III, а на колонке SM для И, III, IV и V эти прямые параллельны (коэффициенты а уравнения (3.9) близки к 1). Коэффициенты Ъ уравнения (3.9) характеризуют различие параметров удерживания разных форм I - V и максимальны для кислот IV и V. При этом на различных колонках коэффициенты Ь уравнения (3.9) для этих двух веществ близки, то есть разница удерживания нейтральной и ионной форм кислот IV, V не зависит от характеристик сорбента.
