Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 11
1.1. Структура растительных полисахаридов - пектиновых веществ. 11
1.2. Способы фракционирования полимеров 19
1.2.1. Метод дробного осао/сдении 24
1.2.2 метод дробного растворения 26
1.2.3. Турбидиметрическое титрование 28
1.3. Молекулярная масса и молекулярно-массовое распределение пектиновых макромолекул 31
1.4. Химическая неоднородность пектиновых макромолекул 36
1.5. Конформация пектиновых макромолекул 39
Глава 2. Методика экспериментальных исследований 444
2.1. Сбор и подготовка исходного сырья 44
2.2. Характеристика реагентов и рабочих растворов 44
2.3. Гидролиз-экстракция протопектина 45
2.4.Фракционирование пв методом дробного растворения 45
2.5.Турбидиметрическое титрование 455
2.6. Количественные методы анализа функциональных групп пектиновых веществ 47
2.6.1. Определение свободных карбоксильных групп 47
2.6.2. Определение этирифицированных карбоксильных групп 47
2.7. Метод определения уронидных составляющих пектиновых веществ 48
2.8. Газожидкостная хроматография 49
2.9. Определение характеристической вязкости 50
2.10. Эксклюзионной жидкостной хроматографии (эжх) 51
2.11. Определение степени набухания пектиновых веществ в воде 51
2.12. Количественное определение содержания кальция в пектине 52
Глава 3. Результаты и их обсуждение 54
3.1. Молекулярная и структурная полидисперсность пектиновых веществ 54
3.2. Структурная неоднородность пектиновых веществ 61
3.3. Молекулярные и конформанионные характеристики пектиновых веществ 74
Выводы 85
Литература 88
- Способы фракционирования полимеров
- Молекулярная масса и молекулярно-массовое распределение пектиновых макромолекул
- Количественные методы анализа функциональных групп пектиновых веществ
- Молекулярные и конформанионные характеристики пектиновых веществ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из основных параметров пектиновых полисахаридов, благодаря которому они приобретают гелеобразующие свойства, является молекулярная масса (ММ) или эквивалентная ей величина характеристической вязкости ([п]). В литературе имеются многочисленные уравнения, связывающие величину [п] с ММ. Однако, данные различных авторов, полученные для пектинов, из одних и тех же источников, не всегда соответствуют друг другу. Одной из основных причин такого поведения пектиновых веществ (ПВ) является, по-видимому, их композиционная неоднородность. В связи с этим изучение химической и молекулярной неоднородности ПВ, полученных из различных источников растительного сырья, путем разделения их на более узкие фракции и распределение моносахарид-ного состава и ММ соответствующих полимеров, может дать ценную информацию о структуре протопектина и способах связывания полимерных цепей при формировании относительно устойчивых агрегатов, а также о природе межмолекулярных связей, стабилизирующих сетчатые структуры. С другой стороны, результаты этих фундаментальных исследований могут быть использованы при разработке новых способов получения ПВ, приводящих к формированию привитых и линейных полимерных цепей с заданным моно-сахаридным составом и однородной молекулярной структурой, как следствие модификации отдельной стадии технологического процесса гидролиза растительного сырья или при выделении ПВ из раствора гидролизата. Наконец, эти исследования позволяют адаптировать технологии получения ПВ для их использования в различных отраслях производства, в частности в пищевой или фармацевтической промышленности. В связи с этим изучение взаимосвязи химической структуры, характеристической вязкости и молекулярной массы фракций ПВ, полученных из различных источников растительного сырья, не только способствует получению уравнения, связывающего величины [л] с ММ, но и является актуальной задачей в проблеме разработки способа получения ПВ с заданными структурными и молекулярными характеристиками.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является изучение структурной и молекулярной неоднородности ПВ, полученных из различных источников растительного сырья. В связи с поставленной целью задачами настоящего исследования были:
фракционирование ПВ, полученных из различных источников растительного сырья, методами дробного осаждения и дробного растворения;
изучение моносахаридного состава фракций ПВ, полученных из различных источников растительного сырья.
изучение свойств разбавленных растворов ПВ, оценка численных значений характеристической вязкости и молекулярной массы для фракций пектинов различной природы, использование полученных данных для составления уравнений взаимосвязи [п] с ММ;
Работа проводилась в соответствии с планом НИР Института химии им. В.И. Никитина АН Республики Таджикистан «Поиск и создание новых полимерных материалов и биологически активных веществ на базе продуктов синтетического и растительного сырья» (ГР №0106ТД414 от 16 марта 2006г.).
Научная новизна работы:
на примерах яблочного, цитрусового и подсолнечного пектинов впервые, методами турбодиметрического титрования и дробного растворения в водно-спиртовой среде, изучена закономерность одновременного разделения ПВ на фракции, отличающиеся по структурным и молекулярным параметрам.
показано, что с увеличением объемной доли спирта в системе все более выделяются фракции ПВ с меньшими ММ и обогащенные остатками нейтральных Сахаров, что дает возможность, особенно в начальных стадиях фракционирования, получить высококачественные ПВ с высокими содержанием звеньев галактуроновой кислоты (ГК), её степени этерификации (СЭ) и высокими значениями ММ.
Впервые, используя метод одновременного фракционирования по молекулярной массе и полисахаридному составу ПВ, получены фракции, близкие по химической структуре, но отличающиеся по ММ, что дало возможность измерением величин [п] и ММ, составить взаимосвязь между ними в рамках уравнений Марка-Куна-Хаувинга.
Полученные экспериментальные данные позволяют модифицировать технологию получения высококачественных ПВ из различных источников растительного сырья, для их использования в выбранной отрасли производства.
Практическая значимость работы. Разработанный способ фракционирования ПВ из раствора гидролизата является ключевой стадией при получении высокоочищенных ПВ с собственной биологической активностью или как природного ионногенного полимера, используемого для формирования различных видов микро- и нанокапсул как носителей лекарственных средств в фармацевтической отрасли производства.
Полученные физико-химические закономерности могут являться основой при характеристике композиционной неоднородности ПВ, полученных из различных источников растительного сырья.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статьи в реферируемых научных журналах и 4 материала конференций.
Апробация работы. Основные результаты докладывались и обсуждались на Международной конференции «Современная химическая наука и её прикладные аспекты». (Душанбе, 2006г.), на республиканской научно-практической конференции «Нынешняя ситуация, проблема, перспектива защиты и рациональное использование природных ресурсов Таджикистана». (Душанбе, 2008г.), Международной конференции «Наноструктуры в полисахаридах: формирование, структура, свойства,
применение». (Ташкент, 2008г) и VI Нумановских чтениях. (Душанбе, 2009г.)
Объем и структура работы. Диссертация представляет собой рукопись объемом 98 страниц, состоит из введения и 3 глав, посвященных обзору литературы, экспериментальной части, результатам исследований и их обсуждению, выводов. Иллюстрирована 19 рисунками, 14 таблицами и одной схемой. Список использованной литературы включает 117 наименований.
Во введении обосновывается актуальность темы, изложены цель и научная новизна диссертации, практическая ценность и ее структура.
В литературном обзоре (глава 1) изложены основные сведения, имеющиеся в первоисточниках о первичной структуре ПВ, об их функциональной особенности в составе клеточной стенки высших цветковых растений, их роли в определении прочности и растяжимости клеточных стенок, тургоре, устойчивости растения к засухе и к низким температурам, обеспечении водно-солевого обмена. Подробно приводится обзор методов фракционирования полимеров по молекулярным массам, на примерах целлюлозы и агарозы. Особое внимание уделяется оценке молекулярной массы и молекулярно-массового распределения (ММР) полисахаридов по данным фракционирования. Отдельный раздел обзора посвящен изучению химической неоднородности пектиновых веществ, изменению моносахаридного состава фракций, их влияние на конформацию ПВ в растворе. В литературном обзоре также приводятся сведения относительно вторичной, третичной и четвертичной структуры пектиновых веществ. Эти данные являются важными для понимания механизма гелеобразования ПВ, контроля и манипулирования механическими свойствами посредством рационального изменения точной молекулярной структуры. На основании анализа обширных литературных данных, автором сделан вывод о том, что конформационное изменение пектиновых макромолекул в основном зависит от включения в их цепи остатков рамнозы и степени этерификации карбоксильных групп.
В экспериментальной части (глава 2) приведена характеристика исходных растительных материалов, реагентов и рабочих растворов, методика проведения кислотного гидролиза и методика фракционирования ПВ по ММ при дробном растворении и турбидиметрическом титровании. Приводятся также методики количественного анализа функциональных групп ПВ, ионов кальция и определение содержания нейтральных Сахаров методом газожидкостной хроматографии. Даны методики измерения характеристической вязкости разбавленных растворов ПВ и особенности определения ММ и ММР методом эксклюзионной жидкостной хроматографии (ЭЖХ).
В главе 3 «Результаты и их обсуждение», приводятся экспериментальные данные, полученные автором при фракционировании ПВ методом дробного растворения, результаты количественных анализов остатков галактуроновой кислоты и степени ее этерификации, значения характеристической вязкости и ММ выделенных фракций. На основании обширных экспериментальных данных дана интерпретация полученных результатов в соответствии с целью и задачами исследований.
Способы фракционирования полимеров
В последние годы исключительное внимание уделяется проблеме узнавания клетками различных веществ внешней среды, взаимного узнавания клеток (например, в многоклеточных организмах), а также проблеме взаимодействия клеток и вирусов (в том числе онкогенных). Во всех этих случаях в клеточных оболочках находили полисахариды, гликопротеины или липополисахариды, олигосахаридные звенья которых выступают во внешнюю среду и играют роль локаторов.
Функции полисахаридов исключительно разнообразны. Давно известны их опорные и резервные функции. Так, целлюлоза, хитин, пектин, крахмал являются как бы скелетом высших растений [1]. Полисахариды - это природные полимеры, звенья которых содержат функциональные группы, способные к электролитической диссоциации. В зависимости от источника получения эти полимеры относятся к полиэлектролитам растительного, животного и синтетического происхождения. Свойства полисахаридных полиэлектролитов, согласно Беттенейму [2], в некоторой степени, зависят от источника их происхождения. Так, например полисахариды растительного происхождения благодаря своей жесткой конформации выполняют роль структурирующего вещества. Как правило, после выделения из природных источников эти полимеры в растворе изменяют свою конформацию, хотя, как показал Рисе [3], при определенных условиях становится возможной реализация нативной конформации полисахаридов. Полисахариды животного происхождения, с одной сторон, выполняют роль гидратирующего полимера внутри живой ткани [4], а с другой — обеспечивают смазку между соединениями ткани [5]. Полисахариды могут быть сильными и слабыми электролитами, могут содержать кислотные и основные группы [6]. В данном разделе рассмотрена структура полисахаридов, к числу которых относятся и пектиновые вещества, содержащие в основном карбоксильные группы. Главным компонентом пектиновых веществ является полигалактуроновая кислота, состоящая, в основном, из звеньев a-D-галактуроновой кислоты в пиранозной форме, соединенных связями 1 -»4 [7-10]. Карбоксильные группы остатков галактуроновой кислоты часто существуют в виде метиловых эфиров (встречаются как низкометилированные, так и высокометилированные пектины со степенью этерификации выше 50%), а гидроксилы при С-2 и С-3 могут быть ацетилированы. Остатки L-рамнозы обычно образуют единичные включения в главную цепь, но изредка бывают соединены друг с другом; для ряда пектинов с высоким содержанием рамнозы доказано строгое чередование остатков a-D-галактуроновой кислоты и a -L-рамнопиранозы в главной цепи. В положении 4 остатков рамнозы, а иногда и в др. положениях главной цепи, могут присоединяться более или менее сложные боковые цепи, построенные из остатков D-галактозы, L-арабинозы, реже D-ксилозы, D-глюкуроновой кислоты, L-фуктозы. Содержание этих дополнительных моносахаридов колеблется в широких пределах (от 0 до 50%). Небольшая часть гидроксильных групп молекул некоторых пектинов может быть этерифицирована феруловой кислотой (4-HO)(S-GHiO)G6H3GH=GHCOO№ [11-12]; Пектиновые вещества представляют собой многоплановое семейство сложных растительных полисахаридов, которые составляют функционально важную часть первичных клеточных стенок. В настоящее время достигнуты очень большие и принципиально важные успехи, особенно в выяснении основных черт химического строения, физико-химических свойств и биологической активности. Но еще многие вопросы предстоит решить для того, чтобы осознанно и целенаправленно использовать этот обширный класс природных соединений для лечения различных заболеваний и для увеличения продолжительности активной жизни человека [11]. Пектины выполняют важные биологические функции в растениях [13]. Они являются регуляторами ионного и водного обмена, участвуют в структурообразовании клеточных стенок растений, способствуют прорастанию семян и росту проростков, обеспечивают тургор растений и т.д. В процессе созревания плодов наблюдаются солюбилизация пектиновых полисахаридов и выделение этилена, обусловленные действием г полигалактуроназы, и способствующие созреванию плодов. Пектиновые вещества [13-14] содержатся во всех высших цветковых растениях, они входят в состав клеточных стенок и, вместе с другими компонентами, определяют прочность и растяжимость клеточных стенок, тургор, устойчивость растения к засухе и к низким температурам, обеспечивают водно-солевой обмен, характеризуются высокой гелеобразующей способностью, играют важную роль в питании человека как компоненты «пищевых волокон», обладают широким спектром физиологической активности. Структура пектиновых веществ зависит от многих параметров и может существенно изменяться в процессе роста и развития растения. Неудивительно, что пектиновые полисахариды рассматривают как один из самых сложных и динамических по структуре классов биополимеров. Для установления строения пектиновых полисахаридов широко используются все известные классические и современные методы структурного исследования полисахаридов. Для определения первичной структуры применяют полный и частичный кислотный гидролиз, ферментативное расщепление, периодатное окисление (распад по Смиту), метод метилирования, все виды спектроскопии ЯМР (одно- и двумерной) и ряд других методов. Для определения расположения углеводных цепей в пространстве в последние годы применяют атомно-силовую микроскопию [15-16].
Молекулярная масса и молекулярно-массовое распределение пектиновых макромолекул
Поскольку растворимость полимеров одного полимергомологического ряда зависит от молекулярного веса, то казалось бы не должно быть принципиальной разницы между методом дробного осаждения и методом дробного растворения. Однако первоначальные исследования [53] показали, что выделение низкомолекулярных фракций из твердого полимера наталкиваются на методические трудности. Требуется довольно длительный контакт между растворителем и полимером, чтобы в системе устанавилось равновесие, а не происходило только растворение более доступных, верхних слоев полимера. Последующие более тщательно проведенные работы показали, что дробное растворение дает такие же результаты, как и дробное осаждение, и имеет некоторые преимущества, так как позволяет разделить на любое число фракций очень малые количества полимера и процесс можно легко автоматизировать.
В работе [54] большой успех был достигнут, когда к разделению полимеров был применен принцип сочетания равновесного растворения с одновременной дробной экстракцией и десорбцией из тонких слоев полимера, нанесенных на инертные или активные поверхности.
Авторы [55] рекомендуют не дожидаться установления равновесия при дробном растворении, а для разделения использовать различие в скоростях диффузии между большими и малыми молекулами.
Для этого образец полимера помещается на определенное время в растворитель данного состава, а затем последовательно переносится в другие растворители с большей растворяющей способностью. Соответствующие фракции с последовательно повышающей молекулярной массой выделяются путем испарения экстрактов под вакуумом.
В работе [56] предложена следующая методика дробного растворения (экстракции) из тонких пленок, нанесенных на инертные поверхности. Алюминиевую фольгу , общей поверхностью 600-1000 см2, разрезанную на мелкие кусочки, погружают в 10%-ный раствор полимера, затем раствор сливают, дают стечь избытку раствора и испариться растворителю, вследствие чего на поверхности фольги остается тонкий слой полимера, фольгу помещают в экстрактор и заливают смесью осадитель -растворитель (по 100мл). Равновесие обычно устанавливается за 5-10 мин. Раствор сливают, и сосуд заливают очередной порцией растворителя с большей растворяющей способностью. Вся операция может быть закончена в течение одного дня.
Ученые [57] для разделения агара также применили метод дробной экстракции водой с последовательным повышением температуры в пределах 25-90С. Полученные фракции отличались по характеристической вязкости и по содержанию сульфоэфирных групп и катионов.
Авторами [58] для определения химической неоднородности макромолекул проведено предварительное фракционирование путем последовательного растворения НМ пектина смесью растворителя (вода) и осадителя (изопропиловый спирт) для данной системы. Характеристики фракций НМ-пектина, полученных последовательным растворением смесью изопропанол — вода, приведена в табл. 1.2. Авторами определено, что растворимость пектиновых полисахаридов зависит как от молекулярной массы полимера, так и от степени этерификации карбоксильных групп.
Содержание галактуроновой кислоты намного больше в третьей фракции пектина однако, количество этой фракции меньше, чем двух предыдущих фракциях.
Большое распространение для определения полидисперсности полимеров получил метод турбидиметрического титрования. Сущность метода заключается в том, что при добавлении осадителя к разбавленному раствору полимера из него выделяются фракции с постепенно уменьшающейся молекулярной массой. При надлежащем выборе условий титрования возрастание мутности и соответственно оптической плотности среды пропорционально количеству выделенного из раствора полимера [59].
Турбидиметрическое титрование является быстрым и удобным методом для получения сравнительной картины распределения по молекулярной массе, если данный полимер достаточно изучен. Однако при переходе к изучению нового полимера каждый раз необходимо проводить весьма сложную процедуру «калибровки» полученной кривой осаждения по узким фракциям полимера с известной молекулярной массой. При этом предложенные методы такой «калибровки» не являются безупречными [41].
В работе [60] предложено так называемое «уравнение осаждения», связывающее порог осаждения гомогенного полимера с его концентрацией и молекулярной массой (при постоянной температуре). Под порогом осаждения понимают количество осадителя, необходимое для начала осаждения.
Для полимера экспериментально было установлено; где,Р"-порог осаждения, т. е. критический объем осадителя; с-концентрация полимера в точке осаждения; К- константа; /(MJ,-некая функция молекулярной масса .
Значение f(MjJ для данной молекулярной масса (MJ можно установить, исследуя осаждение фракции полимера с известной молекулярной массой. Для этого строят график зависимости logc то V. Наклон прямой дает значение К, а отрезок на оси V при с=0 соответствует значению f(My). На основании исследования осаждения нескольких фракций находят значение f(Mx) для широкого диапазона молекулярных весов.
Количественные методы анализа функциональных групп пектиновых веществ
Характеристика вторичной, третичной и четвертичной структуры пектиновых веществ является предпосылкой для понимания механизма их гелеобразования, контроля и манипулирования механических свойств, через рациональное изменение точной молекулярной структуры. Из-за высокого уровня нерегулярности структуры, невозможно охарактеризовать молекулярную особенность пектинов в твердом состоянии, в виде геля или в растворе, по сравнению с другими полисахаридами. [87].
Метод молекулярного моделирования один из способов, который может быть использован для обеспечения новых экспериментальных данных и дает больше информации о пектиновых макромолекулах. Например, исследования с низкомолекулярных производных пектинов показали возможность существования спиральной структуры гомогалактуронана [88]. В согласии с данным дифракции рентгеновских лучей [89] было доказано, что в пектинах могут встречаться как двойные так право- и лево-вращающиеся скрученные спиральные структуры. Также было доказано, что метоксильные группы, в. спирали не оказывают значительное влияние на конформационное поведение полисахарида в данном состоянии [88].
Несмотря на то, что конформационное состояние «гладкой» области ПВ кажется хорошо охарактеризованной, описание конформации пектиновой цепи при включении рамнозильных остатков в рамногалактуронане остается все еще загадкой. Методом компьютерного моделирования было предположено, что, именно, присутствие одного рамнопиранозилного остатка, либо в а-, либо в Р- положении является причиной образования так называемого «узла» в цепи [90-91]. В результате эти «узлы» ограничивают размеры яичных коробок в пектиновом геле. Все же эта модель была широко использована для объяснения образования сетки в геле, несмотря на то, что в последствие обнаружили присутствие рамнозильных остатков в димерной последовательности с галактуроновой кислотой.
Авторы [88] представили характеристики макроскопических свойств пектиновых цепей в разбавленном растворе. Эксперименты были проведены на хорошо подготовленных образцах яблочного и цитрусового пектинов, с использованием методов вискозиметрии, малоуглового нейтронного светорассеяния (МУНС) и метода молекулярного моделирования (ММ).
В работе [92] для решения конформационных вопросов в качестве модели приняты дисахариды из (1— 4), связанные a-D-галактуроновой кислотой. Эта модель в дальнейшем была исследована методами молекулярной динамики и ЯМР-спектроскопии в вакууме и в водном растворе. Конформационный анализ обоими методами показал, что представленный дисахарид принимает одинаковые конформации, образованными внутримолекулярными водородными связями через Об В-Н6 ....03 и 02 В-Н2 ....06В. При экстраполяции данных к регулярной полимерной структуре, пектиновые цепи могут принять конформацию двойной спирали, вращающейся в правую сторону.
Методами молекулярной механики и Монте-Карло [93], были определены невозмущенные размеры поли- a-D-галактуроновой кислоты как функции её степени полимеризации и степени ионизации карбоксильных групп. Расширение цепи, оказывается, существенно зависит от локального перераспределения заряда на заряженных и незаряженных остатках галактуроновых кислот. Отмечено, что включение в цепь этерефицированных галактуроновых кислот приводит к возрастанию расширения цепи. Однако, по ведение остатков a (1— 2)-рамнозы являются причиной мгновенного изменения в развитии цепи и уменьшения величины параметра расширения цепи. Конформация гидратированного пектата натрия была изучена путем 1 включения данных релаксации многополевого ЯМР С -спектроскопии с различными уравнениями для плотности спектров [94]. На основе статических моделей дисахаридных остатков путем расчета из энергетических карт углов внутреннего вращения дисахаридных молекул были предположены вероятные конформации пектиновых гомо- и рамногалактуронанов [88]. Обнаружено, что энергетические карты незначительно отличаются при замене цепи GalAp-6-OMe на GalAp. Отсюда сделам вывод, что метоксильные группы не влияют на корформационное поведение пектиновых молекул. Возможная конформация рамногалактуронана В работе [88] также найдена конформация с наименьшей энергией для повторяющих звеньев a-D-GalAp-6-OMe (1—»2) a-L-Rhap na-L-Rhap(l— 4) а-D-Galp-6-OMe, генерирующего спиральную структуру рамногалактуронана (рис. 3). Авторами [95] представлен протокол, описывающий термическую деполимеризацию пектина с различной степенью этерификации. Полученные макромолекулы охарактеризовываны дополнительными методами, такими как хроматография, разделяющей по размерам частиц (ХРЧ), потенциометрия, выскозиметрия и С13 ЯМР-спектроскопия. Найдены оптимальные условия, дающие образы с Mw от 4 до 20 к Дальтон, с выходом 50-80%.
Молекулярные и конформанионные характеристики пектиновых веществ
Перед проведением реакции с карбазолом необходимо провести деметоксилирование, так как различная степень метоксилирования затрудняет получение достоверных результатов. Деметоксилирование проводят при комнатной температуре. Для этого к 0,5 мл раствор ПВ концентрации 0,5 мг/мл прилили 2 мл 0,05н NaOH и через 30 минут, 2 мл 0,05н HCI. Затем в пробирки отбирали по 0,5 мл деметоксилированного раствора пектина, помещали в сосуд со льдом и осторожно по каплям приливали 3 мл раствора бората натрия в серной кислоте (250 MrNa2B407.10H20 х.ч. в 100мл H2S04 g=1.84; химически чистую кислоту нагревали до начала выделения сернистого ангидрида, затем добавляли 0,15г мочевины, хч). Пробирки с анализируемой пробой встряхивали в охлаждающей смеси и, после завершения реакции, нагревали 6 мин на кипящей водяной бане. После кипячения пробирки охлаждали в сосуде с водой и льдом. В две пробирки с экстрактом пектина и с водой добавляли по 0,1 мл 0,2%-ного раствора карбазола в абсолютном этаноле (препарат карбазола перекристаллизовали из бензола и очищали возгонкой ) и вновь помещали в кипящую водяную баню на 10 мин. После охлаждения пробирок измеряли оптическую плотность растворов при 535нм в кювете с рабочей длиной 1 см. Контролем служит третья пробирка, в которой смешивали раствор бората в серной кислоте с водой (3:0,5) Содержание галактуроновой кислоты в пектине рассчитывали по формуле: где, а- содержание галактуроновой кислоты в пробе, найденное по калибровочной кривой, мкг; g-навеска образца ,г; V]- объем, взятый для разведения, мл; \V объем, полученный после разведения, мл; V3- объем пробы, взятой для реакции с карбазолом, мл; 100- коэффициент перевода в проценты; 1000000- коэффициент перевода в граммы. 2.8. Газожидкостная хроматография [105] Для определения моносахаридного состава ПВ подвергали кислотному гидролизу: навеску образца (100 мг) обрабатывали 2 н H2SO4 (10 мл) при кипячении в течение 7 часов. Гидролизаты разбавляли водой (20 мл) и нейтрализовали 0,25 М Ва(ОН)2 до рН= 5-6 для удаления ионов сульфата. Затем добавляли внутренний стандарт (2-дезокси -D-глюкозу). Осадок отфильтровали через фильтровальную бумагу и промывали водой. К фильтрату добавляли водный раствор карбоната натрия с таким расчетом, чтобы конечная концентрация последнего составила 0,01 моль/л. Эта операция проводится для омыления лактона уроновой кислоты. Фильтрат упаривали на роторном испарителе при 40 С. Затем прибавили Змл воды и провели восстановление Сахаров боргидридом натрия. Избыток боргидрида натрия разложили на колонке четырехкратным объемом смолы ( Dowex 50Н или КУ-2 ). Колонку несколько раз промывали водой. Элюат высушивали на роторном испарителе при 40С. К остатку приливали по 5 мл метанола и упаривали. Для полного удаления борной кислоты операцию повторяли трижды. Высушив образец от следов метанола, добавляли по 1-2 мл смеси обезвоженного пиридина и уксусного ангидрида. Смесь интенсивно перемешивали до полного растворения альдитов и выдерживали при 120 С в течение часа. Оставляли на 12 часов при комнатной температуре. Затем смесь вливали в 50 мл воды со льдом и через три часа продукты реакции экстрагировали хлороформом. Хлороформный раствор упаривали, полученный осадок растворяли в метаноле. Полученные таким образом ацетаты полиолов хроматографировали на колонке ХЕ-60 на хроматоне N- AW- DMCS (0,20 х 0,250 мм) при следующих условиях : температура испарителя и детектора 250 С, температура термостата 200 С, газ носитель азот (гелий) со скоростью 30 мл/мин, водород- 30-35мл/мин, воздух- 400 мл/мин. Количественный анализ проводили методом внутреннего стандарта. Концентрацию каждого компонента С; (масс .% ) определяли по формуле: Sst Mm где S- площадь пика компонента і анализируемой смеси; -относительный поправочный коэффициент, определяемый по отношению к стандарту; Sst- площадь пика стандарта; Mst, M/w-массы внутреннего стандарта и анализируемой смеси соответственно. Навеску пектина растворяли в 1 %-ном растворе KCI, а небольшое количество нерастворимых остатков отделяли путем центрифугирования при скорости ротора равной 7000 об/мин, высушивали и далее учитывали при расчете концентрации раствора. Характеристическую вязкость определяли путем измерения времени течения растворов различной концентрации (от 0,5 до 0,01 г/дл ) на вискозиметре Уббелоде (время течения растворителя 31.4сек ) при 25С с точностью 0,1 сек. По полученным данным рассчитывали приведенные вязкости в зависимости от концентрации раствора и путем экстраполяции первого параметра к нулевой концентрации определяли значение характеристической вязкости.