Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 8
1.1. Структурные особенности белков и полимеров как рецепторов 8
1.2. Термодинамика сорбции воды и органических соединений на твердых белках и полимерах 15
1.2.1. Сорбция в двухкомпонентных системах белок + сорбат и по лимер + сорбат. Математические модели сорбции 15
1 .2.2. Сорбция и кооперативные эффекты в трехкомпонентных системах белок или полимер + вода + органический компонент 29
1.2.3. Влияние температуры на сорбционные свойства твердых белков, на их каталитическую активность и рецепторные свойства в водных растворах 36
1.3. Кооперативные эффекты с участием белков и полимеров, непо средственно не связанные с сорбцией 39
1.3.1. Влияние воды на кинетику ферментативных реакций и взаимодействие антиген - антитело. Эффекты памяти белков (история гидратации) 39
1.3.2. Кооперативные фазовые переходы термотропных полимеров в водных растворах и водно-органических смесях... 43
1.4. Влияние липидов на стабильность и рецепторные свойства белков 47
Глава 2. Экспериментальная часть 49
2.1. Объекты исследования 49
2.2. Подготовка образцов для определения изотерм сорбции 51
2.3. Методика определения изотерм сорбции паров органических соединений 55
2.4. Определение коэффициентов распределения органических соединений между их чистой жидкостью и раствором в липидах 60
Глава 3. Обсуждение результатов 61
3.1. Влияние температуры и примесей липидов на сорбцию органических соединений высушенным р-лактоглобулином 61
3.2. Влияние гидратации, температуры и примесей липидов на рецеп-торные свойства р-лактоглобулина и коллагена 66
3.3. Влияние структуры органических соединений на их сорбцию вы сушенным поли-К-6-аминогексилакриламидом в бинарных системах. Оценка биоподобности сорбционных свойств высушенного поли-Ы-б- аминогексилакриламида 77
3.4. Влияние гидратации на сорбционное сродство поли-1Ч-6-аминогексилакриламида к парообразным органическим соединениям 83
3.5. Влияние органического компонента на рецепторные свойства по-ли-К-6-аминогексилакриламида 92
Выводы 100
Список литературы 101
Приложение... 113
- Сорбция в двухкомпонентных системах белок + сорбат и по лимер + сорбат. Математические модели сорбции
- Влияние воды на кинетику ферментативных реакций и взаимодействие антиген - антитело. Эффекты памяти белков (история гидратации)
- Методика определения изотерм сорбции паров органических соединений
- Влияние гидратации, температуры и примесей липидов на рецеп-торные свойства р-лактоглобулина и коллагена
Введение к работе
Актуальность работы. Термодинамическое изучение кооперативного влияния гидратации на рецепторные свойства твердых белков и гидрофильных полимеров, а также факторов, влияющих на этот процесс, позволяет глубже понять роль воды в способности белков связывать субстраты и выявить важные критерии, которым должны удовлетворять полимерные рецепторы для того, чтобы их рецепторные свойства были биоподобны. Знание этих критериев необходимо для молекулярного дизайна биоподобных и биосовместимых полимеров, применяемых в качестве сенсоров, а также для транспорта лекарств и создания искусственных тканей в медицинских целях. Кооперативные эффекты с участием воды известны для кинетики ферментативных реакций, для связывания белками воды из водно-органических смесей, а также для термотропных фазовых переходов гидрофильных полимеров и процессов сворачивания белков в нативную структуру. Большая часть этих данных получена для растворов, из-за чего их интерпретация существенно затруднена доминирующим вкладом дегидратации субстрата перед его связыванием белком или полимером. Данные о влиянии внешних факторов (температура и присутствие примесей) на кооперативный эффект гидратации для белков в отсутствие жидкой фазы и о существовании аналогичного эффекта для полимеров в литературе отсутствуют.
Цель работы. Целями диссертационной работы являлось: - установление закономерностей кооперативного влияния гидратации на сорб- ционные свойства стеклообразного гидрофильного сшитого полимера с целью оценки степени биоподобности его рецепторных свойств - изучение влияния температуры и примесей липидов на кооперативный эф фект гидратации при связывании белками углеводородов
Научная новизна и выносимые на защиту положения. В диссертационной работе впервые обнаружен биоподобный кооперативный эффект при связывании паров органических соединений сшитым гидрофильным полиме- ром. Показано, что с ростом гидратации его сродство к гидрофобным и относительно крупным гидрофильным сорбатам, так же как и в случае белков* кооперативно возрастает и достигает насыщения. При этом биоподобность рецептор-ных свойств гидратированного полимера по отношению к изученным сорбатам выражена тем больше, чем меньше их способность пластифицировать высушенный полимер. Наблюдаемые результаты позволили сделать вывод в пользу образования клатратов вода + органический компонент + полимер.
Впервые показано, что увеличение температуры от комнатной (298 К) до физиологической (309.5 К) приводит к уменьшению порога по гидратации, необходимого для эффективного связывания субстратов белкам. Впервые обнаружен синергизм во влиянии гидратации и примесей липидов, присутствующих в белке, на его сорбционное сродство. Показано, что данный эффект не связан с растворением сорбатов в отдельной фазе липидов.
Практическая значимость работы состоит в том, что на основании ее результатов становится возможным выявление структурных критериев, необходимых для молекулярного дизайна полимеров, обладающих биоподобными рецепторными свойствами, для создания на их основе сенсоров, не уступающих по селективности и чувствительности сенсорам на основе белков. Данные о влиянии липидов и температуры на рецепторные свойства белка обеспечивают фундаментальную основу для решения проблем распознавания запахов в биологических системах, удерживания ароматических добавок и вредных веществ пищевыми продуктами.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и содержит 43 рисунка и 32 таблицы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, обсуждение результатов), выводов, списка литературы из 112 наименований и приложения.
В первой главе собраны и систематизированы литературные данные о термодинамике взаимодействий белковых препаратов и полимеров с органиче- скими соединениями и водой из паровой фазы и из растворов. Приводятся литературные данные об известных кооперативных эффектах, наблюдаемых для белков и полимеров. В рамках современных модельных представлений о белках и полимерах как о твердой фазе приводятся различные сорбционные модели, применяемые в литературе.
Во второй главе описаны объекты исследования и экспериментальные методики, применявшиеся в ходе выполнения настоящей работы.
В третьей главе анализируются полученные экспериментальные данные. Для бинарных систем проводится анализ влияния температуры и примесей липидов на сорбционные свойства высушенного белка, а также анализируются биоподобность высушенного сшитого гидрофильного полимера путем сравнения его сорбционных свойств со свойствами ранее изученных белков. Для трехкомпонентных систем анализируется сходство кооперативного эффекта гидратации на рецепторные свойства белков и изученного полимера. Кроме того, сопоставляется наблюдаемый эффект "водоподобных" органических растворителей на рецепторные свойства полимера с ранее изученным эффектом тех же растворителей на свойства белка.
Работа выполнена на кафедре физической химии Химического института им. А.М. Бутлерова государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина" под руководством доктора химических наук В.В. Горбачука при поддержке гранта УРФИ (проект N 015.05.01.16), совместного гранта CRDF и Российского Министерства образования "Basic Research & Higher Education" (REC-007), РФФИ-тат. (No.03-03-96188) и АНТ (No.7-7.1-60/2001 и No.7-7.3-209/2003).
Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на I, И и Ш Научных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ КГУ (Казань, 2000, 2001 и 2003 гг.), на итоговых конференциях КГУ (Казань, 2002 и 2003 гг.), на XIV Международной конференции по химической термодинамике (Санкт-Петербург, 2002 г.), на II Международном симпозиуме "Молекулярный дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур" (Казань, 2002 г.), на II Междисциплинарной конференции НБИТТ-21 (Петрозаводск, 2003), на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003 г.), на II Международном симпозиуме "Реагирующие полимеры в негомогенных системах в расплавах и на межфазных границах" (Дрезден, Германия, 2003 г.).
Личный вклад автора. Автором диссертации было выполнено 90% экспериментальной работы. Доля участия автора при написании статей - 30% от объема публикации, при написании тезисов на конференции - 50%.
Публикации. Публикации по теме диссертации написаны в соавторстве с д. х. н. профессором Горбачуком В.В., осуществлявшим руководство исследованием и принимавшим участие в обсуждении результатов и написании статей и тезисов, с д. х. н. профессором Соломоновым Б.Н. (Казанский государственный университет), профессором Хаэртле Т. (ИНРА, Нант), профессором Хаби-шером В.Д. (институт органической химии, Дрезден) принимавшими участие в обсуждении результатов, а также Бреусом В.В., выполнявшим под руководством автора курсовую и дипломную работы.
Сорбция в двухкомпонентных системах белок + сорбат и по лимер + сорбат. Математические модели сорбции
Сорбционные свойства белков и полимеров могут быть сопоставлены на основе данных по сорбции воды. Сорбция воды на белках рассматривается во многих работах [24-29]. Примеры изотерм сорбции воды на белках приведены на рис. 7 (также приведена и изотерма сорбции на гидрофильном полимере). Видно, что на изотермах всех представленных белков при начальных значениях активности воды имеется лэнгмюровский участок, свидетельствующий о наличии ограниченного количества мест, термодинамически наиболее выгодных для сорбции. Кроме того, на всех изотермах имеется точка перегиба, выше которой наклон изотермы начинает постоянно возрастать. Первые изотермы сорбции воды на белках были получены на раннем этапе развития представлений в этой области, когда единственной рассматриваемой моделью сорбции была модель многослойной сорбции (БЕТ) [30] на фиксированной поверхности раздела фаз: VX V C Ро Ро где Vs и Vm- адсорбированный объем и объем монослоя в пересчете на жидкий сорбат, С - константа сорбции, Р/Р0 - термодинамическая активность сорба-та, Р - парциальное давление пара сорбата в исследуемой системе, Р0 - давление насыщенного пара сорбата над его чистой жидкостью. О 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Относительное давление паров Н20
Однако уравнение БЭТ (1.1) удовлетворительно описывает лишь начальную часть изотерм сорбции паров воды на твердых белках в интервале активности воды от 0 до 0.6 [29]. Экспериментальные точки для активностей выше 0.6 лежат ниже теоретической кривой БЭТ, полученной аппроксимацией начального участка изотерм. Дело в том, что модель БЭТ описывает сорбцию по поверхности, тогда как сорбция воды в белках происходит внутрь фазы, что подтверждается существующими литературными данными. Так, сорбция воды на коллагене более чем в сто раз превышает сорбцию азота при тех же активностях сорбата [31, 32]. Этот факт не удается объяснить в рамках модели БЕТ. В работе [31] его объясняют проникновением воды внутрь твердой фазы коллагена.
Для того чтобы удовлетворительно описать сорбцию воды на белках, были созданы различные комбинированные модели. Некоторые из них представлены в работе [29]. Эти модели предполагают наличие одновременно нескольких типов мест сорбции, или нескольких механизмов сорбции. Недостатком большинства этих комбинированных моделей является та же попытка использовать для описания сорбции, происходящей в объем твердой фазы белка, уравнения, соответствующие сорбции по поверхности раздела фаз воздух-белок. К настоящему времени единой признанной всеми модели для описания сорбции воды и других сорбатов на белках не существует.
Предсказанная методом Врентас и Врентас (линия) и экспериментальная (кружки) изотермы сорбции паров воды на поливинил пиррол идоне при 25 С [28]. Изотерма сорбции на поливинилпирролидоне, полученная в работе [28], рис. 8, была описана с помощью модели Врентаса [33, 34], которая учитывает одновременно и сорбцию воды в так называемом свободном объеме стеклообразного полимера и растворение в фазе резиноподобного (высокоэластичного) полимера: P/P0=rexp(l- P+X(l- P)2 XP(F) (1,2) здесь F=M{\-w)2(Cp-pg)B [T/(Tg- Bw) A]tRT где w - массовая доля сорбата, М - его молекулярная масса, Tg - температура стеклования полимера, В - коэффициент пропорциональности, отображающий степень понижения температуры стеклования полимера в зависимости от массовой доли сорбата (Tgm = Tg - Bw, где Tgm - эффективная температура стеклования или температура стеклования при данном содержании сорбата), Ср и Cpg -изобарные теплоемкости равновесного жидкого (резиноподобного) и стеклообразного полимера, соответственно.
В уравнении (1.2) при температурах выше или равной эффективной температуре стеклования (Г Tg Bw) значение F принимается равным нулю и уравнение Врентаса становится обычным уравнением Флори-Хаггинса. Формально модель Врентаса подходит и для описания сорбции воды на белках, примеры чего в литературе имеются [28].
Для полимеров форма изотермы сорбции, приведенная на рис. 8, характерна не только для сорбции воды, но и для сорбции органических соединений, рис. 9 [35]. Процессы сорбции воды, а также органических сорбатов на полимерах изучены гораздо лучше, чем для белков, и модельные представления для описания сорбции на полимерах в целом более адекватны механизмам сорбции. Лэнгмюровский участок, наблюдаемый при начальных значениях активности сорбата, рис. 8 и 9, интерпретируют как сорбцию в свободном объеме полимера - "застывших" промежутках между полимерными цепями стеклообразного полимера, по которым возможен транспорт малых молекул [28]. Величина сво 19 бодного объема зависит от истории перехода полимера в стеклообразное состояние [28, 36], и, если размеры сорбата слишком велики, чтобы проникнуть в свободный объем стеклообразного полимера, то лэнгмюровский участок на изотермах сорбции может отсутствовать, рис. 9. Точку перегиба на изотерме относят к переходу полимера из стеклообразного состояния, в котором он находится при низких активностях органического компонента, в резиноподобное, рис. 9, [35]. Эти состояния отличаются степенью сегментальной подвижности полимера: стеклообразным считается такое состояние, в котором сегментальная подвижность полимерной цепи отсутствует.
Причина перехода в резиноподобное состояние заключается в том, что при связывании сорбата взаимодействия полимер - полимер заменяются на взаимодействия полимер - сорбат, что облегчает сегментальную подвижность полимерной цепи. Этот процесс называется пластификацией. Обратное явление, заключающееся в уменьшении сегментальной подвижности полимера, носит название антипластификации [37]. Эффект антипластификации наблюдался в работе [37] при исследовнии методом аннигиляции позитронов изменений свободного объема в полиамиде 6 при сорбции воды, рис. 10. На этом рисунке показано изменение свободного объема v в сухом и влажном полиамиде в зависимости от разности температур Т- Tg, где Г в случае эксперимента с сухим полимером является переменной температурой (верхняя шкала), a Tg представляет собой температуру стеклования сухого полиамида, равную 54С. В случае с влажным полимером, наоборот, температура эксперимента Т фиксирована и равна 25С, a Tg представляет собой функцию относительной влажности КН воздуха, в котором находятся образцы полимера. Влажность полимера в эксперименте менялась от 0 до 100%. Из рис. 10 видно, что свободный объем в гид-ратированном полимере меньше, чем в высушенном, что интерпретируется авторами как проявление эффекта антипластификации полимера водой [36, 37]. Причиной антипластификации является способность молекул воды заполнять свободный объем полимера, что ограничивает сегментальную подвижность полимерной цепи, и образовывать водородные связи только со свободными карбонильными группами, не разрывая, таким образом, существующие в полимере водородные связи, стабилизирующие его стеклообразное состояние [37].
Влияние воды на кинетику ферментативных реакций и взаимодействие антиген - антитело. Эффекты памяти белков (история гидратации)
Присутствие воды является ключевым фактором, определяющим биохимические свойства белков [68, 69]. Наблюдаемое кооперативное влияние гидратации на способность белков связывать органические молекулы (рис. 23) по всей видимости, играют важную роль в функционировании белков. Так, кооперативный эффект гидратации можно наблюдать во влиянии воды на кинетику ферментативных реакций. Увеличение гидратации ферментов, суспендированных в органических растворителях, выше некоторого порогового уровня, приводит к кооперативному росту скорости [70-72] и энантиоселективности ферментативных реакций [73]. Типичная зависимость скорости ферментативной реакции (с участием лакказы) от активности воды в системе представлена на рис. 24 [74]. Аналогичные кооперативные эффекты гидратации наблюдались для газофазных ферментативных реакторов [75, 76] (рис. 25). При этом, выше пороговой гидратации фермента его активность достигает значения, близкого к постоянному .
Активность воды Рис. 24. Зависимость Vm иммобилизованной лакказы от aw в различных водно-органических смесях. Органические растворители: метанол (О), изо-пропанол ( ), изо-бутанол (), н-бутанол (), этанол (), диоксан (), ацетонитрил (V), ТГФ (О), ацетон (А) [74].
Аналогично обнаруженному в работе [45] эффекту истории гидратации на способность сывороточного альбумина к связыванию органических сорбатов (см. раздел 1.2.2.), эффект истории гидратации существует и для ферментов. Влияние цикла гидратации — дегидратации на активность алкогольде-гидрогеназы (YADH) в газофазном ферментативном реакторе при 22 С. Субстрат - 3-метил-2-бутен-1-ол. Фермент был гидратирован при заданной влажности газа (о), затем гидратирован до более высокого содержания воды и дегидратирован перед повторной реакцией (). Данные работы [75].
В работе [77] эффект истории гидратации был обнаружен при сравнении скорости реакции переэтерификации этилового эфира 1Ч-ацетил-Ь-фенилаланина 1-пропанолом в гексане, катализируемой суспензией гидратиро-ванного субтилизина Карлсберга, приготовленной двумя способами, отличающимися способом гидратации фермента. Активность фермента, гидратирован-ного непосредственно в органическом растворителе (in situ), была значительно выше активности фермента, предварительно увлажненного на воздухе с последующим переносом в органический растворитель [77].
Вода играет важную роль в способности антител связывать антигены. В работе [78] было найдено, что константа диссоциации антиген-антитело минимальна в водном растворе и растет с увеличением гидрофобности растворителя. В работе [79], где изучалось связывание тестостерона антитестостероном, полагается, что ингибирующее влияние органических растворителей на связывание антигена антителом вызвано их способностью вытеснять воду из окружения молекулы антигена. 1.3.2. Кооперативные фазовые переходы термотропных полимеров в водных растворах и водно-органических смесях
Существует класс гидрофильных полимеров с определенным соотношением гидрофильных и гидрофобных групп, для которых обнаружен кооперативный эффект гидратации в виде термотропных кооперативных фазовых переходов, аналогичных тем, что имеют место при сворачивании (фолдинге) белков [80-85]. Фазовый переход заключается в кооперативном растворении гидрофильного полимера или увеличении степени набухания его геля при понижении температуры раствора ниже определенной критической величины, рис. 26, [80, 85]. Причина этих явлений - эффект гидрофобной гидратации, то есть сольватация молекулами воды гидрофобных групп полимерной цепи, которая возможна, если энтропийная составляющая свободной энергии сольватации меньше энтальпийной. При температурах выше критической, сольватация водой гидрофобных групп полимера невыгодна и происходит контракция геля, рис, 26, [80].
Подобные кооперативные фазовые переходы в растворах и гелях гидрофильных полимеров наблюдаются не только при изменении температуры раствора, но также и при изменении химического потенциала (рН и ионной силы) [80, 81, 87], электрохимического потенциала [80], электромагнитного излучения [80] и в присутствии добавок органических соединений [86-90]. В рамках настоящей работы наиболее интересен последний эффект. Температуря, С
В работе [88] обнаружено, что при кооперативном связывании бензойной кислоты и фенола набухшим гидрогелем поли-Ы-изопропилакриламида степень набухания гидрогеля резко и кооперативно падает, рис. 27. Аналогичная картина наблюдалась при связывании тем же полимером различных гидро-ксибензолов, рис. 28 [89]. Причиной такого эффекта в работе [88] в случае фенола считается образование водородных связей между амидными группами полимера и гидроксильными группами фенола, что подтверждается данными ИК-спектроскопии. Вызванное таким образом увеличение числа гидрофобных групп в полимере приводит к росту химического потенциала воды, гидрати-рующей полимер [88].
В принципе, липиды могут конкурировать с белками за связывание гидрофобных субстратов или занимать места их связывания. Но однозначного ответа на этот вопрос в литературе нет. Так, в работе [3] было обнаружено, что в водном растворе Р-лактоглобулина жирная кислота лактон и ретинол конкурируют за один и тот же участок связывания на белке. В то же время в более ранней работе [91] говорится о том, что жирные кислоты и ретиноиды связываются Р-лактоглобулином независимо и одновременно. Авторы предположили, что в водном растворе одна Р-полость Р-лактоглобулина способна вместить сразу два различных лиганда.
С другой стороны, липиды оказывают влияние на стабильность белков. Различают общий и специфический эффект липидов на структурные свойства белков [92]. Общий эффект заключается в том, что липиды способствуют ассоциации а-спиралей или [З-слоев при сворачивании белка. Некоторые липиды необходимы для поддержания структуры определенных белков путем специфических взаимодействий или смещения положения равновесия между различными конформационными состояниями [92]. Такие липиды могут играть роль простетических групп или регуляторных лигандов. Например, образование комплексов р-лактоглобулина с жирными кислотами повышает устойчивость белка к денатурации мочевиной [93].
Методика определения изотерм сорбции паров органических соединений
Для систем, в которых сорбат распределяется между паровой фазой и твердой фазой белка или полимера, статическим методом парофазного газо-хроматографического анализа были определены изотермы сорбции при постоянной температуре. Изотермы сорбции определялись как функции количества сорбированного летучего компонента Л (ммоль сорбата на грамм сорбента) от его активности Р/Р0 в системе (Р - давление пара сорбата в исследуемой системе, Ро — давление пара сорбата над его чистой жидкостью). Статический метод позволяет изучать системы парообразный сорбат - твердый сорбент с длительным временем установки сорбционного равновесия. Кроме того, применяемый метод парофазного газохроматографического анализа позволяет определять изотермы сорбции в системах, содержащих несколько летучих компонентов, и контролировать наличие летучих примесей в исследуемых твердых или жидких образцах.
Устройство работает на основе принципа электропневматического дозирования путем остановки на короткое время (0.5 или 1 сек.) подачи газа-носителя (гелия) на вход хроматографической колонки и делителя потока. Управление подачей гелия осуществляется компьютером при помощи электропневматического клапана. Система дозирования не содержит металлические и ненагреваемые элементы на пути пробы пара сорбата от стеклянной ампулы с изучаемой системой до капиллярной колонки. Общий объем и поверхность всех контактирующих с пробой гостя линий между ампулой с образцом и колонкой составляет 30 мкл и 60 мм , соответственно.
Термодинамическая активность сорбата в исследуемых системах (Р/Ро) определялась как отношение высоты (или площади) хроматографического пика сорбата в пробе пара исследуемой системы Н (или S) к высоте или площади пи-ка для пробы пара, находящегося над его чистой жидкостью Но (или Sy, что эквивалентно отношению парциальных давлений пара сорбата Р в соответствующих системах (Р/Ра). Применяемый автоматический дозатор обеспечивает воспроизводимость определения высоты полностью разделенных хроматографиче-ских пиков на уровне 99% при повторном дозировании из одной и той же ампулы с образцом. Отсутствие наложения пиков примесей на хроматографический пик исследуемого компонента контролировалось по постоянству отношения высоты пика к его площади, а также по равенству этого отношения для пробы пара изучаемой системы и пробы пара чистого жидкого сорбата. Погрешность измерения термодинамической активности сорбата составляла 5% для активностей более 0.5 и 10% для активностей сорбата менее 0.1. Более половины величины экспериментальной ошибки определения активности является систематической, обусловленной ошибкой определения величины пика насыщенного пара над жидким сорбатом (2-3%), и вследствие нелинейности дозирования сорбата в хроматографическую колонку (3-5% при Р/Р о 0.10). Уровень систематических ошибок оценивался путем определения предельных коэффициентов активности компонентов в растворах, близких к идеальным.
Давление насыщенного пара Р0 изученных сорбатов, за исключением а- и у-терпинена, было взято из литературы [97, 98]. Для а- и у-терпинена давление насыщенного пара было определено в настоящей работе, исходя из соотношения высот хроматографических пиков насыщенных паров этих соединений и декана. Оно составляло 0.22, 0.41 и 0.76 кПа при 298, 309.5 и 318 К для о терпинена, и 0.10 и 0.21 кПа при 298 и 309.5 К для у-терпинена, соответственно.
Активность сорбата Р/Р0 при известном давлении его насыщенного пара Ро позволяет рассчитать его содержание в паровой фазе системы. По разнице между общим количеством сорбата в системе и его количеством в паровой фазе рассчитывался состав твердой фазы Л в ммоль/г (отношение количества связанного сорбата к количеству сорбента). При определении состава твердой фазы учитывалась поправка, обусловленная улетучиванием сорбата из исследуемой системы в момент дозирования и за время термостатирования. В последнем случае потери пропорциональны времени термостатирования, а также летучести и активности сорбата в исследуемой системе и оценивались в холостом опыте без твердого сорбента. Максимальные потери, составлявшие 12% от общего количества сорбата в ампуле, наблюдались для наименее летучих сорба-тов, которые уравновешивались с белком в течение 11 дней.
Ошибка определения сорбции А зависит от аккуратности дозирования жидкого сорбата в ампулу и доли сорбата в паровой фазе системы после уравновешивания. В случае двухкомпонентных систем с высушенным ПНАГАА эта ошибка была равна 1-3% для всех изотерм при А 0.5 ммоль/г и 3-6% при А 0.5 ммоль/г, за исключением изотерм для диоксана и бензола. Для изотермы диоксана те же значения ошибок были при А 03 ммоль/г и А - 0.1-0.3 ммоль/г, соответственно. При А 0.1 ммоль/г для изотерм диоксана и бензола ошибка сорбции была максимальна (7-15% и 30-60%, соответственно), поскольку в этих случаях большая часть сорбата находилась в паровой фазе: 60-70% и свыше 90%, соответственно. В трехкомпонентных системах ошибка определения сорбции А была равна 3-6% за исключением систем с бензолом и гйдратированным ПНАГАА, где ошибка была равна 6-9%. Для систем с БЛГ ошибка определения сорбции А ацетонитрила при его активностях Р/Р о 0.60 и 298 К, а также при Р/Р о 0.30 и 309.5 К была 3-5%. Для систем с этанолом ошибка находилась в интервале 4-6%. В случае изотерм сорбции терпенов и декана при гидратации БЛГ 0.20 h ошибка определения сорбции была равна 5-7%. При гидратации белка менее 0.10 А, когда доля сорбата в паровой фазе была велика (30-50%), ошибка составляла 10-13% для обезжиренного БЛГ и 20% для жирного. В трехкомпонентных системах коллагена с диоксаном и водой ошибка определения сорбции А при гидратациях 0Ah составляла 2-7% и 7-15% при меньших значениях гидратации.
Влияние гидратации, температуры и примесей липидов на рецеп-торные свойства р-лактоглобулина и коллагена
Влияние гидратации и температуры на сорбционное сродство жирного и обезжиренного р-лактоглобулина к декану и терпенам (а-терпинену, у-терпинену и терпинолену) изучалось в системах "белок + вода + этанол + углеводород" в отсутствие жидкой фазы. Изотермы сорбции были получены при постоянном объемном соотношении жидких органических компонентов (0.9 об. % углеводорода + 9.0 об. % этанола) и воды (90.1 об. %), добавляемых к высушенным образцам р-лактоглобулина. В случае коллагена дозируемая смесь содержала 94 об. % воды и 6 об. % диоксана. Доля органических компонентов в дозируемых смесях была выбрана достаточно низкой, чтобы свести к минимуму их влияние на сорбцию воды белками. С другой стороны, их концентрация была подобрана так, чтобы они имели достаточно высокую активность при больших количествах дозируемой смеси (больше 100 мкл на 300 мг сухого белка в случае р-лактоглобулина и 50 мкл на 200 мг в случае коллагена) после достижения термодинамического равновесия.
Этанол, который присутствовал в исследуемых системах с р-лактоглобулином, использовался в качестве разбавителя углеводорода для уменьшения ошибки дозирования. Изотермы сорбции этанола определялись параллельно определению изотерм сорбции углеводородов. Влияние этанола на сорбционное сродство сывороточного альбумина человека к гидрофобным соединениям, исследованное в работе [45], не превышало половины эффекта гидратации. Таким образом, вклад этанола в сорбционное сродство р-лактоглобулина к углеводородам составляет примерно 5%.
Изотермы сорбции терпенов и декана представлены в координатах: отношение мольного содержания сорбата к его активности, A/(P/PQ) против содержания воды в белке, й, рис. 35 и 36. Значение А/(Р/Р$) характеризует сорбционное сродство белка к сорбату или коэффициент распределения сорбата между фазой его чистой жидкости и фазой белка.
Из рис. 35 и 36 видно, что увеличение гидратации Р-лактоглобулина приводит к кооперативному росту сорбционного сродства к декану и терпенам как в случае жирного белка, так и в случае обезжиренного. При содержании воды ниже 0.1 h (г Н2О/Г белка), сродство Р-лактоглобулина невелико: 0.01-0.02 ммоль/г для обезжиренного белка и 0.04-0.20 ммоль/г для Р-лактоглобулина с примесью жиров. В большинстве случаев при высоких степенях гидратации наблюдается насыщение или максимум сорбционного сродства р-лактоглобулина к углеводородам, рис. 35 и 36. Таким образом, имеет место порог сродства Р-лактоглобулина к изученным углеводородам по гидратации.
Влияние гидратации на сорбционное сродство A/(P/PQ) твердого препарата Р-лактоглобулина с примесью липидов (1.2 % по массе) к декану и терпенам в четырехкомпонентных системах с водой и этанолом при 298, 309.5 и 318 К. Сложные формы изотерм сорбции терпенов и декана на гидратированном р-лактоглобулине не позволяли подобрать модель для их аппроксимации. Для Р-лактоглобулина величина порога по гидратации hnop рассчитывалась линейной интерполяцией по пяти близлежащим к полувысоте изотермы точкам. В табл. 4 приведены значения h„op для обезжиренного и жирного р1-лактоглобулина и коллагена к изученным сорбатам при различных температурах.
Из полученных изотерм и таблицы видно, что при повышении температуры от стандартной (298 К) до физиологической имеет место уменьшение порога по гидратации на 0.05-0.08 h как для обезжиренного, так и для жирного препарата р-лактоглобулина (на рис. 35 и 36 уменьшение порога обозначено стрелками). В случае коллагена порог по гидратации уменьшается на 0.03 h, рис. 37. Дальнейшее увеличение температуры до 318 К приводит к возрастанию порога по гидратации hnop до значения 0.20 h для а-терпинена на жирном Р-лактоглобулине, рис. 36А. Присутствие липидов не оказывает заметного влияния на порог. При одинаковых температурах для систем с деканом значение hnop выше, чем для изученных терпенов.
![Циклическая кооперативная внутримолекулярная водородная связь в каликс[n]аренах(n=4,6,8) по данным ИК Фурье-спектроскопии и квантово-химических расчетов](/i/i/4374/280205.png "Циклическая кооперативная внутримолекулярная водородная связь в каликс[n]аренах(n=4,6,8) по данным ИК Фурье-спектроскопии и квантово-химических расчетов Потапова Людмила Ильинична")
![Влияние размера макроцикла трет-бутилкаликс[n]аренов на селективность и эффективность связывания паров органических соединений](/i/i/4429/297974.png "Влияние размера макроцикла трет-бутилкаликс[n]аренов на селективность и эффективность связывания паров органических соединений Якимов Алексей Вадимович")
![Синтез некоторых пиперидилпроизводных изохинолинов, [1,6]нафтиридинов и их N-замещенных в пиперидиновом фрагменте](/i/i/4448/391012.png "Синтез некоторых пиперидилпроизводных изохинолинов, [1,6]нафтиридинов и их N-замещенных в пиперидиновом фрагменте Ковальский Дмитрий Анатольевич")