Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Принцип работы микромеханических устройств 7
2.2. Микромеханические сенсоры и измерительные устройства 10
2.3. Аптамеры 24
2.4. Сенсоры для определения тромбина с рецепторным слоем на основе тромбин-связывающего аптамера 27
2.4.1. Электрохимические сенсоры 28
2.4.2. Пьезокварцевые сенсоры 35
3. Экспериментальная часть 42
3.1. Реагенты 42
3.2. Методы исследования 42
3.2.1. Измерение поверхностного натяжения 42
3.2.2. Пьезокварцевое микровзвешивание 46
3.2.3. Регистрация спектров поглощения 46
3.2.4. Получение и обработка микрофотографий 46
3.2.5. Атомно-силовая микроскопия 47
3.2.6. Масс-спектрометрия 47
3.3. Методики 47
3.3.1. Иммобилизация 3-аминопропилтриэтоксисилана на поверхности кантилевера 47
3.3.2. Синтез 3-аминопропилсилатрана 47
3.3.3. Иммобилизация белков на поверхности кантилевера 48
3.3.4. Очистка пьезокварцевого кристалла 49
3.3.5. Иммобилизация тромбин-связывающего аптамера на поверхности электродов пьезокварцевого кристалла 49
3.3.6. Проведение адсорбционных измерений 49
3.3.7. Синтез конъюгатов тромбина с наночастицами серебра, стабилизированными меркаптоянтарной кислотой 50
3.3.8. Синтез конъюгатов тромбина с наночастицами серебра и золота, стабилизированными хитозаном 50
3.3.9. Спектрофотометрическое определение концентрации тромбина по методу Брэдфорд 51
4. Обсуждение результатов 52
4.1. Химическое модифицирование кантилевера 52
4.1.1. Модифицирование 4-аминотиофенолом 54
4.1.2. Модель изменения поверхностного натяжения на межфазной границе твердое тело - жидкость в процессе адсорбции 57
4.1.3. Модифицирование 3-аминопропилтриэтоксисиланом 63
4.1.4. Модифицирование 3-аминопропилсилатраном 66
4.1.5. Модифицирование глутаровым альдегидом 68
4.1.6. Иммобилизация белков на поверхности кантилевера 70
4.1.7. Влияние природы модификатора на изменение поверхностного натяжения в процессе сорбции 73
4.2. Агрегация лизоцима на поверхности кантилевера 77
4.3. Иммунохимический микромеханический сенсор для определения морфина 81
4.4. Микромеханический сенсор для определения тромбина 87
4.5. Пьезокварцевый сенсор для определения тромбина 88
4.5.1. Подготовка кристалла к проведению адсорбционных измерений 89
4.5.2. Иммобилизация тромбин-связывающего аптамера на поверхности пьезокварцевого резонатора 90
4.5.3. Оптимизация состава буферного раствора 91
4.5.4. Оптимизация состава регенерирующего раствора 93
4.5.5. Адсорбция тромбина на поверхности пьезокварцевого резонатора, покрытой тромбин-связывающим аптамером 95
4.5.6. Синтез наночастиц серебра и золота 101
4.5.7. Иммобилизация тромбина на поверхности наночастиц серебра и золота 104
4.5.8. Адсорбция конъюгатов тромбина с наночастицами серебра и золота на поверхности пьезокварцевого резонатора, покрытой тромбин-связывающим аптамером 105
Выводы 108
Список литературы ПО
- Микромеханические сенсоры и измерительные устройства
- Электрохимические сенсоры
- Измерение поверхностного натяжения
- Модифицирование 4-аминотиофенолом
Введение к работе
Одним из активно развивающихся приложений метода химического модифицирования поверхности является разработка химических и биосенсоров — аналитических устройств, включающих взаимодействующий с определяемым веществом рецепторный слой, тесно связанный или интегрированный с физическим преобразователем [1].
Каждый из известных сегодня типов сенсоров (электрохимические, полупроводниковые, оптические, масс чувствительные и т. д.) обладает своими достоинствами и недостатками, поэтому представляет интерес не только совершенствование рецепторов известных типов, но и разработка новых селективных высокочувствительных сенсорных систем, раскрытие их потенциальных возможностей и преимуществ.
Селективность сенсора определяется наличием на поверхности преобразователя прочно зафиксированного слоя функциональных групп или молекул, способных специфично и, желательно, обратимо взаимодействовать с определяемым веществом — анали-том. Создание такого рецепторного слоя - необходимое, но не достаточное условие эффективности сенсора [2].
Начиная с 1950-х годов практически единственными реакциями, используемыми для специфического определения концентрации биологически активных соединений, были взаимодействие антиген-антитело и гибридизация ДНК. Затем, после открытия Элингтоном в 1990 г. "аптамеров" [3] - короткоцепочечных однотяжевых олиго-нуклеотидов, способных к селективному, а в некоторых случаях и специфичному, связыванию с определенными биологически активными соединениями, - появилась возможность использования альтернативных комплексообразователей в составе рецепторного слоя сенсоров. Опубликованные работы, посвященные применению аптамеров в сенсорах, носят пока преимущественно иллюстративный характер, и подробных сведений о поведении аптамеров на рабочей поверхности сенсоров получено пока немного. Вместе с тем, знание строения и свойств привитых слоев аптамеров на поверхности рецептора позволит разработать более эффективные методики экспрессного определения различных биологически активных соединений в многокомпонентных объектах. Хорошо алгоритмизированный способ получения индивидуальных аптамеров (процедура SELEX, предложенная Элингтоном) в сочетании со сведениями о поведении иммобилизованных аптамеров в перспективе может создать предпосылки для разработки унифицированных методик экспресс-определения большого числа аналитов.
Наряду с открытием аптамеров в последние десятилетия произошел технологический прорыв в области изготовления кремниевых микроконсолей (кантилеверов) для атомно-силовой микроскопии, позволивший создать чувствительные тепловые, магнитные, масс-сенсоры. Успешное использование кантилеверов для детектирования самых разных физических взаимодействий открывает широкие перспективы создания на их основе принципиально нового класса химических сенсоров - так называемых микромеханических сенсоров [4-7], в которых регистрируется изменение поверхностного натяжения на границе рецептор — окружающая среда. Потенциальные возможности микромеханических сенсоров и области, в которых возможно их наиболее эффективное применение, еще только предстоит выяснить.
Подавляющее большинство работ в области микромеханических сенсоров в настоящее время носит иллюстративный характер и посвящено определению отдельно взятого аналита с помощью соответствующего селективного комплексообразующего реагента, иммобилизованного на поверхности кантилевера [4-7]. Влияние способа иммобилизации и структуры образующегося привитого слоя на величину аналитического сигнала и, как следствие, на чувствительность и другие характеристики сенсора зачастую систематически не исследуется. Также редко обсуждаются механизмы процессов, приводящих к изменению поверхностного натяжения в области привитого слоя. Лишь в самое последнее время начали появляться работы [8, 9], свидетельствующие об определяющем влиянии расположения молекул реагентов в привитом слое на экспериментально определяемую величину отклика сенсора -поверхностного натяжения на границе рецепторного слоя с анализируемым раствором. Это позволяет предположить, что микромеханические устройства на основе кантилеверов могут служить не только в качестве средств инструментального экспресс-анализа, но и в качестве инструментов для изучения привитых слоев и физико-химических процессов в приповерхностном слое. Поэтому выявление того, какую информацию о них можно получить с помощью микромеханических устройств на основе кантилеверов, является, несомненно, интересной и актуальной в фундаментальном аспекте задачей.
Для этого необходимо на примере использования различных модификаторов поверхности и адсорбатов выявить основные закономерности возникновения аналитического сигнала в микромеханических сенсорах и установить степень влияния различных процессов, протекающих в привитых слоях, на поверхностное натяжение.
В связи с этим, основной целью работы было изучение физико-химических процессов в привитых рецепторных слоях микромеханических и пьезокварцевых сенсоров. Для достижения этой цели решались следующие задачи:
1. Изучение динамики изменения поверхностного натяжения привитого слоя в процессах модифицирования кантилевера на примере иммобилизации различных белков с помощью метода химической сборки на поверхности. Выявление вклада латеральных межмолекулярных взаимодействий в привитых слоях в поверхностное натяжение.
2. Изучение динамики изменения поверхностного натяжения в процессе структурной организации привитого слоя молекул лизоцима.
3. Разработка методов создания рецепторных слоев микромеханических сенсоров, способных к эффективному генерированию аналитического сигнала при селективной сорбции определяемого вещества.
4. Изучение аналитических характеристик модельных микромеханических сенсоров для определения тромбина (одного из ключевых ферментов системы свертывания крови), морфина и антител к морфину.
5. Изучение комплексообразующей способности тромбин-связывающего аптамера, иммобилизованного на поверхности золота. Создание модельного пьезокварцевого сенсора для определения тромбина и оптимизация методики определения тромбина в модельных растворах, имитирующих сыворотку крови. Поиск способов увеличения чувствительности разработанного сенсора.
6. Сравнительный анализ эффективности микромеханических и пьезокварцевых сенсоров.
Микромеханические сенсоры и измерительные устройства
Первым практическим применением микромеханических устройств на основе кантилевера стала атомно-силовая микроскопия (АСМ) [10], которая, по сути, представляет собой прецизионную профилографию, в которой зондом является кантилевер.
Для достижения большей разрешающей способности на конце консоли кантилевера для АСМ дополнительно формируют острие с небольшим радиусом закругления от 1 нм (острия из углеродистых материалов) до 40 нм (острия из кремния или нитрида кремния). Форма кантилевера для АСМ в зависимости от требуемых характеристик упругости может быть 1-образной (рис. 3) или V-образной (рис. 4).
В процессе исследования рельефа поверхности в контактном варианте АСМ, который наиболее близок к традиционной профилографии, острие кантилевера подводят к исследуемому образцу до тех пор, пока сила взаимодействия (притяжения или отталкивания) между образцом и острием не достигнет заранее заданной величины. Затем кантилевер перемещают к другой точке поверхности и определяют расстояние, на которое необходимо сместить острие для достижения той же величины силы взаимодействия. Контролируемое перемещение кантилевера по вертикали и вдоль поверхности осуществляют с помощью пьезокерамического манипулятора, которым управляет система обратной связи, получающая от оптической детектирующей системы информацию о текущем значении силы взаимодействия кантилевера и поверхности образца.
При исследовании поверхности в режиме прерывистого контакта кантилевер с помощью пьезоэлектрического манипулятора раскачивают с определенной частотой, а затем подводят колеблющийся кантилевер к поверхности. При этом в результате взаимодействия острия консоли с поверхностью происходит изменение амплитуды и резонансной частоты колебаний кантилевера, которое можно зафиксировать с помощью системы детектирования изгиба.
Одним из вариантов изучения поверхности в режиме прерывистого контакта является силовая спектроскопия [15, 16], в которой измеряется сила, требуемая для отрыва острия кантилевера от поверхности. Если при этом использовать кантилевер, на острие которого закреплены молекулы определенного вещества, то полученные значения будут характеризовать силу взаимодействия различных участков поверхности с иммобилизованным на кантилевере реагентом (рис. 5). Так были определены силы взаимодействия различных пар молекул [17, 18], включая прочность связи антиген-антитело (=50 пН) [19]. Поскольку резонансная частота колебаний кантилевера зависит от массы консоли, то на основе кантилевера можно реализовать устройство для измерения массы. Для этого объект, массу которого требуется измерить, помещают на конец консоли (рис. 6), измеряют амплитудно-частотные характеристики нагруженного кантилевера и по сдвигу резонансной частоты определяют массу объекта.
Такие устройства позволяют измерять массы порядка нескольких фемтограмм [21-24]. С помощью этого метода была взвешена одиночная бактерия [23] массой 665 фг, а также вирусная частица [20] массой 9,5 фг. В работе [25] описано микромеханическое устройство, с помощью которого по смещению резонансной частоты кантилевера изучали процесс прорастания спор плесневых {Aspergillus niger) и дрожжевых {Saccharomyces cerevisiae) грибков, иммобилизованных на поверхности консоли. При определенных условиях (27С, влажность 97%) споры практически полностью прорастали за 4 часа.
Следует отметить, что амплитудно-частотные характеристики и, в частности, резонансная частота кантилевера подвержены влиянию различных параметров среды, в которой находится консоль: влажности, вязкости, температуры [33-35]. Поэтому для обеспечения хорошей воспроизводимости результатов необходимо тщательно следить за постоянством условий проведения экспериментов.
Уже через несколько лет с момента создания первого атомно-силового микроскопа в 1986 году [10] были предложены различные вариации этого вида зондовой микроскопии [36-39], которые были разработаны для изучения различных физико-химических свойств локальных участков поверхности твердых тел, например намагниченности [38, 39]. Основаны эти методы на размещении на консоли дополнительных миниатюрных датчиков для локального измерения какого-либо физико-химического свойства поверхности. Наибольшая простота конструкции таких датчиков достигается в том случае, если со стороны поверхности на чувствительный элемент действует сила. Так, например, если разместить на поверхности консоли ориентированный микромагнит, то сила, действующая на него со стороны намагниченной поверхности, будет передаваться кантилеверу и вызывать изгиб консоли [38, 39]. В этих устройствах, ведущих свое происхождение от классических атомно-силовых микроскопов, сила, действующая на кантилевер со стороны поверхности или внешнего поля, прилагается в основном к незакрепленному концу консоли или к острию. Если же внешнее воздействие затрагивает всю поверхность консоли, то рабочая поверхность устройства существенно увеличивается.
Первыми микромеханическими устройствами, реализованными по такому принципу, стали микротермометры, действие которых основано на различии коэффициентов теплового расширения основы кантилевера (кремния или нитрида кремния) и металлического отражающего слоя. При нагревании кантилевера основа и отражающий слой расширяются неодинаково, что приводит к изгибанию консоли, величину которого можно зафиксировать с помощью классической детектирующей системы [40-43]. Этот эффект используется также в сканирующей тепловой микроскопии для получения карты локального распределения температуры на поверхности исследуемого образца.
Микромеханический термометр такого типа был использован для изучения каталитической реакции окисления водорода на пленке платины, напыленной на кантилевер, при этом погрешность измерения температуры составила около 10 5К[43].
Наряду с изменением температуры деформацию бислойного кантилевера может вызвать и адсорбция различных компонентов окружающей среды на поверхности консоли. Действительно, до приведения в контакт с жидкостью или газом кантилевер находится в механическом равновесии, и форма консоли определяется механическими напряжениями в отражающем слое и подложке. Затем, при внесении кантилевера в ячейку, заполненную жидкостью или газом, компоненты среды начинают адсорбироваться на поверхности консоли. В связи с различной химической природой материалов основы и отражающего слоя адсорбция различных компонентов среды на противоположных сторонах кантилевера будет неодинаковой. Хорошо известно, что адсорбция веществ на границе раздела твердое тело - жидкость и твердое тело — газ приводит к изменению внутренней энергии приповерхностных слоев, к изменению поверхностного натяжения на границе раздела фаз и, как следствие, к изменению величины механических напряжений в твердом теле. В свою очередь это приводит к тому, что механическое равновесие кантилевера нарушается. Для того чтобы скомпенсировать его, консоль вынуждена изгибаться в сторону поверхности с большим значением поверхностного натяжения до тех пор, пока механические напряжения в теле консоли не уравновесят силы поверхностного натяжения.
Электрохимические сенсоры
В первом типе электрохимического сенсора для детектирования взаимодействия аптамера с тромбином используется дополнительное электрохимически активное вещество - зонд, который нековалентно связывается с молекулой тромбина. Именно таким образом становится возможным косвенное детектирование тромбина по току восстановления или окисления зонда.
В работе [123] описаны устройство и принцип работы такого электрохимического сенсора. Сенсор содержит трехэлектродную ячейку, где в качестве рабочего используется золотой электрод, поверхность которого предварительно модифицируется необходимым аптамером, хлоридсеребряный (Ag/AgCl) электрод выполняет функцию электрода сравнения, а вспомогательным является платиновый электрод. Рабочий электрод погружается в раствор 2 мМ метиленового синего и добавляется буферный раствор, содержащий тромбин в определенной концентрации. Величина заряда, прошедшего через ячейку при восстановлении МС на поверхности рабочего электрода, измеряется с использованием дифференциальной импульсной вольтамперометрии или циклической вольтамперометрии. На рис. 17 приведена схема рабочего электрода электрохимического сенсора на тромбин. Схема электрохимического сенсора [123] для определения тромбина. Определение тромбина с помощью электрохимического сенсора с иммобилизованным аптамером [123, 124] состоит из следующих последовательных стадий (рис. 17): 1. Предварительной стадией анализа, предшествующей иммобилизации аптамера, является тщательная очистка поверхности электрода. Для этого электрод последовательно погружают в ультразвуковую ванну с хлороформом на 3-5 мин, обрабатывают раствором «пираньи» (смесь конц. Н2О2 и H2SO4 в объемном соотношении 1:3) и затем промывают дважды дистиллированной водой. 2. Модифицирования очищенного электрода раствором тромбин-связывающего аптамера. При этом на поверхности электрода образуется привитый слой, способный селективно связывать тромбин. 3. Инкубирования модифицированного электрода с раствором бычьего сывороточного альбумина, который физически адсорбируется на свободных участках поверхности электрода. 4. Обработки электрода с иммобилизованным аптамером раствором тромбина определенной концентрации с добавкой метиленового синего. 5. Отмывки электрода от метиленового синего, не связавшегося в комплекс с тромбином. 6. Электрохимического восстановления метиленового синего, связанного в комплекс с тромбином. При этом ток восстановления пропорционален содержанию тромбина в пробе. 7. Регенерации электрода, которая необходима для разрушения комплекса аптамера с белком и восстановления третичной структуры аптамера. Для этой цели могут быть использованы растворы НС1 (1,0 М), NaCl (2,0 М), NaOH (1,0 М), Na2C03 (0,05 М), глицина H2NCH2COOH (2,0 М). Как сообщается в работе [125], все эти регенерирующие агенты эффективно разрушают комплекс аптамера с тромбином, сохраняя при этом первоначальную «связывающую способность» аптамера к тромбину.
Для обеспечения прочного закрепления молекул аптамера в работе [131] использовали так называемую авидин-биотиновую технологию: авидин, закрепленный на поверхности, обрабатывали биотинилированным аптамером. Биотин образует высокоспецифичный комплекс с авидином, характеризующийся одной из самых высоких констант связывания И015М" ), тем самым обеспечивая прочное закрепление аптамера на поверхности электрода.
Следует отметить, что образование самособирающихся монослоев сераорганических соединений, содержащих реакционноспособные функциональные группы, способные к последующему взаимодействию с белковыми молекулами, широко используется для прочного закрепления рецепторного покрытия на поверхности сенсора [130]. В качестве таких сераорганических соединений обычно используют различные эфиры 3,3 -дитиопропионовой кислоты, тиосалициловой кислоты, цистам ин [2].
Площадь под кривой соответствует величине заряда Q, перенесенного от электрода к метиленовому синему. Из рисунка видно, что при увеличении концентрации тромбина, содержащегося в добавляемой пробе, площадь пика под вольтамперметрической кривой увеличивается.
Также в этой работе была изучена неспецифическая адсорбция других белков, в частности бычьего альбумина, на модифицированном электроде и построен градуировочный график зависимости относительной величины перенесенного заряда AQ/Qo от концентрации белков (рис. 20), AQ/Qo = (Q-Qo)/Qo, где Q0 - соответствует величине заряда, переданного от электрода к метиленовому синему в отсутствии белков, a Q - в присутствии разных концентраций тромбина и альбумина. Как можно заметить, увеличение концентрации тромбина приводит к значительному повышению величины AQ/Qo. в то время как увеличение концентрации альбумина в пробе практически не влияет на величину относительного изменения заряда AQ/Qo Этот эксперимент показывает, что неспецифическое связывание альбумина с аптамером имеет место, однако при этом аналитический сигнал от такого взаимодействия оказывается столь незначительным, что не сможет помешать определению тромбина, например, из смеси этих двух белков.
Измерение поверхностного натяжения
Для изучения химического модифицирования кантилевера было использовано устройство, позволяющее исследовать в жидкой и газовой фазе натяжение тонких пленок и динамику процессов, протекающих на поверхности кантилевера (рис. 29), сконструированное и изготовленное на Физическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова. система обработки сигнала Схему установки (рис. 29) можно разбить на две части. 1. Механическая часть состоит из: 1 - кантилевера, закрепленного в тефлоновом держателе; 2 - лазера, направленного на отражающую поверхность кантилевера в область свободного конца консоли; 3 - позиционного фотодиода, генерирующего разность потенциалов, которая зависит от освещенности участков (долей) фотодиода; 4-тефлоновой измерительной ячейки объемом 200 мкл, накрытой сверху уплотняющей силиконовой прокладкой и гидрофобизованным покровным стеклом. 2. Электронная часть состоит из: 5 - аналоговой системы предусиления сигнала, поступающего с фотодиода; 6 - аналогово-цифрового преобразователя (АЦП).
Покровное стекло, накрывающее рабочую ячейку, предварительно гидрофобизовьшали для блокирования поверхностных гидроксильных групп. Для этого ее помещали на 12 часов в 5%-ный водный раствор азотной кислоты для активации ОН-групп, промывали ацетоном, высушивали и погружали в 1%-ный раствор триметилхлорсилана (Acros Organics) в бензоле на сутки:
При отклонении незакрепленного конца консоли от исходного положения отраженный лазерный луч, падающий на позиционный фотодиод, также сдвигается, что приводит к изменению освещенности и, следовательно, электрического потенциала различных участков фотодиода. Именно электрический потенциал участков фотодиода и является непосредственно измеряемой на опыте величиной. Разность потенциалов верхней и нижней долей позиционного фотодиода пропорциональна смещению луча в вертикальной плоскости, а разность потенциалов левой и правой долей - в горизонтальной плоскости (причиной смещения луча в горизонтальной плоскости могут быть крутильные колебания консоли кантилевера). Измеренные разности потенциалов во всех случаях нормировали с учетом интенсивности отраженного луча, определяемой как сумма потенциалов верхней и нижней долей фотодиода. Сигнал с фотодиода регистрировали с интервалом 20 мс. Для экспериментального определения зависимости разности потенциалов от смещения консоли проводили процедуру калибровки: кантилевер закрепляли на пьезокерамическом манипуляторе, наводили лазерный луч на конец консоли и устанавливали позиционный фотодиод так, чтобы отраженный луч падал в центр фотодиода. Затем манипулятором передвигали кантилевер в вертикальной плоскости на заранее заданное расстояние и регистрировали разность потенциалов верхней и нижней долей фотодиода. Следует подчеркнуть, что при таком передвижении радиус кривизны консоли не изменяется, в то время как в реальном эксперименте смещение конца консоли происходит в результате изгиба консоли - изменения ее радиуса кривизны R. Угол падения лазерного луча на изогнутый кантилевер при фиксированном смещении конца кантилевера зависит от R и отличается от угла падения луча на плоский кантилевер (R— x ). Это приводит к смещению точки падения отраженного луча на фотодиод (рис. 30). В связи с этим, для правильного определения зависимости разности потенциалов от смещения конца консоли в результате ее изгиба при калибровке вводили соответствующую поправку, рассчитанную исходя из Далее при проведении экспериментов из измеренной разности потенциалов по калибровочной зависимости определяли смещение конца консоли и по формуле Стони рассчитывали разность поверхностного натяжения на верхней ( тв) и нижней (ан) сторонах консоли Ла = ое - ан = KAz, которая вызывает наблюдаемое смещение конца консоли (Az), К - коэффициент пропорциональности, зависящий от геометрических размеров консоли и ее упругости. Коэффициент жесткости консоли определяли по методу Сэйдера.
Наибольшую случайную погрешность в измеряемую величину разности поверхностного натяжения вносили фоновые колебания кантилевера в жидкости, возникающие из-за влияния температуры на модуль упругости и размеры кантилевера, а также из-за механических колебаний жидкости и ячейки. Величина случайной погрешности определения поверхностного натяжения составила в среднем 0,5 мН/м.
Обработку сигнала осуществляли с помощью программного комплекса Femtoscan Online v. В работе использовались кремниевые кантилеверы CSG01S производства НИИФП (Государственный Научно-Исследовательский Институт Физических проблем имени Ф.В. Лукина) с золотой отражающей поверхностью (табл. 3). Каждый новый кантилевер перед помещением в измерительную ячейку очищали, обрабатывая его горячей смесью равных объемов конц. H2SO4 и 30%-ного Н202 и затем многократно промывая дистиллированной водой. В работе использовали пьезокварцевые кристаллы АТ-среза с золотыми электродами с базовой частотой колебаний 5 МГц (Stanford Research System). Между золотым электродом и поверхностью кристалла находился слой хрома, необходимый для обеспечения хорошей адгезии электродов к кварцу. Средний размер неровностей поверхности электродов по данным производителя составлял 5 нм. Для проведения измерений использовали установку пьезокварцевого микровзвешивания QCM 100 (Stanford Research System), включающую проточную измерительную ячейку объемом 100 мкл. Для проведения измерений в проточно-инжекционном режиме к ячейке через соединительные трубки были последовательно подсоединены инжектор для ввода исследуемого раствора в поток и шприцевой насос ЮСП-100 .
Модифицирование 4-аминотиофенолом
Для создания на золотой поверхности слоя аминогрупп в работе использовали реакцию 4-АТФ с поверхностью золота. В процессе протекания реакции в течение первого часа результирующее поверхностное натяжение оставалось на постоянном уровне, а затем начало уменьшаться вплоть до установления постоянного значения -345±5 мН/м .
Вместе с тем, известно, что хемосорбция тиолов и дисульфидов на поверхности золота обычно хорошо аппроксимируется кинетической моделью, в которой постулируется, что на поверхности существует фиксированное число эквивалентных адсорбционных центров [47, 145, 146].
Следует отметить, что авторы работ, посвященных микромеханическим сенсорам, в некоторых случаях указывают на подобный аномальный характер изменения результирующего поверхностного натяжения со временем. В качестве наиболее вероятной причины наблюдаемого явления авторы [47] указывают на десорбцию загрязнений с поверхности кантилевера при инкубации с раствором или с парами адсорбата. Такое объяснение трудно признать удовлетворительным. Действительно, маловероятно, чтобы скорость изменения поверхностного натяжения в результате десорбции загрязнений неизвестной природы в течение достаточно продолжительного времени в точности совпадала по модулю со скоростью изменения поверхностного натяжения в результате адсорбции тиола, что необходимо для объяснения постоянства результирующего поверхностного натяжения во время инкубационного периода. Кроме того, кантилеверы перед экспериментом обычно тщательно очищают от загрязнений обработкой ультрафиолетом и сильными окислителями с последующей промывкой чистым растворителем. С помощью пьезокварцевого микровзвешивания при адсорбции тиолов в аналогичных условиях после такой очистки не удается обнаружить присутствия на поверхности десорбирующихся загрязнений, при этом индукционный период также отсутствует.
Таким образом, требуется найти более подходящее объяснение возникновению при хемосорбции некоторых тиолов достаточно длительного индукционного периода. Поскольку индукционный период наблюдается только при слежении за процессом адсорбции посредством измерения поверхностного натяжения, то и причину этого эффекта следует искать, рассматривая механизм развития сил поверхностного натяжения в приповерхностном слое.
Поверхностное натяжение на границе твердого тела с жидкой или газовой фазой зависит от многих факторов и, в первую очередь, от состава контактирующих фаз. Каждый из адсорбирующихся компонентов вносит свой вклад в поверхностное натяжение. Кроме того, необходимо учитывать структуру и удельный заряд поверхности раздела, а для границы раздела твердое тело - электролит еще и влияние двойного электрического слоя.
Первым шагом на пути расчета изменения поверхностного натяжения в процессе адсорбции определенного вещества является попытка вычленить вклад этого вещества из суммарной величины поверхностного натяжения и рассматривать его независимо от вкладов других компонентов. Для этого требуется учесть межмолекулярные взаимодействия различных компонентов, присутствующих в приповерхностном слое. В случае адсорбции из раствора необходимо принять во внимание как минимум парные взаимодействия молекул адсорбат-адсорбат, адсорбат-растворитель и растворитель-растворитель.
Рассмотрим упрощенную модель адсорбционного слоя. Предположим, что все адсорбционные центры на поверхности кантилевера эквивалентны и равномерно распределены по поверхности сорбента. Тогда каждый адсорбционный центр может контактировать либо с молекулами адсорбата А, либо с молекулами растворителя S (рис. 34). () - молекула адсорбата. В - молекула растворителя - адсорбционный центр
Схематическое изображение адсорбционного слоя с квадратной решеткой; стрелками обозначены силы поверхностного натяжения (F), действующие на границы выделенного контура. Выделим на поверхности кантилевера произвольный прямоугольный контур.
Тогда по определению поверхностного натяжения [147] на каждую из сторон этого контура будет действовать сила поверхностного натяжения, равная F = ol, где / длина соответствующей стороны. Сила F направлена внутрь контура перпендикулярно его границе. На микроскопическом уровне сила F складывается из латеральных межмолекулярных взаимодействий в адсорбционном слое (рис. 35), поскольку например, силы взаимодействия молекул адсорбата с поверхностью направлены перпендикулярно поверхности сорбента. Этапы расчета силы поверхностного натяжения: а) расчет силы, действующей на участок поверхности, смежный с выбранным адсорбционным центром; б) расчет силы, действующей на одной из сторон контура.
Для удобства рассмотрения примем, что адсорбционные центры на поверхности кантилевера образуют квадратную квазикристаллическую решетку и проведем границу контура между адсорбционными центрами. Тогда по обе стороны от границы будут расположены центры, связанные либо с молекулами адсорбата, либо с молекулами растворителя, причем наиболее сильное взаимодействие будет наблюдаться между молекулами, адсорбированными на смежных центрах адсорбции. Затем выберем один из центров адсорбции. Тогда, сложив силы латерального взаимодействия молекул, связанных с выбранным центром, с молекулами, находящимися по другую сторону границы контура, можно найти результирующую силу, действующую на участке контура, соответствующем выбранному адсорбционному центру (рис 4.3а). Проведя аналогичную процедуру со всеми оставшимися центрами, примыкающими к границе контура и просуммировав силы, отвечающие отдельным участкам контура, можно найти макроскопическую силу, действующую на рассматриваемую сторону контура (рис 4.36). Поделив абсолютное значение этой силы на длину стороны, можно рассчитать значение поверхностного натяжения на поверхности кантилевера, покрытой адсорбционным слоем. Описанный подход аналогичен методу расчета константы Гамакера, определяющей энергию когезии двух частей одной и той же фазы [147].
