Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 - Биоаккумуляция металлов организмами. Механизмы, токсичность, воздействие (Литературный обзор) 12
1.1 Влияние тяжелых металлов на биосферу 12
1.2 Накопление металлов организмами 13
1.3 Неспецифические методы накопления металлов. Комплексы аминокислот с металлами 15
1.4 Неспецифические методы накопления металлов. Комплексы металлов с фосфолипидами. Строение клеточной мембраны и ее роль в накоплении металлов на поверхности клетки 22
1.5 Специфические механизмы накопления металлов организмами. Поступление металлов внутрь клетки 26
1.6 Заключение. Воздействие металлов на организм и применение пробиотиков для коррекции функциональных состояний, вызванных отравлением тяжелыми металлами. 28
ГЛАВА 2 - Материалы и методы исследования 32
2.1 - Общая характеристика материалов исследования 32
2.2 Метод последовательных разведений 34
2.3 Фотоэлектроколориметрический метод 36
2.4 Атомно-абсорбционный метод 37
2.5 Рентгенофлуоресцентный анализ 38
2.6 Атомно-силовая микроскопия 39
2.7 Спектрофлуориметрия 40
2.8 Методика оценки эффективности применения пробиотиков в системе доставки и выведения тяжелых металлов из организма 40
2.9 Квантово-химические методы исследования 42
2.9.1 Моделирование низкомолекулярных систем 42
2.9.1.1 Выбор базисного набора для моделирования низкомолекулярных систем 43
2.9.1.2 Выбор модели учета сольватационных эффектов (модель поляризуемого континуума) 50
2.9.2 Моделирование металлотионеинов 51
2.10 Методы статистической обработки данных 54
ГЛАВА 3 - Биоаккумуляция металлов бактериями 55
3.1 Определение минимальных подавляющих концентраций солей тяжелых металлов, влияющих на рост бактерий рода Bacillus 55
3.2 Воздействие солей тяжелых металлов на бактерии рода Bacillus 57
3.2.1 Определение фаз роста бактерий при совместном культивировании с солями тяжелых металлов 57
3.2.2 Изменение pH жидкой питательной среды от времени культивирования бактерий 62
3.3 Изучение способности бактерий накапливать тяжелые металлы в биомассе 63
3.4 Исследование динамики накопления металла с помощью РФА 67
3.5 Влияние тяжелых металлов на морфологию клеток бактерий рода Bacillus 69
ГЛАВА 4 – Анализ механизмов накопления металлов бактериями 73
4.1 Квантово-химическое моделирование комплексов аминокислот с металлами 73
4.1.1 Выбор теоретической модели 73
4.1.2 Строение и энергия образования аланинатов тяжелых металлов 76
4.1.3 ИК-спектры комплексов аланина с металлами 82
4.2 Тушение флуоресценции триптофана ионами d-металлов 86
4.3 Квантово-химическое моделирование комплексов фосфолипидов с металлами 89
4.4 Квантово-химическое моделирование связывания ионов Zn, Co, Cd и Pb металлотионеинами 95
ГЛАВА 5 – Оценка сорбционных свойств бактериями рода Bacillus тяжелых металлов в условиях in vivo .
Практическое применение пробиотических бактерий рода Bacillus для выведения тяжелых металлов из организма животных 106
Заключение 109
Выводы 114
Список использованных источников 116
- Неспецифические методы накопления металлов. Комплексы металлов с фосфолипидами. Строение клеточной мембраны и ее роль в накоплении металлов на поверхности клетки
- Рентгенофлуоресцентный анализ
- Определение фаз роста бактерий при совместном культивировании с солями тяжелых металлов
- Квантово-химическое моделирование комплексов фосфолипидов с металлами
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
Развитие промышленности, увеличение добычи и переработки металлов привело к повышению их количества в почве и ее загрязнению. Особую опасность вызывают тяжелые металлы, вовлечение которых в биосферный круговорот является крупной экологической проблемой текущего времени, в частности, остро стоит проблема защиты высших организмов от вредного воздействия тяжелых металлов. В организм животных тяжелые металлы поступают преимущественно с пищей. Воздействие тяжелых металлов приводит к таким неблагоприятным последствиям, как уменьшение веса животного, снижение иммунитета организма. В то же время, имеется множество экспериментальных данных о бактериях, растениях, грибах и продуктах их жизнедеятельности, способных выступать в роли биоаккумуляторов тяжелых металлов.
Большой интерес вызывает изучение аккумуляции металлов
микроорганизмами, входящими в состав пробиотических препаратов, так как такие препараты обладают ярко выраженной антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, высокой ферментативной активностью и иммуностимулирующим действием. Помимо перечисленных свойств, данные пробиотики обладают важным свойством – это антитоксическое действие, проявляющееся в накоплении и активном выведении тяжелых металлов из организма. Установлено, что свое токсическое действие тяжелые металлы проявляют только в виде ионов, связываясь с заряженными функциональными группами органических молекул. Если же их тем или иным способом перевести в связанную форму, то они лишаются токсических свойств.
Изучение механизмов накопления металлов бактериями является актуальной научной проблемой, поскольку новые знания о способах накопления металлов бактериями способствуют созданию новых препаратов для лечения интоксикации тяжелыми металлами у человека и животных, а также методов снижения антропогенной нагрузки на окружающую среду с использованием бактерий, в частности, рода Bacillus.
Решение данной проблемы может быть основано на выявлении механизмов аккумуляции металлов бактериями. Предполагается, что эффект определяется связыванием металлов с органическими молекулами клетки как входящими в их состав, так и выделяемыми бактериями наружу. Поэтому в настоящей работе экспериментально изучены закономерности аккумуляции ионов тяжелых металлов бактериями рода Bacillus и с помощью теории функционала плотности
4 исследованы строение и энергии образования комплексов тяжелых металлов с биомолекулами в рамках моделирования двух способов накопления металлов микроорганизмами: неспецифического (связывание металлов с аминокислотами, фосфолипидами) и специфического (связывание металлов белками, например, металлотионеинами).
Работа выполнена в соответствии с плановыми исследованиями
Оренбургского государственного университета «Исследование спиновых и спин-каталитических эффектов в биохимических процессах и межмолекулярных комплексах с участием металлов и кислорода», номер Госрегистрации 114090340009, а также при поддержке гранта Оренбургской области в сфере научной и научно-технической деятельности № АААА-А16-116070410135-5 «Анализ биоадсорбции металлов пробиотическими бактериями для возможного применения пробиотиков при интоксикации тяжелыми металлами у человека и животных».
Цель работы – экспериментальное исследование аккумуляции тяжелых металлов бактериями рода Bacillus и квантовохимическое моделирование механизмов связывания металлов биомолекулами для объяснения наблюдаемых закономерностей биоаккумуляции.
Для достижения цели работы решались следующие задачи:
– определение количественного накопления тяжелых металлов исследуемыми микроорганизмами в биомассе (in vitro), с анализом динамики накопления металлов во времени и влияния тяжелых металлов на морфологию пробиотических бактерий в периодической культуре;
– теоретическое моделирование неспецифического механизма связывания металлов, установление строения комплексов тяжелых металлов (Zn, Cd, Co, Pb) с аминокислотами на примере L-аланина и фосфолипидами, расчет энергий образования комплексов и определение ряда устойчивости;
– исследование специфической аккумуляции ионов тяжелых металлов низкомолекулярными белками – металлотионеинами – с помощью методов теории функционала плотности и молекулярной механики, установление относительной эффективности связывания в ряду изученных металлов;
– определение эффективности применения пробиотических препаратов в системе доставки и выведения цинка в организме животного (in vivo).
Методы и объекты.
Для решения поставленных в работе задач применялись следующие экспериментальные методы исследования: метод последовательных разведений,
5
фотоэлектроколориметрия, атомно-абсорбционная спектрофотометрия,
рентгенофлуоресцентный анализ, атомно-силовая микроскопия, инфракрасная
спектроскопия, флуоресцентный анализ, а также квантово-химическое
моделирование с помощью программных комплексов FireFly 8.1, Gaussian-09 C.01.
Расчеты проводили с помощью функционала плотности B3LYP и
полноэлектронного базиса DZP. При ONIOM расчетах было использовано также силовое поле UFF.
В работе использовались три пробиотических штамма бактерий рода Bacillus: B. clausii, B. subtilis 7048, B. licheniformis 7038. В качестве регулирующих факторов применялись соли тяжелых металлов: MnSO4H2O, FeSO4H2O, CoSO47H2O, ZnSO47H2O, CdSO48H2O, Pb(NO3)2, UO2SO43H20.
Научная новизна.
Установлены концентрации металлов, влияющие на рост клеток бактерий
рода Bacillus. Количественно охарактеризована способность бактерий
аккумулировать тяжелые металлы в условиях in vitro и in vivo. Установлено влияние металлов на изменение размеров и структуры микроорганизмов. Доказано, что на поверхности бактерий рода Bacillus аккумулируются соединения металлов Co, Zn, Pb, Cd.
Разработана методика квантово-химического исследования различных механизмов связывания тяжелых металлов в комплексы с аминокислотами, низкомолекулярными пептидами (металлотионеинами) и фосфолипидами мембран бактерий. Для всех типов биомолекул установлен ряд ионов тяжелых металлов по эффективности образования комплексов. Найдено, что важным физико-химическим фактором, определяющим эффективность биоаккумуляции металла, является его термодинамическая стабильность в водном растворе, мерой которой может служить энергия гидратации иона. Биологический фактор ограничения эффективности биоаккумуляции металла – его токсичность по отношению к микроорганизмам. Прослежена корреляция тушения флуоресценции триптофана ионами Pb(II), Co(II), Zn(II), Cd(II), Mn(II), UO2(II) со способностью бактерий рода Bacillus к аккумуляции данных металлов.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Теоретическая значимость работы для физической химии состоит в
разработке методики исследования сложных биологических систем, включающей
обоснование и выбор квантово-химического приближения, допустимые
модельные ограничения, способ расчета энергий образования комплексов металлов с биомолекулами. Совокупность экспериментальных и теоретических
6 результатов характеризует токсичность и степень накопления ряда тяжелых металлов, а также влияние различных металлов на рост и морфологию клеток бактерий, образование спор.
Установленная корреляция тушения флуоресценции триптофана ионами Pb(II), Co(II), Zn(II), Cd(II), Mn(II) с количеством поглощенного бактерией металла in vitro может быть основой для создания методики экспресс-оценки загрязненности окружающей среды ионами тяжелых металлов. Практическим результатом исследования служит предложенный способ снижения содержания цинка и свинца в организме животных, который может быть использован в биологических и медицинских лабораториях (Патент RU № 2552052; заявка №617778. Заявлено 02.09.2013. Решение о выдаче патента от 10.11.2014., опубл. 10.06.2015, БИ № 7).
Достоверность полученных результатов подтверждается применением современных методов исследования, строгим контролем и проверкой каждого этапа исследования с помощью лицензированного программного обеспечения и сертифицированного научного оборудования; совпадением части полученных результатов с данными других исследователей, работающим по схожим направлениям.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Результаты по количественному накоплению металлов (Zn, Co, Cd, Pb, Mn,
Fe) бактериями рода Bacillus, а также по влиянию тяжелых металлов на
морфологию и рост клеток бактерий.
2. Результаты квантово-химических расчетов структуры и устойчивости
комплексов аланина, фосфолипидов и металлотионеинов с металлами (Zn, Co, Cd,
Pb). Анализ результатов и установление важнейших факторов, определяющих
эффективность аккумуляции тяжелых металлов бактериями.
3. Оценка эффективности применения пробиотиков в системе доставки и
выведения металла из организма крыс, на примере цинка.
Личный вклад автора заключается в проведении квантово-химических расчетов, анализе литературы, выборе методов расчета, обработке и интерпретации результатов. Эксперименты in vitro, атомно-силовая микроскопия, рентгенофлуоресцентный анализ и ИК-спектроскопия проведены лично автором. Подготовка публикаций выполнена совместно с научным руководителем.
Апробация работы, внедрение и публикации.
Основные результаты работы доложены на XX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013»,
7 Москва, 9-13 апреля 2013г.; II Всероссийской научно-методической конференции «Университетский комплекс как региональный центр образования, науки и культуры», Оренбург, 30 января-1 февраля 2013г.; XXI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2014», Москва, 7-11 апреля 2014г.; XXXII Всероссийском симпозиуме молодых ученых по химической кинетике, Московская обл., 17-20 ноября 2014 г.; XXII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2015», Москва, 7-11 апреля 2015г.; VII Всероссийской молодежной школе-конференции "Квантово-химические расчеты: структура и реакционная способность органических и неорганических молекул", Иваново, 14-17 апреля 2015г.; XXVII Симпозиуме “Современная химическая физика”, Туапсе, 20 сентября-1 октября 2015г.; X Всероссийской конференции "Высокореакционные интермедиаты химических и биохимических реакций", Черноголовка, 12-15 октября 2015г.; XXVIII Симпозиуме “Современная химическая физика”, Туапсе, 19 - 30 сентября 2016г.; V Всероссийской научно-практической конференции «Математическое моделирование процессов и систем», Стерлитамак, 17-19 ноября 2016г., а также на внутривузовских конференциях и семинарах Оренбургского государственного университета.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 18 работ, в том числе 7 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК, тезисы 10 докладов на международных и всероссийских конференциях, 1 патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и четырех приложений. Текст иллюстрирован 35 рисунками и 19 таблицами, список использованной литературы составляет 175 источников. Общий объем диссертации составляет 139 машинописных страницы.
Неспецифические методы накопления металлов. Комплексы металлов с фосфолипидами. Строение клеточной мембраны и ее роль в накоплении металлов на поверхности клетки
Способность накапливать и удалять металлы из организма известна среди растений [4-6], грибов и микроорганизмов [7-19]. Установлено, что пурпурные несерные бактерии (Rhodobacter spp., Rhodopseudomonas spp.) и пурпурные серобактерии (Ectothiorhodospira spp.) способны аккумулировать более 99.7 % ионов меди, цинка, никеля, а также более 30 % ионов ртути при содержании в среде 100 мг/л ионов металлов, проявляя разную устойчивость к этим металлам. Еще более высокую способность к биосорбции ионов металлов проявляют зеленые водоросли Chlorella spp. [20]. P.pseudoalcaligenes достаточно хорошо аккумулирует ионы свинца и меди, их количества достигают 1 ммоль/г и 0.8 ммоль/г сухой биомассы соответственно [12]. Некоторые представители рода Acinetobacter, например, штаммм A.baumannii UCR-2971 способны аккумулировать ионы свинца в количестве до 0.05 ммоль/г сухой биомассы [21]. Гриб Rhizopus fungi накапливает рекордное количество цинка, меди, кадмия, свинца и урана – до 25 % от сухой биомассы клеток. Его родственник Rhizopus arrhizus способен в еще большей степени поглощать уран – до 180 мг/г биомассы [22, 23]. Гриб Amanita muscaria способен накапливать кадмий. В его спорах содержится металла до 29.9 мг/кг сухой биомассы при том, что в среде, где он растёт, содержание металла достигает 0.4 мг/кг [24]. Молюск Argopecten purpuratus отличается "сверхспособностью" к накоплению меди – до 201.14 мг/г сухой массы. Простейшее животное акантария строит свой скелет из минералов, в частности, целестина (сульфат стронция). Но содержание стронция в воде ничтожно мало – до 0.0008 %. Некоторые из морских губок способны извлекать золото из его солей, которого содержится в воде до 0.0000000004% [25]. Устрица Crassostrea rhizophora способна аккумулировать такие металлы, как: медь – до 526.1 мкг/г, кадмий – до 8.29 мкг/г, никель – до 1990.9 мкг/г и цинк – до 4733 мкг/г сухой биомассы [26, 27].
Известно, что высшие растения могут извлекать тяжелые металлы из почвы и накапливать их в тканях или на поверхности листьев [1, 4-6, 22, 28-39]. Так представители семейства гвоздичных накапливают медь, перцы способны аккумулировать кобальт. Для березы карликовой и лишайников характерен высокий процент накопления цинка, а для вероники и лишайников – никеля и меди. Способностью к накоплению молибдена обладают растения семейств Бобовые, Зверобойные, Норичниковые и Сложноцветные [1]. Среди злаковых растений выявлена способность к накоплению ионов меди, цинка и свинца. Так, например, пшеница способна накапливать медь в количестве до 2.01 мг/кг, цинк – до 20.6 мг/кг и свинец – до 0.19 мг/кг от массы сухого вещества, а ячмень – до 2.6; 15.1 и 0.2 мг/кг соответственно [4, 5, 28]. Для некоторых растений также характерны рекордные величины по накоплению металлов. Например, водяной орех накапливает ионов марганца до 108000 мг/кг сухой биомассы, а растения семейства Крестоцветные способны накапливать ионы цинка до 13630амг/кгп[1]. В организм животных тяжелые металлы поступают преимущественно с пищей. Незначительная часть может поступать через легкие. Основное количество поступившего в организм металла накапливается преимущественно в печени и почках. Также установлено, что лимфатическая система тоже может участвовать в детоксикации тяжелых металлов и накапливать их [40, 41]. Воздействие тяжелых металлов приводит к таким неблагоприятным последствиям, как уменьшение веса животного, снижение иммунитета организма. Кроме того, мясо животного, в котором содержатся тяжелые металлы, нельзя употреблять в пищу.
Металл накапливается клетками в два этапа [42, 43]: 1) Неспецифическое присоединение катионов металлов к органическим молекулам, входящим в состав клетки или выделяемым ей в среду. Данная фаза не зависима от энергии клетки. Она обусловлена сорбцией металлов клеточной стенкой и мембраной бактерии, в состав которых могут входить фосфолипиды, хитин, хитозан и другие органические молекулы. 2) Следующая фаза, более медленная, зависимая от энергетического состояния клетки. Это специфическое, внутриклеточное накопление металлов при участии мембранных переносчиков ионов [44]. В качестве переносчиков в данном случае выступают белки. Во всяком случае, существует два способа накопления металла микроорганизмами: на поверхности клетки (внеклеточный, поверхностный) и внутри клетки (внутриклеточный).
Рентгенофлуоресцентный анализ
Для исследования таких сложных систем как биологические объекты (соли тяжелых металлов и аминокислот, комплексы металлов с фосфолипидами и т.д.) в настоящий момент времени не существует разумной альтернативы методам теории функционала плотности (DFT), принимая во внимание ресурсоемкость расчетов и требования к надежности расчета энергетических характеристик. Такой подход при использовании, например, гибридных функционалов плотности дает достаточно точные результаты со средней погрешностью порядка ±3 ккал/моль [120].
При выборе функционала мы опирались на данные работы [121], в которой рассматриваются различные функционалы плотности для моделирования комплексов аминокислот с разными металлами. Авторы установили, что наилучшими функционалами для расчета таких систем с использованием DFT-формализма являются функционалы плотности B3LYP, PBE, B3P86. Поэтому в настоящей работе использован один из наиболее популярных и широко используемых функционалов B3LYP, хорошо себя зарекомендовавший на широком многообразии исследуемых систем. 2.9.1.1 Выбор базисного набора для моделирования низкомолекулярных систем
В рамках данного исследования было необходимо описать ряд соединений металлов, входящих в третий 3d (Co, Zn), четвертый 4d (Cd) и шестой 6p (Pb) периоды периодической таблицы. При моделировании столь разных систем важно выбрать такой базисный набор, который хорошо описывал бы все металлы. Для элементов шестого и седьмого периода на данный момент доступно лишь небольшое число базисов. В основном все они остовные (ECP – Effective Core Potential) [122]. Базисы для расчетов систем, содержащих атомы четвертого и последующих периодов таблицы Менделеева, должны учитывать релятивистские эффекты для получения точных значений энергии атомов и их соединений. Известно, что ECP плохо описывают такие экспериментальные данные, как спектры поглощения рентгеновских лучей [123, 124]. Для (1s-4f) важность релятивистских эффектов не столь значительна, поэтому ими можно пренебречь [125].
Возможным подходом к учету этих эффектов является использование полноэлектронных скалярных релятивистских базисов [123]. Потенциальной проблемой в полноэлектронных вычислениях, включающих элементы пятого ряда и выше, является высокая сложность расчетов. Наиболее хорошо себя зарекомендовали ANO-RCC-DZP наборы базисных функций [126-132]. Однако для расчета систем с использованием базисных наборов, состоящих из натуральных атомных орбиталей (ANO), требуется очень большое количество ресурсов, доступное только на больших кластерах. Поэтому оптимальным решением является использование базиса DZP, построенного на гауссовых примитивах. По результатам работы [123], где сравниваются энергии ионизации, полученные с использованием данного базиса, а также ANO и UWTBS, установлено, что энергии, полученные с использованием DZP, лишь немного уступают в точности ANO. Доказано хорошее соответствие теоретических и экспериментальных длин связей, гармонических колебаний (см-1) и энергий длин связей для основного состояния некоторых диатомных молекул металлов шестого периода. Не менее важным обстоятельством при выборе базиса DZP может быть время расчета (таблица 2 [123]).
Табл. 2 – Сравнение времени работы CPUa (мин) при расчете энергий в приближении DKH2-B3LYP с использованием Gaussian 09 Молекула Базисный набор DZP-DKH0 DZP+ld-DKHc UGBSlVe ANO-RCC-DZPd AuF 3.1 3.2 9.8 170.6 AuCl 3.2 3.3 11.0 174.6 AuBr 3.4 3.5 15.9 283.8 Aul 3.5 3.6 19.1 333.4 T1C1 3.0 3.1 13.1 205.1 PbO 3.0 3.1 12.2 217.7 At2 3.3 3.5 50.8 236.7 aРабочая станция (Xeon 2.66 GHz quad-core processor, 16 GB RAM). b Базисный набор DKH, сгенерированный в следующих работах [133, 134]. c Базисный набор DKH, сгенерированный в следующих работах [133, 134] + добавленная диффузная функция. dANO-RCC-DZP базисный набор, сгенерированный в следующих работах [126, 127]. eUGBS1V базисный набор, сгенерированный в следующей работе [135].
Для того чтобы убедиться в достоверности получаемых результатов при использовании базиса DZP, нами предварительно произведена тестовая оптимизация геометрической структуры ацетилацетонатных комплексов кобальта, цинка, кадмия и свинца (Рисунок 9), и проведено сравнение (таблица 3) рассчитанных длин связей Me-O с известными данными [136-140]. Ацетилацетонатные лиганды связываются с ионом металла бидентатно, аналогичный тип связывания имеет место в аддуктах металлов с аминокислотами и, по-видимому, с фосфолипидами. Как видно из данных табл. 3, результаты, полученные с помощью базисного набора DZ как минимум не хуже данных различных ECP базисов. Помимо этого, при использовании базиса DZP, хорошо воспроизводится пирамидальная структура комплекса Pb(acac)2 (рисунок 8). Межатомные расстояния Pb-O, рассчитанные в приближении B3LYP/DZP, несколько меньше экспериментальных, однако это – скорее позитивный результат. В работе [136] отмечается, что в кристалле ион Pb дополнительно связан с атомами O других комплексов, что не учитывается в наших расчетах и что должно слегка увеличивать межатомные расстояния между центральным ионом и лигандом. Несколько иная ситуация реализуется в кристалле Cd(acac)2: один из атомов кислорода каждого acac лиганда формирует дополнительную мостиковую связь Cd-O-Cd с соседним атомом металла, что приводит к искаженной октаэдрической конфигурации лигандов. Такое окружение не может быть воспроизведено в наших расчетах, поэтому межатомные расстояния Cd-O несколько занижены по сравнению с экспериментальными данными [139].
Адекватность геометрического описания исследуемых соединений в приближении B3LYP/DZP подтверждается также хорошим соответствием экспериментального (Берестова Т.В., неопубликованные данные) и теоретического ИК-спектров бис-аланинанта кобальта (Рисунок 8). Рассчитанные частоты колебаний в теоретических ИК-спектрах использовали без учета поправочного масштабирующего коэффициента, применяемого для коррекции систематических ошибок, обусловленных ограниченностью размера базисного набора функций. Из рис. 8 видно, что метод B3LYP/DZP корректно воспроизводит не только положение полос поглощения, но и их относительную интенсивность (табл. 3.1).
Определение фаз роста бактерий при совместном культивировании с солями тяжелых металлов
Известно, что бактерии имеют различные пределы устойчивости к солям металлов, находящихся в питательной среде. Слишком большое содержание солей металлов будет тормозить или даже останавливать рост бактерий, стимулируя бактерии к образованию спор. Поэтому на ранних этапах исследования биоаккумуляции металлов необходимо определение минимально-подавляющих концентраций солей металлов (МПК). МПК – это минимальная концентрация соли металла, при которой бактерии еще размножаются, не погибают и не переходят в покоящиеся формы. Увеличение концентрации соли металла выше МПК приведет к подавлению роста бактерий. Определение МПК необходимо для дальнейшей работы, так как последующее определение способности к биоаккумуляции металла, а также определение фаз роста происходило при минимальных подавляющих концентрациях.
Из данных, представленных в таблице 6, видно, что ионом металла, оказывающим наименьшее влияние на рост микроорганизмов, является свинец. Так B.subtillis 7048 растут в диапазоне концентраций до 210-2 моль/л, B.licheniformis 7038 и B. clausii растут вплоть до 510-3 моль/л. Наиболее токсичным оказался кадмий – B.licheniformis 7038 и B. clausii растут в диапазоне концентраций до 3.9110-5 моль/л, B.subtillis 7048 – до 1.5610-4 моль/л. Остальные металлы оказывали неоднозначное действие на исследуемые микроорганизмы. Преимущественно цинк, кобальт, железо и марганец оказывали подавляющий эффект на все пять штаммов в диапазоне концентраций от 1.5610-4 до 510-3 моль/л. На некоторые из штаммов воздействие было более сильным и смещалось в сторону уменьшения концентрации, например, B.subtillis 7048 росли при концентрации цинка и марганца до 3.1310-4 моль/л. На другие штаммы воздействие было слабее, например, B.licheniformis 7038 и B.clausii росли при концентрации кобальта и железа до 1.2510-3 моль/л.
Анализ полученных данных (таблица 6) позволяет сделать вывод, что из исследуемых микроорганизмов рода Bacillus самым чувствительным видом по отношению ко всем используемым металлам является B.clausii. Однозначно выделить наиболее устойчивый вид бактерий рода Bacillus ко всем исследуемым металлам невозможно, так как разные виды бактерий растут при разных концентрациях солей металлов. Полученные концентрации позволяют сделать вывод о степени токсичности того или иного металла. По анализу данных, представленных на рисунке 12, можно сделать вывод, что наиболее токсичным металлом из исследуемых в отношении бактерий рода Bacillus является кадмий. Металлом, проявляющим наименьшую токсичность из всех, является свинец, так как при больших концентрациях солей свинца бактерии продолжают расти.
По результатам эксперимента определены рабочие концентрации солей тяжелых металлов, позволяющие создавать оптимальные условия для роста исследуемых микроорганизмов. Процесс накопления металлов микроорганизмами осуществляется в стационарной фазе роста. Это связано с тем, что во время жизни микроорганизмов происходит накопление токсичных продуктов, а также истощение субстрата, что вынуждает бактерии приступить к поиску других источников энергии, а также к детоксикации среды обитания. В связи с этим следующим этапом нашей работы являлось определение фаз роста с целью выявления оптимального времени роста в периодической культуре, а также влияния солей тяжелых металлов на динамику роста исследуемых микроорганизмов. По полученным результатам для каждого штамма были выстроены кривые роста (рисунок 14). Следует отметить, что разброс оптических плотностей для разных штаммов (рис. 13) и разных металлов (рис. 15-17) не играет существенной роли, так как целью эксперимента является установление временных диапазонов различных фаз роста бактерий, смена которых схематично показана на рисунке 14. Разброс оптических плотностей объясняется неидеальностью условий измерения оптической плотности. При измерении оптических плотностей не учитывается, что некоторые металлы поглощаются бактериями или образуют соли с органическими молекулами, выделяемыми клетками в среду.
Квантово-химическое моделирование комплексов фосфолипидов с металлами
На основании результатов, полученных с использованием ААСФ, можно сделать заключение, что всеми исследуемыми штаммами B.subtilis 7048, B.licheniformis 7038 и B.clausii избирательно аккумулируется свинец, железо и кобальт, практически не аккумулируется цинк, кадмий и марганец. Очевидно, что наблюдаемая закономерность обусловлена совокупностью нескольких факторов, в частности, физико-химических, определяющих силу взаимодействия ионов тяжелых металлов с биомолекулами, а также биологических, учитывающих влияние тяжелых металлов на жизненные функции клетки. В настоящей работе изучены физико-химические аспекты биоаккумуляции тяжелых металлов, а именно эффективность связывания ионов тяжелых металлов клеткой или органическими продуктами ее жизнедеятельности с помощью современных методов вычислительной квантовой химии. При исследовании физико-химических закономерностей биоаккумуляции тяжелых металлов мы исходили из нескольких предположений о механизмах накопления металлов микроорганизмами. Первое – бактерии целенаправленно извлекают катионы металлов из среды, связывая их с органическими молекулами (белками, пептидами). Затем такие комплексы накапливаются на поверхности и внутри клеточной стенки бактерии. В такой форме металлы становятся неопасными для клеток бактерий. Второе – катионы металлов неизбирательно присоединяются к заряженным остаткам фосфорной кислоты молекул фосфолипидов, тейхоевой (липотейхоевой) кислоты. При таком присоединении может нарушаться проницаемость мембран, уменьшаться ее подвижность. Накопление металлов на поверхности клеток негативно влияет на микроорганизмы. Это вынуждает бактерии приспосабливаться к новым условиям, в результате чего происходит уменьшение размеров клеток и, возможно, изменение строения клеточной мембраны. На фотографиях, полученных с помощью атомно-силового микроскопа (рисунок 23), видно, что клетки уменьшаются в размерах, в результате чего снижается площадь соприкосновения. Чем меньше площадь соприкосновения, тем ниже негативное воздействие. Также некоторые бактерии переходят в покоящиеся формы -споры. Третье - связывание ионов тяжелых металлов может осуществляться бактериями с помощью специфических защитных механизмов, в частности, специальными низкомолекулярными белками с высоким содержанием цистеина - металлотионеинами.
В соответствии с данными предположениями были изучены три физико-химические модели связывания ионов тяжелых металлов аминокислотами на примере L-аланина - раздел 4.1 и L-триптофана - раздел 4.2, фосфолипидами -раздел 4.3 и металлотионеинами - раздел 4.4. Расчеты прочности образующихся комплексов проводили в полноэлектронном приближении B3LYP/DZP. Несмотря на принципиальные различия в строении лигандов, во всех случаях наблюдались качественно одинаковые закономерности эффективности связывания ионов металлов: Zn2+ Со2+ « РЬ2+ (результаты для Cd2+ заслуживают отдельного анализа, см. ниже). В работе дано простое и непротиворечивое объяснение наблюдаемому ряду устойчивости комплексов биомолекул с ионами металлов. Энергетическая предпочтительность комплекса в значительной степени определяется термодинамической стабильностью иона металла в водной среде. Чем прочнее аква-комплекс иона металла, тем больше энергии нужно затратить на разрушение гидратной оболочки, что напрямую отражается на величине энергии комплекса иона металла с биомолекулой. Прочности связей иона с реакционными центрами биолигандов (N, О- в аминокислотах, О- в фосфолипидах, S - в металлотионеинах) определяют абсолютную величину энергии комплекса, но не нарушают ряд стабильности, приведенный выше. В качестве иллюстрации антибатной связи энергий гидратации катионов металлов в водной среде и энергий образования комплексов можно привести рисунок 34, построенный по результатам исследования эффективности связывания ионов металлов металлотионеинами.
Действительно, для ионов цинка и кобальта энергия гидратации велика, что снижает энергию образования комплекса с биомолекулой. Напротив, для иона свинца характерна наименьшая энергия гидратации, он легче «сбрасывает» сольватную оболочку и, следовательно, образует более прочные комплексы.
Фактор стабильности комплекса очень важен, но он не может быть единственным, определяющим эффективность биоаккумуляции металлов. Известно, что тяжелые металлы токсичны в катионной форме. Образование комплекса – обратимый процесс 1, поэтому связанные биомолекулами ионы металлов должны переходить в неактивную и безопасную для бактерий форму. По-видимому, важным механизмом такой защиты клетки является адсорбция комплексов металлов на поверхности клеточной мембраны. Эксперименты, проведенные с использованием АСМ, показали, что на поверхности бактерий B.licheniformis 7038 аккумулируются соединения металлов Co, Zn, Pb, Cd (рисунок 23). Фотографии, полученные с помощью атомно-силовой микроскопии, свидетельствуют о большом накоплении соединений свинца, что хорошо согласуется с результатами ААСФ. На поверхности клеток наблюдается значительное количество образований, которое можно связать с соединениями свинца. К сожалению, метод АСМ лишь подтверждает накопление соединений металлов на поверхности бактерий, но не дает информации, в какой форме металлы существуют. Интересно отметить, что токсичность металлов по отношению к живым организмам увеличивается в ряду Mn Fe Zn Co {UO2} Pb Cd [172-174]. Данный ряд не разграничивает эукариот от прокариот. Однако, данный ряд хорошо коррелирует с установленными в настоящей работе закономерностями изменения энергий комплексов ионов металлов с биомолекулами и с энергиями гидратации ионов металлов. Ионы свинца очень токсичны в форме катионов.