Катионные динитрозильные комплексы железа с тиомочевиной и ее производными – новые доноры оксида азота Шматко Наталья Юрьевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 11

1.1 Биологическая значимость оксида азота (NO) 11

1.2 Железо-серные кластеры как мишени эндогенного NO 12

1.3 Нитрозильные комплексы железа – доноры NO 17

1.4 Динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ)

1.4.1 Анионные ДНКЖ 31

1.4.2 Нейтральные ДНКЖ 39

1.4.3 Катионные ДНКЖ 44

1.5 Тиомочевина и ее производные как функциональные серосодержащие

лиганды 47

ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 52

2.1 Материалы 52

2.2 Синтез катионных ДНКЖ с тиомочевиной и ее производными 53

2.3 Получение полимерных композитов, содержащих ДНКЖ 57

2.4 Физико-химические методы исследования

2.4.1 Рентгеноструктурный анализ 58

2.4.2 Элементный анализ 59

2.4.3 Растровая электронная микроскопия 59

2.4.4 Инфракрасная спектроскопия 59

2.4.5 Мессбауэровская спектроскопия 60

2.4.6 ЭПР-спектроскопия 60

2.4.7 Масс-спектрометрия 61

2.4.8 Амперометрическое определение NO-донорной активности 61

2.4.9 Квантово-химические расчеты 61

2.5 Исследование биологической активности 62

ГЛАВА 3. Обсуждение результатов 64

3.1 Синтез катионных ДНКЖ с производными тиомочевины 64

3.2 Молекулярное и кристаллическое строение катионных ДНКЖ с тиомочевиной и ее производными 70

3.3 Изучение спектроскопических характеристик катионных ДНКЖ 84

3.3.1 ИК-спектроскопия катионных динитрозильных комплексов железа 84

3.3.2 Мессбауэровская спектроскопия катионных динитрозильных комплексов железа 90

3.3.3 ЭПР-спектроскопия катионных динитрозильных комплексов железа 93

3.4 Исследование NO-донорной активности катионных ДНКЖ 102

3.4.1 Экспериментальное исследование процесса генерации оксида азота 102

3.4.2 Квантово-химическое моделирование процесса NO-донирования 111

3.5 Исследование цитотоксической активности катионных ДНКЖ с тиомочевиной и ее производными 123

Выводы 138

Заключение 140

Представление результатов 141

Список литературы 145

• Железо-серные кластеры как мишени эндогенного NO
• Физико-химические методы исследования
• Амперометрическое определение NO-донорной активности
• ЭПР-спектроскопия катионных динитрозильных комплексов железа

Введение к работе

Актуальность работы. Детальные исследования в области биологии оксида азота (NO) и обнаружение широкого спектра физиологических функций NO в организме человека в последнее десятилетие стали основой для разработки стратегий дизайна NO-терапевтических лекарственных средств. На сегодняшний день NO-терапия является новейшим подходом к лечению социально-значимых заболеваний во всем мире. Многие социально-значимые заболевания – гипертония, ишемия миокарда, онкологические, вирусные, инфекционные заболевания и т.д. – вызваны нарушением физиологических процессов, связанных с изменением эндогенного уровня оксида азота.

Биологическая значимость оксида азота является результатом его высокой реакционной способности, обусловленной наличием неспаренного электрона на * молекулярной орбитали NO. Высокое сродство NO к атому Fe приводит к взаимодействию оксида азота с различными железо-содержащими протеинами, рибонуклеотидредуктазой, ферритином, [Fe-S] кластерами и т.д. В случае связывания NO с {[Fe2S2](SCys)4} активным центром [2Fe-2S] ферредоксинов образуются динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ), впервые идентифицированные с помощью характеристического ЭПР-сигнала с g=2.03. В клетках и тканях динитрозильные комплексы железа выполняют функции хранения и транспортировки эндогенного NO. Создание синтетических аналогов природных «депо» оксида азота – нитрозильных комплексов железа с функциональными серосодержащими лигандами открывает перспективы целенаправленного конструирования лекарственных средств принципиально иного механизма действия.

Среди экзогенных доноров NO особый интерес представляет поиск новых
водорастворимых моноядерных динитрозильных комплексов железа с различными
функциональными серосодержащими лигандами (SR) – менее токсичных (в отличие
от известных полиядерных железо-нитрозильных комплексов) и биодоступных. В
настоящее время в литературе среди [Fe-2S] динитрозильных комплексов известно
лишь несколько соединений с функциональными серосодержащими лигандами SR –
нейтральные (состава [Fe(SR)2(NO)2]⁰]) и анионные ДНКЖ (состава

Q⁺[Fe(SR)2(NO)2], где Q – нефункциональный органический или метал-органический катион). Однако плохая растворимость нейтральных ДНКЖ в водных растворах делает их непривлекательными для практического применения в медицине. Водорастворимые анионные ДНКЖ являются неэффективными донорами NO и нуждаются в дополнительной фото- или термоактивации. Поэтому поиск новых синтетических подходов к получению солевых форм ДНКЖ – стабильных в твердой фазе и эффективно генерирующих NO в водных и физиологических растворах остается по-прежнему актуальным.

В настоящей диссертационной работе в качестве функциональных серосодержащих лигандов выбрана тиомочевина и ее алифатические производные,

которые широко известны как противоопухолевые, антибактериальные,

противовирусные и антитуберкулезные агенты. Производные тиомочевины обладают высокой координирующей способностью по отношению к атому железа и образуют стабильные соли [Fe(L)n]²⁺, где L – алифатические производные тиомочевины. К тому же, тиомочевина и ее производные могут быть представлены тиоамидной и цвиттер-ионной тиоимидной резонансными формами, что обуславливает структурное разнообразие получаемых на основе этих лигандов новых нитрозильных комплексов железа.

Таким образом, создание гибридных молекул на основе биометалла – железа, содержащих в своем составе два лекарственных фармакофора, молекулы оксида азота и тиомочевины, открывает возможность получения лекарственных препаратов с широким спектром биологической активности.

Цель диссертационной работы состояла в разработке новых синтетических
подходов к получению водорастворимых NO-донирующих соединений,

динитрозильных комплексов железа с тиомочевиной и ее производными, исследовании их строения, физико-химических свойств и биологической активности как основа для создания лекарственных средств с заданными фармакологическими свойствами.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

разработка методик синтеза новых катионных ДНКЖ с тиомочевиной и ее алифатическими производными (N,N^/-диметилтиомочевиной и N-этилтиомочевиной);

изучение молекулярной и кристаллической структуры всех синтезированных соединений методом рентгеноструктурного анализа;

изучение физико-химических характеристик катионных динитрозильных комплексов в твердой фазе и в растворах методами ИК-, ЭПР-, Мессбауэровской спектроскопии и масс-спектрометрии;

исследование процесса генерации оксида азота моноядерными катионными железо-серными комплексами в растворах с помощью амперометрического метода и квантово-химического моделирования;

исследование цитотоксической активности катионных ДНКЖ с производными тиомочевины на культурах клеток различного генеза (in vitro);

получение и исследование свойств водорастворимых полимерных композитов, содержащих катионные ДНКЖ, как перспективных материалов медицинского назначения.

Научная новизна. Впервые получены моноядерные динитрозильные
комплексы железа с лигандами ряда тиомочевины, которые на сегодняшний день
являются единственными представителями биомиметиков нитрозильных [Fe-2S]
ферредоксинов катионного типа. Разработаны методики их синтеза в

кристаллической форме, основанные на реакции нитрозилирования солей железа в
сильнокислых водных растворах функциональных серосодержащих лигандов ряда
тиомочевины и получены их полимерные композиты на основе

поливинилпирролидона как прототипа лекарственной формы для применения перспективных катионных комплексов в медицинской практике.

Впервые изучены молекулярное и кристаллическое строение, физико-химические свойства и биологическая активность всех синтезированных ДНКЖ с производными тиомочевины. Смещение положения полос валентных колебаний NO групп катионных ДНКЖ в область больших значений частот, согласно данным ИК-спектроскопии, указывает на увеличение положительного заряда на NO группах в катионных ДНКЖ, а, следовательно, их более высокую электрофильную и нитрозирующую способность по сравнению с нейтральными и анионными ДНКЖ. С помощью амперометрического анализа было установлено, что NO-донорная активность катионных ДНКЖ в водных растворах зависит от pH, причем в более щелочной среде наблюдается пролонгированное выделение оксида азота. Проведено квантово-химическое моделирование процесса генерации NO динитрозильным катионом [(SC(NH2)2)2Fe(NO)2]⁺ при различных значениях pH.

Теоретическая и практическая значимость. Запатентован способ получения водорастворимых катионных ДНКЖ: прямое нитрозилирование сильнокислых растворов серосодержащих лигандов, которые в отличие от щелочных, применяющихся в синтезе анионных ДНКЖ, позволяют избежать образования Fe(ОН)3 в качестве побочного продукта реакции, что существенно увеличивает выход целевого продукта. Установлено, что все синтезированные моноядерные железо-серные динитрозильные комплексы являются более эффективными донорами оксида азота, чем диэтилентриамин – представитель высокоэффективных органических NO-генерирующих агентов, используемых в клинических исследованиях.

В ходе биологических испытаний обнаружено, что катионный ДНКЖ с N-этилтиомочевиной обладает высокой избирательной токсичностью по отношению к клеткам глиобластомы А-172. Эти клетки проявляют высокую чувствительность к нитрозильному комплексу: доза IC50 для клеток А-172 в 500-1500 раз ниже по сравнению с клетками других типов, включая нормальные клетки. Введение динитрозильных комплексов железа в полимерную матрицу поливинилпирролидона позволяет получить прототип стабильной лекарственной формы для соединений этого семейства, сохранив активность действующего вещества, что представляется особенно важным для использования данных комплексов в биомедицинских целях.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Методики синтеза новых катионных динитрозильных комплексов железа с тиомочевиной и ее производными.

2. Результаты рентгеноструктурных, физико-химических и биологических исследований всех синтезированных соединений.

3. Результаты амперометрического исследования и квантово-химического моделирования процесса генерации NO катионными ДНКЖ в водных растворах и влияние pH среды на данный процесс.

4. Способ получения полимерных композитов, содержащих ДНКЖ с производными тиомочевины, и результаты их физико-химического исследования.

Достоверность и апробация работы. Основные результаты работы были представлены на ученых советах отдела строения вещества ИПХФ РАН, на конкурсе молодых ученых ИПХФ РАН на соискание премии им. С.М. Батурина, а также в виде устных и стендовых докладов на российских и международных конференциях: III Всероссийской научной конференции (с международным участием) «Успехи синтеза и компексообразования» (РУДН, Москва, 21.04.14 – 25.04.14), VIII национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксида азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 25.05.14 – 29.05.14), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2015» (МГУ, Москва, 13.04.15 – 17.04.15), XI Международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии «МКХТ-2015» (РХТУ, Москва, 24.11.15-27.11.15), The 9^th International Conference on the Biology, Chemistry, and Therapeutic Applications of Nitric Oxide in conjunction with the 16^th Annual Scientific Meeting of the Nitric Oxide Society of Japan (Sendai, Japan, 20.05.16-22.05.16), VIII Национальной кристаллохимической конференции (Суздаль, 30.05.16-3.06.16), III Всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики» (Черноголовка, 3.07.16-7.07.16).

Работа «Катионные динитрозильные комплексы железа с тиомочевиной и ее производными – новые доноры NO» удостоена I премии на XVII конкурсе молодых ученых имени С. М. Батурина, ИПХФ РАН, Черноголовка, 2015.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 статей в реферируемых журналах, входящих в перечень ВАК и индексируемых Web of Science и Scopus, а также 2 заявки на изобретения и 8 тезисов докладов конференций.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 14-03-00272) и Фонда содействия развитию малых форм предприятия в научно-технической сфере (грант С1-05878).

Личный вклад автора. Все включенные в диссертацию результаты получены лично автором или при его непосредственном участии. Автором совместно с научным руководителем д.х.н. Саниной Н.А. обоснованы и поставлены задачи исследования и определены подходы к их решению. Разработка методик получения катионных динитрозильных комплексов с производными тиомочевины и полимерных композитов на их основе, идентификация ДНКЖ, выращивание монокристаллов, подготовка образцов для физико-химических и биологических опытов, получение расчетных ИК-спектров ДНКЖ квантово-химическим методом, исследование NO-донорной активности поликристаллических образцов и полимерных пленок на их основе с помощью амперометрии и обработка экспериментальных данных проведены лично автором. Анализ и интерпретация полученных результатов выполнены при непосредственном участии автора. Подготовка публикаций по теме диссертации проведена совместно с научным руководителем и соавторами.

Элементный анализ выполнен с.н.с, к.х.н. Колесниковой А.М. и ст. инж. Гусевой Г.В. в АЦКП (ИПХФ РАН). ИК-спектры зарегистрированы н.с., к.х.н. Баскаковой Ю.В. в АЦКП (ИПХФ РАН). Рентгеноструктурный анализ монокристаллов ДНКЖ проведен в.н.с., к.ф.-м.н. Шиловым Г.В. и с.н.с., к.х.н. Корчагиным Д.В. (ИПХФ РАН). Исследования образцов катионных ДНКЖ методом Мессбауэровской спектроскопии выполнены зав. лаб., к.ф.-м.н. Ованесяном Н.С. (ИПХФ РАН). ЭПР-спектры поликристаллических образцов и растворов комплексов получены зав. лаб., д.ф.-м.н., проф. Куликовым А.В. (ИПХФ РАН). Масс-спектры зарегистрированы с.н.с., к.ф.-м.н. Сулименковым И.В. (ИЭПХФ им. В.Л. Тальрозе РАН). Квантово-химическое моделирование процесса генерации NO катионными ДНКЖ выполнено совместно со с.н.с., к.х.н. Емельяновой Н.С. (ИПХФ РАН). Биологические исследования in vitro проведены м.н.с. Ступиной Т.С. (ИПХФ РАН). Изображения полимерных композитов, содержащих катионные ДНКЖ, методом растровой электронной микроскопии получены с.н.с., к.ф.-м.н. Дремовой Н.Н. в АЦКП (ИПХФ РАН). Исследования структур образцов полимерных пленок поливинилпирролидона методом рентгеновской дифракции под большими и малыми углами рассеяния выполнены рук. группы, к.ф.-м.н. Анохиным Д.В. (ИПХФ РАН). Автор выражает признательность всем сотрудникам лаборатории структурной химии ИПХФ РАН.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, экспериментальную часть, основные результаты исследования и их обсуждение, выводов, заключения, списка цитируемой литературы (154 ссылки). Диссертационная работа изложена на 158 страницах машинописного текста и включает 51 рисунок, 16 схем и 15 таблиц.

Железо-серные кластеры как мишени эндогенного NO

Оксид азота (NO), короткоживущий свободный радикал, известен с XVII века, когда был впервые получен из азотной кислоты [1, 2]. Однако всеобщее внимание исследователей данная молекула привлекла лишь в XX веке, когда начались активные исследования в области биологии оксида азота. В ходе изучения релаксации изолированных кровеносных сосудов Фарчготт (R. F. Furchgott) и Завадски (J. V. Zawadzki) обнаружили, что ацетилхолин, действуя на рецепторы эндотелиальных клеток, стимулирует высвобождение фактора диффузии, который был назван эндотелиальным фактором расслабления сосудов (EDRF, endothelium-derived relaxing factor) [3]. К началу 90-х годов свойства EDRF были достаточно хорошо изучены и удалось установить, что эндотелиальным фактором расслабления сосудов является молекула монооксида азота [4]. Идентификации NO как EDRF в значительной мере способствовали независимые исследования групп Монкады (S. Moncada) [5] Хиббса (J. Hibbs) [6, 7] Стаера (D. G. Stuehr) и Натана (C. F. Nathan) [8], Иширополоса (H. Ischiropoulos) [9]. Это открытие привело к взрыву в исследовании биологической роли NO в организме человека.

Многие физиологические функции оксида азота являются результатом его высокой реакционной способности, обусловленной присутствием на молекулярной орбитале неспаренного электрона, который позволяет NO прочно связываться с железом в белках [10]. Кроме этого, оксид азота способен легко диффундировать через клеточную мембрану, что имеет большое значение для передачи сигнала, информация о котором отражается с помощью изменений в локальной концентрации NO в тканях. Несмотря на то, что NO в высоких концентрациях ( 1 мкМ) способен оказывать потенциально токсическое воздействие на живой организм, к настоящему времени однозначно установлено, что цитотоксическая активность NO обусловлена образованием очень сильного окислителя пероксинитрита OONO, который вызвает повреждения ДНК [11].

Действие, которое NO оказывает в организме, можно разделить на три категории: регуляторное, защитное и патологическое. При низких концентрациях ( 150 нМ) NO способен регулировать проницаемость сосудов, сосудистый тонус, адгезию клеток, ингибирование тромбоцитов, контроль иммунной системы, нейротрансмиссию, метаболизм в печени, бронходилатацию, память и обучение, синаптическую адаптацию, почечную функцию, эрекцию. Защитное действие NO ( 150 нМ) проявляется в ингибировании лейкоцитов, снижении кровяного давления, противоопухолевой, антиоксидантной, антибактериальной и противомалярийной активности. Наряду с положительными эффектами в организме человека, NO в высоких концентрациях способствует развитию различных патологий, к которым можно отнести ингибирование митохондриального дыхания, перекисное окисление липидов, повреждение ДНК, ингибирование ферментов, уменьшение уровня антиоксидантов, септический шок, реперфузионное повреждение, повреждение миокарда, повышение восприимчивости к токсичности металлов, алкилированию, радиации [12, 13].

Благодаря исследованиям ученых на протяжении почти полувека, маленькая нестабильная молекула оксида азота из разряда высокотоксичных и опасных перешла в группу жизненно необходимых соединений в организме человека. И абсолютно неслучайно это открытие удостоилось самой престижной международной премии в мире. В 1998 году в Стокгольме лауреатами Нобелевской премии в области физиологии и медицины стали Р. Фарчготт, Л. Игнарро и Ф. Мурад за открытие оксида азота как сигнальной молекулы в сердечно-сосудистой системе [14]. Открытие способствовало разработке новых лекарственных препаратов для лечения целого ряда заболеваний (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, бронхиальная астма, эпилепсия, импотенция, сахарный диабет и т.д.).

Железо-серные (Fe-S) кластеры являются неотъемлемыми участниками трех жизненно важных процессов на Земле – фотосинтеза, дыхания и фиксации азота [15]. Fe-S белки – универсальный и функционально разнообразный класс металлопротеинов, который найден во многих живых организмах, начиная от бактерий до млекопитающих [16]. Уникальные особенности этих кофакторов обуславливают способность Fe-S кластеров осуществлять электронный транспорт, катализировать ферментативные реакции и действовать как регуляторные белки (Рис. 1). Fe-S белки имеет широкий диапазон окислительно-восстановительного потенциала, от -700 мВ до 400 мВ [17], и являются одними из важнейших переносчиков электронов в природе и неотъемлемыми участниками в цепочках дыхания и фотосинтеза. Группы Fe-S кластеров функционируют как линейные серии окислительно-восстановительных центров или резервуаров электронов [18, 19]. Более 12-ти различных Fe-S кластеров найдено в митохондриальной электрон-транспортной цепи, например, в хлоропластах они необходимы для работы фотосистемы I, ферредоксина и цитохром-b6f-комплекса [20].

Основной архитектурный элемент Fe-S кластеров – [2Fe-2S] ромб, образованный двумя тетраэдрически координированными атомами железа с двумя мостиковыми сульфидами, а комплексы, содержащие до восьми атомов Fe, могут быть рассмотрены как конструкции из базовых [2Fe-2S] блоков (Рис. 1а). Кубановый тип [4Fe-4S] кластеров может собираться из двух [2Fe-2S] блоков, тогда как [3Fe-4S] и [8Fe-7S] строятся из [4Fe-4S] фрагментов, соответственно с учетом потери одного атома Fe и объединения кластеров [21]. Наиболее распространенными Fe-S белками являются [2Fe-2S] и [4Fe-4S] кластеры. Большое число Fe-S кластеров найдено в активных центрах нитрогеназы (FeMo-кофактор и P-кластеры) и CO-дегидрогеназы (A- и C-кластеры) (Рис. 1а). Эти кластеры можно рассматривать как пример использования базовых строительных блоков [2Fe-2S] in vivo. Комбинация химически реакционноспособных атомов Fe и S, в сочетании с разнообразным составом кластеров, окислительным и спиновым состоянием, а также с локальным белковым окружением, делает Fe-S кластеры задействованными во многих биологических процессах [15].

Физико-химические методы исследования

Анионные {Fe(NO)2}9 ДНКЖ могут быть идентифицированы с помощью характеристического изотропного ЭПР сигнала с g=2.03 при комнатной температуре и/или ромбического сигнала при более низких температурах (Таблица 2). Другим полезным методом, используемым для подтверждения образования анионных {Fe(NO)2}9 ДНКЖ, является инфракрасная (ИК) спектроскопия, в спектрах которых обычно присутствуют две полосы поглощения валентных колебаний NO между 1670 и 1790 см-1, отстающие друг от друга на 55 см-1. Лиав и др. [83] обратили внимание на то, что разница между NO зависит от природы лигандов, координированных к железному центру. Для анионных ДНКЖ с двумя серосодержащими лигандами [S-S] разница NO составляет 45 см-1 (Таблица 2, соединения 4-19), для [N-N] лигандов NO 62 см-1 (Таблица 2, соединения 21-30), а для [O-O] лигандов NO 70 см-1 (Таблица 2, соединения 31-34). Значительное число моноядерных {Fe(NO)2}9 ДНКЖ охарактеризовано методом РСА. Во всех случаях окружение атома железа имеет искаженную тетраэдрическую геометрию с двумя слегка изогнутыми FeNO фрагментами. Среднее значение углов Fe-N-O составляет 165 и в каждом отдельно взятом комплексе эти углы отличаются незначительно (0.1-10) вместе с длинами связей N-O и Fe-N(O), для которых интервал значений длин связей равен 1.144-1.199 и 1.642-1.721 , соответственно (Таблица 2).

Изначально изучением электронных структур {Fe(NO)2}9 ДНКЖ занимались Брайар (Bryar) и Итон (Eaton) [84], основываясь на данных РСА, ЭПР и ИК-спектроскопии, такие соединения как [I2Fe(NO)2] (1) и [(SPh)2Fe(NO)2] (7) были описаны как {Fe-1(NO+)2}9 комплексы. Более чем десятилетие спустя Лиав с коллегами [28] выдвинул альтернативное предположение для серосодержащих {Fe(NO)2}9 ДНКЖ, [S5Fe(NO)2] (16), в которых FeI (SFe=3/2) антиферромагнитно связано с двумя NO группами (SNO=1/2) [85]. Это предположение основано на данных, полученных для комплекса 16 с помощью спектроскопии рентгеновского поглощения K-края кислорода и K-/L-края железа в сочетании с исследованиями магнитной восприимчивости, ЭПР-спектроскопии и DFT расчетов. Описание электронной структуры анионных {Fe(NO)2}9 ДНКЖ, в том числе [(SPh)2Fe(NO)2] (7), [S5Fe(NO)2] (16), [Se5Fe(NO)2] (20), как {FeI(NO)2}9 в дальнейшем подтвердили Дай (Dai) и Ке (Ke) [85] с помощью координатного анализа нормальных колебаний, связывающего спектроскопию комбинационного рассеяния и DFT расчеты. Позднее Лиав и др. [77] расширили исследования спектроскопии рентгеновского поглощения и расчеты этих авторов, чтобы включить различные ДНКЖ c S-, N- и O-донорными лигандами. Они предложили резонансный гибрид {FeI(NO)2}9, {FeII(NO)(NO)}9 и {FeIII(NO)2}9 как основную электронную структуру анионных ДНКЖ, где число {FeIII(NO)2}9 резонансных форм в кислородсодержащих ДНКЖ выше, чем в железо-серных динитрозильных комплексах (например, [(OPh)2Fe(NO)2] (34) относительно [(SPh)2Fe(NO)2] (7)) [77].

Йе (Ye) и Ниc (Neese) [86] описали электронные структуры анионного {Fe(NO)2}10 ДНКЖ [(Ar-nacnac)Fe(NO)2] (35) и его окисленной формы [(Ar-nacnac)Fe(NO)2] (40). Соединения 35 и 40 являются структурными аналогами, которые впервые синтезировал и охарактеризовал Липпард (Lippard) с коллегами [87, 88]. Интересно, что комплексы 35 и 40 имеют схожие структурные данные (Таблица 2) и параметры ЯГР-спектроскопии (=0.22 мм/с и EQ=1.31 мм/с для 35; =0.19 мм/с и EQ=0.79 мм/с для 40) [88]. Детальные DFT исследования (функционал TPSSh) Йе и Ниса [86] подтверждают, что 40 лучше всего описывается как комплекс c высокоспиновым состоянием атома железа (II) (SFe=2), антиферромагнитно спаренного с двумя триплетными NO лигандами (S(NO)2=2), тогда как соединение 35 логически правильно представить как резонансный гибрид, состоящий из железа (III) (SFe=5/2), антиферромагнитно спаренного с двумя NO лигандами (S(NO)2=2), и железа (II) (SFe=2), спаренного с квартетным (NO)2 лигандом (S(NO)2=3/2) антиферромагнитным способом.

В качестве химических свойств ДНКЖ, в литературе, в основном, рассматриваются реакции лигандного замещения в комплексах или генерация NO соединениями данного типа. Способность ДНКЖ к лигандному замещению приведена выше, как альтернативный способ получения новых комплексов, поэтому более подробно рассмотрим NO донорную активность различных ДНКЖ

Впервые Лиав с коллегами смоделировали процесс распада и сборки [2Fe-2S] кластера. В качестве биомиметика железо-серного ферредоксина они использовали биядерный комплекс -S типа с (S5)2" лигандами, [S5Fein(-S)2FeinS5]2, в результате нитрозилирования которого образовывался динитрозильный комплекс железа, [S5Fe(NO)2] (16) (Схема 3). Дальнейшие исследования показали, что в присутствии акцептора NO, [(ТГФ)Fe(S,S-C6H4)2] , и облучения светом ДНКЖ 16 генерирует оксид азота, и происходит регенерация комплекса [S5Fein(-S)2FeinS5]2- (Схема 3). Данное исследование проливает свет на принцип действия ДНКЖ в живых системах как донора NO и непосредственного участника в восстановлении [2Fe-2S] ферредоксинов. Интересно, что повторное образование биомиметика железо-серного кластера происходит только с участием акцептора NO, в случае его отсутствия фотолиз приводит к образованию нерастворимого желтого осадка [28].

Амперометрическое определение NO-донорной активности

Химический анализ полученных в работе комплексов на содержания С, Н, N, S проводили по методике [123] на CHNS/O элементном анализатор «Vario Micro cube» Elementar GmbH (Германия, 2007 г.) АЦКП ИПХФ РАН методом сжигания проб при 1150С в присутствии чистого кислорода с последующим восстановлением оксидов и разделением на хроматографической колонке. Определение элементов осуществляли на основе содержания в продуктах сгорания СО2, N2, Н20, S02. Регистрацию сигнала каждого оксида проводили на детекторе теплопроводности, а определение кислорода - методом пиролиза с последующим определением СО. Содержание в образцах металла Fe определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии на спектрофотометре AAS-3 (Германия 1988 г.).

Исследование образцов полимерных пленок, содержащих комплексы I, IV, V, VIII проводили на растровом электронном автоэмиссионном микроскопе (РЭМ) нового поколения «Supra 25» производства Zeiss с катодом Шоттки и детектором in-lens для сбора вторичных электронов от объекта исследования. Кроме визуализации с помощью РЭМ исследовали элементный состав образцов полимерных композитов. С этой целью использовалась приставка к РЭМ -анализатор рентгеновский энергодисперсионный «INCA OXFORD INS». Диапазон определяемых элементов начинался с бора.

Инфракрасные спектры полученных в работе комплексов и исходных соединений в виде поликристаллических образцов регистрировали на инфракрасном Фурье-спектрометре Perkin-Elmer Spectrum 100 (США, 2006 г.) в диапазоне частот 675—4000 см-1 в режиме нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО). Отнесение полученных полос поглощения проводили на основании литературных данных [124].

Спектры поглощения регистрировали на стандартной установке WissEl, работающей в режиме постоянного ускорения. Источником служил 57Co в матрице Rh. Измерения образцов при низких температурах проводили с помощью проточного гелиевого криостата CF-506 (Oxford Instruments) с регулируемой температурой. Обработку мессбауэровских спектров проводили методом наименьших квадратов в предположении лоренцовой формы составных линий поглощения.

ЭПР спектры поликристаллических образцов и растворов динитрозильных комплексов железа регистрировали на ELEXSYS-II E500 радиоспектрометре («Bruker») при комнатной температуре. Число спинов на парамагнитном центре определяли с точностью до 15% с помощью пакета программного обеспечения Xepr («Bruker»), предполагая, что спин равен . Спектры ЭПР исследуемых полимерных пленок, содержащих парамагнитные комплексы I, IV, V, VIII регистрировали при комнатной температуре на радиоспектрометре «SE/X 2544» («Radiopan», Польша) при 20 дБ, что соответствует мощности сверхвысокочастотного изучения 1 мВт. Число спинов в образцах определяли сравнением вторых интегралов спектров ЭПР исследуемых образцов и стандартов. В качестве стандартов использовали порошок CuSO45H2O или раствор стабильного нитроксильного радикала в EtOH. Фрагменты пленок (40-60 мг) помещали в ампулы диаметром 5 мм, растворы пленок в ДМСО (1-3 ммоль/л) – в ампулы диаметром 1 мм. При определении числа спинов (N/спинов(комплекс)-1) полагали, что весовая доля комплекса в пленке – 10 мас.%. 2.4.7 Масс-спектрометрия

Электроспрей масс-спектры регистрировали на масс-спектрометре Exactive Orbitrap (ThermoFisher Scientific, Германия). Ионизацию растворов H2O и ТГФ распылением в электрическом поле и сбор данных проводили в режиме регистрации положительных ионов. Настройку интерфейса ионной оптики осуществляли с целью минимизировать первоначальную фрагментацию ионов. Сбор и анализ данных выполняли с помощью Exactive Software Version 1.1.

Концентрацию NO, генерируемого катионными комплексами железа и композитами поливинилпирролидона с комплексами I, IV, V, VIII в растворах, измеряли с помощью сенсорного электрода amiNO-700 системы «inNO Nitric Oxide Measuring System» (США). Концентрацию NO фиксировали в течение 500 с (с шагом 0.2 с) в растворе NO-донора. Для калибровки электрода использовали стандартный водный раствор NaNO2 (100 мкM), который добавляли в смесь, состоящую из 20 мг KI («Aldrich»), 2 мл 1 M раствора H2SO4 (Х.Ч., Химмед) и 18 мл воды. Рабочие растворы комплексов готовили в водном растворе с применением фосфатных буферов с рН=7.0, pH=8.0 (HydrionTM, «Aldrich») и трис-НCl буферов с pH=7.4, pH=9.0, приготовленных из 0.2 М трис(оксиметил)-аминометана и 0.1 N HCl по методике [125]. pH растворов измеряли с помощью мембранного pH-метра «HI 8314» (HANNA instruments, Германия). Для сравнения NO-донорной способности исходных комплексов I, IV, V, VIII и комплексов в матрице поливинилпирролидона навеску кристаллов и полимерных композитов растяоряли в 5 мл метанола, отбирали 0.5 мл раствора и вводили в электрохимическую ячейку, содержащую 49.5 мл фосфатного буферного раствора. Все эксперименты проводились в термостатируемой ячейке при температуре 25С и интенсивном перемешивании.

ЭПР-спектроскопия катионных динитрозильных комплексов железа

Параметры 57Fe Мессбауэровского спектра поликристаллов комплексов I-VIII при комнатной температуре представлены в Таблице 5. Мессбауэровский спектр комплексов III и IV, содержащих по два динитрозильных катиона в структуре, представляет собой одиночный дублет, что указывает на структурную эквивалентность двух атомов железа в каждом ДНКЖ (Рис. 27). Спектр ЯГР комплекса V представляет собой двойной симметричный квадрупольный дублет с параметрами Fe = 0.219(1), EQ = 1.08(2), = 0.250(1) мм/с для катионной части комплекса V и Fe = 0.115(1), EQ = 1.33(1), = 0.230(1) мм/с для анионной части [Fe2(-S2O3)2(NO)4] (Рис. 27). Эти параметры близки к таковым для серии ранее изученных биядерных тиосульфатных комплексов [131]. Отношение интенсивностей спектральных компонентов составляет 1:1, что находится в соответствии с данными РСА. Близкие значения изомерных сдвигов для ДНКЖ с тиомочевиной I-V указывают на практически одинаковые длины связей Fe-S и Fe N, которые фактически не зависят от типа противоиона. Для катионного фрагмента [Fe(SC(NH2)2)2(NO)2]+ c помощью гибридного функционала TPSSh были расчитаны параметры Мессбаэровского спектра, Fe = 0.217 и EQ = 1.029, которые находятся в хорошем соответствии с экспериментальными значениями. К сожалению, предлагаемыми в данной работе синтетическими методами не удалось получить чистый образец ДНКЖ VI с N,N/-диметилтиомочевиной, который помимо монокристаллов, используемых для РСА и ИК-спектроскопии, содержит неустановленную аморфную примесь. Параметры мессбауэровских спектров при T = 85K для катионных ДНКЖ с алифатическими производными тиомочевины VII и VIII оказались близки между собой. Так для комплекса VII – Fe = 0.280(2) мм/с, EQ = 1.069(3) мм/с; для VIII – Fe(1) = 0.308(1) мм/с, EQ(1) = 1.031(3) мм/с в нейтральном динитрозильном фрагменте и Fe(2) = 0.326(1) мм/с, EQ(1) = 1.230(3) в катионе. Спектр ЯГР поликристаллов комплекса VIII c N этилтиомочевиной представляет собой одиночный несимметричный квадрупольный дублет. Так как по данным РСА VIII содержит в своем составе два железо-динитрозильных фрагмента, экспериментальный спектр аппроксимирован двумя симметричными дублетами с фиксированным соотношением интенсивностей 1:1. Замещение атома серы в координационной сфере комплекса VIII на более электроотрицательный атом хлора приводит к небольшому уменьшению изомерного сдвига, что согласуется с уменьшением расстояния Fe-Cl по сравнению с Fe-S на 0.03 . Параметры 57Fe Мессбауэровского спектра VIII близки к таковым для катионных ДНКЖ с незамещенной тиомочевиной, с учетом того, что в Таблице 5 для I-VII экспериментальные данные приведены при комнатной температуре.

Значения изомерного сдвига Fe и квадрупольного расщепления EQ для катионных ДНКЖ с тиомочевиной и ее производными близки к таковым для нейтрального ДНКЖ с 1,2,4-триазол-З-тиолилом [66] и существенно отличаются от параметров ЯГР спектра анионного ДНКЖ состава [N(C2H5)4][Fe(SPh)2(NO)2] [56]. Значения для катионных ДНКЖ почти вдвое выше, чем для анионных, что свидетельствует об уменьшении зарядовой плотности на атоме железа и согласуется с увеличением длины связи Fe-S (2.328 ). Для сравнения в нейтральных моноядерных комплексах (Таблица 5) средняя длина связи Fe-S составляет величину 2.308 , а в [N(C2H5)4][Fe(SC6H5)2(NO)2] - 2.280 А.

Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) широко используется для исследования нитрозильных комплексов железа. Свободная молекула оксида азота (II) в замороженных растворах дает ЭПР сигнал с g 1.95, детектируемый при очень низких температурах ( 20 К) и высоких концентрациях NO [35]. Для парамагнитных ДНКЖ, впервые найденных в дрожжах, а затем в тканях животных и человека, характерен ЭПР спектр с изотропным g-фактором 2.03 [53]. При комнатной температуре для высокомолекулярных (протеин-связанных) ДНКЖ наблюдается аксиальная симметрия тензора g-фактора со значениями g±=2.04 и gn=2.014, в случае ДНКЖ с низкомолекулярными лигандами - ромбический сигнал ЭПР из-за высокой подвижности малых молекул. Значения g-факторов ДНКЖ слабо зависят от природы лиганда, а форма спектров ЭПР для каждого из комплексов практически не отличается друг от друга, таким образом, ЭПР-сигнал с g 2.03 можно рассматривать как «отпечатки пальцев» для соединений этого класса [35].