Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Квантовые точки в зонной теории. Уравнение Брюса 9
1.2. Особенности оптических свойств квантовых точек 11
1.3. Применение квантовых точек в качестве флуоресцентных биометок 13
1.4. Синтез квантовых точек селенида кадмия и квантовых точек структуры ядро-оболочка 14
1.5. Перевод квантовых точек из органических растворителей в водные растворы 18
1.6. Применение квантовых точек в иммуноанализе в качестве флуоресцентных меток 22
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 24
2.1. Вещества и материалы 24
2.2. Характеристика свойств квантовых точек 25
2.3. Синтез конъюгатов для проведения иммуноанализа 27
2.4. Подготовка носителей, методики проведения анализа и обработки результатов 28
ГЛАВА 3. Синтез и характеристика нанокристаллов селенида кадмия 33
3.1. Синтез квантовых точек селенида кадмия в водном растворе... 33
3.2. Увеличение стабильности растворов гидрофильных квантовых точек 35
3.3. Получение квантовых точек CdSe гексагональной и кубической структуры в органическом растворителе и характеристика их свойств 36
3.4. Оптимизация процесса очистки квантовых точек CdSe 42
ГЛАВА 4. Наращивание оболочек более широкозонных полупроводников на ядрах селенида кадмия 45
4.1. Получение квантовых точек состава CdSe/ZnS 47
4.2. Исследование влияния параметров синтеза на квантовый выход флуоресценции, морфологию и кристаллическую структуру квантовых точек CdSe/ZnS 4$
4.3. Улучшение воспроизводимости наращивания оболочек ZnS на ядрах CdSe 55
4.4. Получение квантовых точек состава CdSe/CdS/ZnS 56
4.5. Влияние послойного наращивания оболочки на оптические свойства полученных квантовых точек 58
4.6. Влияние размера ядер селенида кадмия на положение максимума флуоресценции КТ состава CdSe/CdS/ZnS 62
4.7. Изменение яркости флуоресценции квантовых точек в процессе послойного нанесения оболочек
ГЛАВА 5. Перевод квантовых точек из органических растворителей в водные растворы 68
5.1. Метод перевода квантовых точек в водные растворы путём замены исходных лигандов на меркаптопропионовую кислоту 70
5.1.1. Отработка воспроизводимой методики 70
5.1.2. Увеличение стабильности водных растворов квантовых точек 73
5.1.3. Изменение в спектрах флуоресценции квантовых точек после перевода в водные растворы 74
5.2. Метод перевода квантовых точек в водные растворы путём покрытия амфифильными полимерами 76
5.2.1. Получение амфифильных полимеров 76
5.2.2. Получение гидрофильных квантовых точек и изучение их свойств 87
5.2.3. Очистка водных коллоидных растворов квантовых точек от избытка полимера 91
ГЛАВА 6. Разработка тест-методов для определения зеараленона с применением квантовых точек в качестве флуоресцентных меток 95
6.1. Конъюгация квантовых точек с иммунореагентами 96
6.2. Сравнение твердофазного иммуноанализа с пероксидазой хрена и квантовых точек в качестве метки 98
6.3. Разработка иммунофлуоресцентного колоночного тест-метода 101
6.4. Аналитические характеристики колоночных тест-методов 104
Выводы 107
Список литературы
- Применение квантовых точек в качестве флуоресцентных биометок
- Синтез конъюгатов для проведения иммуноанализа
- Получение квантовых точек CdSe гексагональной и кубической структуры в органическом растворителе и характеристика их свойств
- Влияние послойного наращивания оболочки на оптические свойства полученных квантовых точек
Введение к работе
Актуальность работы. Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (или квантовые точки - КТ) находят широкое применение в самых разных приложениях биоанализа - от иммунохимических тест- методов до визуализации тканей и отслеживания лекарственных веществ в организме. Благодаря уникальным оптическим свойствам - зависимость цвета эмиссии от состава и размера КТ, высокая фотостабильность, широкие спектры поглощения - КТ всё чаще вытесняют используемые ранее органические красители.
В связи с высокой востребованностью КТ публикуется много работ по усовершенствованию методик их синтеза с целью создания нанокристаллов с улучшенными свойствами. В последнее время наметилась тенденция получения КТ из доступных и стабильных реагентов путём использования воспроизводимых методик. Кроме того, важной проблемой остаётся перевод КТ из органических растворителей (в которых получают нанокристаллы) в водные растворы без потери яркости и коллоидной стабильности. На сегодняшний день опубликован ряд работ по применению КТ в качестве меток в твердофазном иммуноанализе и лишь единичные работы посвящены применению КТ в иммунохимических тест-методах.
В данной работе основное внимание уделено получению КТ с различным цветом свечения; улучшению яркости флуоресценции КТ путём оптимизации условий синтеза; переводу КТ из органических растворителей в водные растворы; применению КТ в твердофазном иммунофлуоресцентном анализе и тест-методах.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является получение и модификация квантовых точек структуры ядро/оболочка на основе селенида кадмия и их применение в качестве флуоресцентных меток в иммунохимическом анализе. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
отработать методики получения квантовых точек структуры ядро- оболочка состава CdSe/ZnS и CdSe/CdS/ZnS c длиной волны максимума флуоресценции в интервале 520-650 нм, что соответствует цвету свечения от зелёного до красного; осуществить выбор оптимальных параметров синтеза для воспроизводимого получения КТ с высокой яркостью флуоресценции;
разработать методики перевода КТ из органического растворителя в водные растворы двумя способами: методом замены лигандов и путем покрытия амфифильными полимерами; синтезировать амфифильные полимеры для гидрофилизации КТ; установить оптимальные условия для перевода КТ в водные растворы; выбрать наиболее подходящий путь получения гидрофильных КТ для использования в качестве биометок;
сравнить показатели твердофазного иммунофлуоресцентного анализа (КТ в качестве меток) и иммуноферментного анализа (пероксидаза хрена в качестве метки) на примере количественного определения микотоксина зеараленона;
разработать неинструментальный колоночный тест-метод с применением флуоресцентных квантовых точек CdSe/ZnS в качестве биометок; оптимизировать методики проведения анализа на примере визуального детектирования микотоксина зеараленона в пшенице.
Методы исследования. Для решения поставленных в работе задач применяли комплекс физико-химических методов исследования (люминесценция, УФ-, ИК-, видимая адсорбционная спектроскопия, дифрактометрия, электронная микроскопия) и иммунохимических методов анализа (твердофазный иммунохимический анализ на полистироловых микропланшетах, иммунохимические тест-колонки с сефарозой 4В и полиэтиленовыми фритами в качестве носителей). Научная новизна состоит в следующем:
отработаны методики получения квантовых точек структуры ядро- оболочка состава CdSe/ZnS и CdSe/CdS/ZnS с длиной волны максимума флуоресценции от 520 до 650 нм;
разработан новый подход к увеличению стабильности коллоидных водных растворов КТ, покрытых тиокислотами, основанный на химическом связывании растворенного кислорода в ходе его реакции с сульфитом натрия;
синтезированы амфифильные полимеры из недорогих и доступных реагентов; отработана методика перевода КТ из органического растворителя в водные растворы путём покрытия амфифильным полимером;
проведена сравнительная оценка твердофазного иммуноанализа при использовании в качестве меток КТ и фермента на примере количественного определения микотоксина зеараленона;
разработан неинструментальный колоночный тест-метод для визуального детектирования зеараленона с применением КТ в качестве меток.
Практическая значимость работы.
В результате проведённых исследований были разработаны методики получения флуоресцентных КТ с цветом свечения от зеленого до красного и тест-системы с применением КТ в качестве биометок для анализа микотоксинов. Разработан новый подход к повышению стабильности водных коллоидных растворов КТ. Синтезированы новые амфифильные полимеры для покрытия КТ. Показано, что полученные КТ могут быть использованы в качестве меток в твердофазном иммуноанализе как в планшетном, так и в тест-вариантах.
На защиту автор выносит:
Оптимизированную методику получения КТ ядро/оболочка из стабильных и доступных реагентов.
Новый подход к повышению стабильности водных коллоидных растворов КТ, покрытых меркаптокислотами, на основе химического связывания растворенного кислорода.
Методику синтеза амфифильного полимера и покрытия им КТ для перевода нанокристаллов из органического растворителя в водные растворы.
Разработанный иммунохимический тест-метод с применением КТ в качестве флуоресцентных биометок.
Личный вклад соискателя заключается в постановке задач исследования, выборе методов синтеза и модификации КТ, непосредственном проведении экспериментов, обобщении полученных результатов, формулировании выводов.
Публикации. По теме данного исследования опубликовано 12 печатных работ: 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 - в сборнике статей, 7 тезисов докладов, из них 4 - на Международных конференциях; получено положительное решение о выдаче патента на изобретение.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на следующих конференциях: Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 20102011» (Россия, Москва, 2010, 2011), Всероссийская научная школа-семинар «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине - 2011» (Россия, Саратов, 2011), 5th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (Czech Republic, Prague, 2011), XIth International Conference on AgriFood Antibodies (Austria, Vienna, 2012), Всероссийская школа- конференция «Химия биологически активных веществ» молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием «ХимБиоАктив-2012» (Россия, Саратов, 2012), Конференция с международным участием по аналитической спектроскопии (Россия, Туапсе, 2012), International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics and Biophysics SFM 2012 (Россия, Саратов, 2012).
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 147 ссылок. Работа изложена на 118 страницах, содержит 56 рисунков и 14 таблиц.
Финансовая поддержка работы осуществлялась проектами: гранты РФФИ (12-03-91167, 11-03-93963, 12-03-92699), грант ДААД (A/10/73533, 2011), программой У.М.Н.И.К. (№ 01201268968).
Применение квантовых точек в качестве флуоресцентных биометок
Для получения КТ, способных образовывать стабильные коллоидные водные растворы, существуют два основных пути: либо синтезируют КТ непосредственно в водной фазе [33,35,45]; либо полученные в органических растворителях КТ затем переводят в водные растворы одним из следующих путей [14,17,46]: модификация лигандного слоя, покрывающего КТ; с помощью полной замены исходного лигандного слоя на гидрофильные молекулы. Синтез в органических растворителях позволяет получать КТ с высокой яркостью флуоресценции, однако дальнейший перевод в водную фазу часто приводит к значительному снижению яркости свечения [17,23]. Синтез в водных растворах позволяет получить гидрофильные КТ, однако по ряду характеристик, таких как квантовый выход флуоресценции, распределение частиц по размерам и стабильность во времени, они существенно уступают полупроводниковым КТ, полученным в органических фазах [33]. Таким образом для применения в качестве биометок КТ чаще всего синтезируют при высоких температурах в органических растворителях.
Впервые КТ CdSe в органическом растворителе были получены в 1993 г. научной группой Murray и др. [47]. Основной принцип синтеза -впрыскивание растворов прекурсоров металла Cd и халькогенида Se в нагретый до высоких температур координационный растворитель -триоктилфосфин оксид (ТОФО). При высоких температурах прекурсоры распадаются до мономеров, образуется пересыщенный раствор, результатом становится образование кристаллов. При этом температура реакционной смеси падает после впрыскивания прекуросоров, так как прекурсоры имеют комнатную температуру. Из-за падения температуры реакционной среды не происходит зарождения новых ядер, а образовавшиеся ядра начинают расти за счёт оставшихся в растворе прекурсоров. На рис. 1.5. показано изменение спектра поглощения реакционной смеси во время синтеза [48]. С увеличением времени синтеза происходит смещение спектра поглощения в длинноволновую область, что свидетельствует о росте кристаллов CdSe. При этом растворителем служил ТОФО, молекулы которого связывались с поверхностными атомами КТ и создавали стерический барьер между отдельными нанокристаллами, благодаря чему не происходила коагуляция частиц и их дальнейшего роста.
Со времен опубликования работы [47], методику видоизменяли, поддерживая основную идею метода - впрыскивание холодных прекурсоров в горячий растворитель, тем самым разделяя во времени стадии зародышеобразования и роста кристаллов. В частности, была показана возможность замены токсичных и неустойчивых прекурсоров (диэтил кадмия и триоктилфосфин селена) на более стабильные — ацетат, старат, олеат кадмия, раствор селена в октадецене (ОДЕ) [36-38,49,50,51]. Кроме того, в целях снижения затрат на синтез КТ в ряде работ заменяли ОДЕ на более доступные стеарин, парафин, дизельное топливо [52-54].
Также описаны методики синтеза КТ в органических растворителях, в которых оба прекурсора CdSe смешивают при комнатной температуре, затем температуру реакционной смеси поднимают до 200-220С. В этом случае необходимо подобрать стабильные прекурсоры, которые начинают распадаться на мономеры одновременно только при определённой температуре [14,55,56]. Данный подход является перспективным для приготовления КТ в больших количествах, когда быстрое впрыскивание н о
В последнее время много работ посвящено изучению влияний условий синтеза CdSe на кристаллическую структуру полученных КТ. Селенид кадмия кристаллизуется в двух структурах - гексагональной (структура вюрцита) и кубической (структура сфалерита) [39,57,58]. Было установлено, что использование ряда лигандов, таких как триоктилфосфин, фосфониевые кислоты, амины приводят к образованию КТ CdSe со структурой вюрцита. Для получения КТ структуры сфалерита чаще всего применяют раствор селена в ОДЕ в качестве прекурсора селена и не вводят в реакционную смесь перечисленные выше лиганды [38,39,59]. Важно отметить, что были разработаны способы оценки диаметра КТ и концентрации их растворов по спектрам поглощения, причём как было показано в работе [37] найденные зависимости для КТ CdSe с разной кристаллической структурой значительно различаются. Ядра CdSe имеют невысокую яркость флуоресценции - их квантовый выход (KB), как правило, не превышает 5% [60]. При использовании в процессе синтеза аминов в качестве лигандов получают КТ CdSe с KB —10% [61].
Для повышения KB и фотостабильности флуоресцирующие ядра CdSe покрывают слоем более широкозонного полупроводника со схожими структурой и составом. Оболочка более широкозонного полупроводника не поглощает свет, испущенный флуоресцирующим ядром [32]. В КТ структуры ядро-оболочка внешний слой более ширикозонного полупроводника пассивирует поверхность флуоресцирующего ядра - уменьшает число свободных валентностей, которые могут служить ловушками для носителей заряда, тем самым значительно повышая KB флуоресценции [12,32,15,62]. Также оболочка пространственно отделяет экситон флуоресцирующего ядра от окружающей среды, таким образом уменьшается чувствительность оптических свойств к внешним изменениям. В результате КТ структуры ядро-оболочка обладают значительно большим KB и фотостабильностыо по сравнению с исходными ядрами CdSe [61,63,64].
Схожая кристаллическая структура оболочки и ядра — необходимое условие, иначе не будет происходить равномерного наращивания, а разница в структурах может приводить к дефектам на границе фаз. Для покрытия ядер селенида кадмия используют более широкозонньте полупроводники, такие как сульфид цинка, сульфид кадмия, селенид цинка. Последний считается лучшей оболочкой для селенида кадмия, так как из-за большой величины ширины запрещённой зоны (3.8 эВ для микрокристаллического сульфида цинка, 1.74 эВ для микрокристаллического селенида кадмия) ни электроны, ни дырки не переходят из ядер (CdSe) в оболочку сульфида цинка [65,66]. Кроме того, селенид кадмия и сульфид цинка не склонны к образованию твёрдых растворов [67], что также важно в целях удержания экситона внутри флуоресцирующего ядра.
Однако сульфид цинка как правило, наращивают только на небольших ядрах селенида кадмия (при d(CdSe) 3 нм). Согласно [67] наращивание оболочки "ZnS на ядрах CdSe большего диаметра затруднительно из-за большой разницы в параметрах кристаллических решёток CdSe и ZnS. Ранее были опубликованы методы наращивания ZnS на CdSe с использованием токсичных и нестабильных прекурсоров, таких как диэтил цинка, бис(триметилсилил)сульфид [61,62,68]. Недавно было показано, что использование более доступных и менее токсичных реагентов также может давать неплохие результаты для создания структур ядро-оболочка состава CdSe/ZnS [55,69].
Для того, чтобы избежать дефектов, возникающих при наращивании ZnS непосредственно на ядрах CdSe диаметром более 3 нм, между ядром и сульфидом цинка помещают промежуточный слой - наращивают оболочку селенида цинка или сульфида кадмия, которые имеют промежуточные между CdSe и ZnS параметры кристаллической решётки и величину запрещённой зоны [32,63]. При создании подобных структур ядро-оболочка-оболочка часто используют метод послойного наращивания (Successive Ion Layer Adsorption and Reaction (SILAR)). Суть метода заключается в попеременном добавлении прекурсоров металла и халькогенида в раствор КТ CdSe при высоких температурах [63,70,71]. Такой подход позволяет избежать зарождения нанокристаллов материала оболочки и позволяет с высокой точностью контролировать количество нанесённых слоев.
Синтез конъюгатов для проведения иммуноанализа
Конъюгат ЗЕА с овальбумином (ЗЕА-ОВА) был синтезирован по стандартной методике с использованием N-гидроксисукцинимида и N,N -дициклогексилкарбодиимида для активации карбоксильных групп гаптена [10]. N-гидроксисукцинимид (400 мкмоль, 46 мг) и N,N -дициклогексилкарбодиимида (600 мкмоль, 125 мг) растворяли в 2,5 мл ДМФА. 500 мкл полученного раствора добавляли к 400 мкл раствора ЗЕА-КМО в ДМФА (с концентрацией 48 мкмоль/мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов и оставляли на ночь при 4С. Выпавший осадок удаляли центрифугированием. Затем 400 мкл активированного ЗЕА-КМО (8.5 мкмоль) добавляли по каплям в раствор, содержащий 7 мг ОВА (-0.15 мкмоль), растворённого в смеси ФСБ (2 мл) и ДМФА (0.4 мл). Мольное сотношение гаптена к белку составляло 56:1. Непосредственно перед реакцией раствор белка охлаждали при 4С в течение 20 мин. Полученную смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре, после чего оставляли на ночь при 4С. Для удаления несвязавшихся низкомолекулярных компонентовм смеси были использованы концентрирующие колонки для белка 20 мл/9К. В качестве промывочного буфера использовали ФСБ. Концентрации полученных конъюгатов определяли спектрофотометрически. Полученный конъюгат ЗЕА-ОВА (0,4 мг/мл) хранили при температуре -18С.
Для приготовления конъюгата ЗЕА с пероксидазой хрена (ЗЕА-ПХ) использовали методику, аналогичную описанной выше, однако мольное соотношение активированного гаптена к ферменту составляло порядка 5:1. Раствор активированного ЗЕА-КМО (59.2 мкл, 1.25 мкмоль) добавляли по каплям к 2 мл раствора ПХ в карбонатном буфере (рН 9.6), содержащего 11 мг (0.25 мкмоль) ПХ.
После очистки с помощью концентрирующих колонок для белка (20 мл, 9К) конъюгат ЗЕА-ПХ (2.4 мг/мл) смешивали с глицерином в объёмном соотношении 1:1 и хранили при -18С.
Конъюгация КТ с антителами антн-ЗЕА и с ЗЕА-ОВА. Для конъюгации КТ с биомолекулами использовали подходы, описанные в [100,107]. Для приготовления моноклональных антител анти-ЗЕА, меченных КТ, использовали мольные соотношения (N-гидроксисукцинамид): (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид): КТ: (Anti-ЗЕА или ЗЕА-ОВА)= 50:50:1:5. N-гидроксисукцинамид (92 мг, 800 мкмоль) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (124 мг, 800 мкмоль) растворяли в 1 мл ДМФА. Смесь была разбавлена в 1000 раз с помощью ДМФА для получения раствора с концентрацией 0.8 мкмоль/л. В данном методе использовали КГ состава CdSe/ZnS, покрытые МПК и дБСА. Раствор КТ CdSe/ZnS в бикарбонатном буфере, рН 8.3 (800 мкл, -3.2 Ю- мкмоль КТ) добавляли к 20 мкл раствора N-гидроксисукцинамида и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида в ДМФА (-1.6x10 місмоль) и перемешивали на шейкере в течение 45 мин. К полученной реакционной смеси по каплям добавляли раствор анти-ЗЕА или ЗЕА-ОВА в ФСБ (176 мкл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов и оставляли на ночь при 4С. После этого растворы диализовали в ФСБ при 4С в течение двух дней для удаления непрореагировавших низкомолекулярных компонентов. Затем в реакционную смесь добавляли 10-ти кратный избыток раствора глицина в ФСБ (1 М) для прекращения реакции и блокировки всех непровзаимодействовавших активированных СООН групп. Смесь выдерживали в течение 1.5 часов при 37С, после этого очищали от избытка глицина с помощью диализа в ФСБ (при 4 С в течение двух дней). Полученные конъюгаты хранили при 4С и были использованы в дальнейшем в иммунохимических тест-колонках и при проведении флуоресцентного твердофазного иммунохимического анализа (ИХА) на планшетах.
Для приготовления геля с антителами использовали бромцианактивированную (CNBr) сефарозу 4В, которая позволяет легко иммобилизовать на неё антитела за счёт ковалентного связывания. При получении такой сефарозы образуются активные имидокарбонаты, которые в слабощелочной среде реагируют с аминогруппами белка, образуя N-замещённые имидокарбонаты, производные изомочевины и N-замещённые эфиры карбамиловой кислоты.
Приготовление геля с привитыми вторичными антителами Для приготовления геля 0.5 г CNBr-активированной сефарозы 4В промывали на стеклянном фильтре 100 мл раствора 1 мМ НС1, добавляли вторичные антитела {кроличьи антимышиные антитела) (150 мкл, 2.5 г/л) и 450 мкл связывающего буфера (0.1 М NaHC03, 0.5 М NaCl, рН 8.3) и перемешивали 2 часа с помощью шейкера при комнатной температуре. Избыток антител удаляли промыванием геля 5 мл связывающего буфера. Для блокирования оставшихся на поверхности сефарозы активных групп добавляли 6 мл блокирующего агента (0.2 М глицина в бикарбонатном буфере, рН 8.0) и оставляли гель при периодическом помешивании на 2 часа при комнатной температуре. Далее гель промывали в 3 цикла чередованием 0.1 М ацетатного буфера, содержащего 0.5 MNaCl (рН 4.0) и связывающего (буферные растворы брали в объёме 5 мл). Приготовленный гель суспендировали в ФСБ (1:3 по объёму) и хранили при 4С.
Приготовление геля с блокированными активными группами Для приготовления геля требуемое количество CNBr-активированной сефарозы 4В (2 г сухого материала даёт приблизительно 7 мл геля) взвешивали и промывали на стеклянном фильтре, используя 1 мМ НС1 (400 мл на 2 г вещества). Для блокирования активных групп добавляли пятикратный избыток блокирующего агента (0.2 М глицина в бикарбонатном буфере, рН 8.0) и оставляли гель при периодическом помешивании на 2 часа при комнатной температуре. Далее гель промывали в 3 цикла чередованием 0.1 М ацетатного буфера, содержащего 0.5 М NaCl (рН 4.0) и связывающего (добавляли пятикратный избыток каждого буфера). Приготовленный гель суспендировали в ФСБ (1:3 по объёму) и хранили при 4С. Приготовление геля с привитыми антителами анти-ЗЕА Для приготовления геля 0.5 мл геля с привитыми вторичными антителами было добавлено к 1 мл геля с блокированными активными группами, помещённого в 3 мл колонку с полиэтиленовым фритом на дне. Затем в колонку добавляли аликвоту раствора первичных антител анти-ЗЕА (25 мкл) и осторожно перемешивали. Через пять минут раствор удаляли из колонки, и полученный гель промывали дважды раствором ФСБ (1,5 мл). После этого 3 мл ФСБ добавляли для разбавления геля.
Методика проведения иммунофлуоресцентного анализа (ИФлА) в тест-колонке с гелевым наполнителем
Для приготовления детектирующего иммунослоя смесь геля с привитыми антителами анти-ЗЕА и геля с блокированными активными группами (в объёмном отшении 1:35) помещали в колонку с фритом на дне и промывали трёхкратным объёмом ФСБ. После этого гель суспендировали в ФСБ (1:3 по объёму). 200 мкл этой смеси переносили в колонку объёмом 1 мл и помещали между фритами. Колонку промывали раствором ФСБ и хранили при 4С.
Для проведения анализа 1 мл стандартных растворов ЗЕА, приготовленных в ФСБ, или 1 мл разбавленного экстракта образца пропускали через приготовленную колонку. Затем промывали колонку 4 мл раствора Твина 20 в ФСБ (0.05% по объёму). После этого добавляли 100 мкл конъюгата ЗЕА-ОВА-КТ (разбавленные 1:30 раствором ФСБ, содержащим 0.2% БСА и 0.05% Твин-20) и выдерживали 6 мин. Избыток конъюгата удаляли пропусканием 3.5 мл ФСБ через колонку, после этого проводили визуальное детектирование флуоресценции под УФ лампой (365 нм). Методика проведения ИФлА на полиэтиленовых фритах Вначале проводили активацию полиэтиленовых подложек (фритов) согласно рекомендации производителя Senova GmbH (Jena, Germany) [104]. Сначала проводили дегазацию фильтров путём выдерживания их в этаноле в ультразвуковой ванне (15 мин), затем фриты помещали в колонки и проводили их активацию путём пропускания через них 300 мкл смеси этанол/вода (50:50 по объёму), 300 мкл воды и 600 мкл карбонатного буфера. После этого на фрит помещали 200 мкл раствора вторичных антител (разбавленных до концентрации 5 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9.5) и инкубировали колонку в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем поверхность фрита блокировали выдерживанием в 3% растворе казеина в ФСБ (500 мкл на каждый фрит) в течение 15 мин. После этого фрит промывали 600 мкл раствора Твин 20 в ФСБ (0.05% по объёму). Затем 200 мкл раствора антител анти-ЗЕА (разбавление 1:2000) помещали на фрит, и колонки инкубировали в течение 6 мин. Несвязавшиеся антитела удаляли промывкой 1.5 мл раствора Твин 20 в ФСБ (0.05% по объёму).
Для проведения анализа стандартные растворы ЗЕА в ФСБ объёмом 1 мл или разбавленные экстракты образцов объёмом 1 мл пропускали через колонку. Затем колонку промывали 2 мл раствора Твин 20 в ФСБ (0.05% по объёму). После этого на фрит помещали 100 мкл раствора ЗЕА-ОВА-КТ (разбавленный 1:50 в ФСБ, содержащем 0.2% БСА и 0.05% Твин-20) и выдерживали 6 мин. Избыток конъюгата удаляли пропусканием 2 мл ФСБ через фрит. После стадии промывки проводили визуальное детектирование флуоресценции под УФ (365 нм).
Получение квантовых точек CdSe гексагональной и кубической структуры в органическом растворителе и характеристика их свойств
КТ CdSe имеют низкую яркость и стабильность (при хранении и при облучении светом) и непригодны для практического использования в качестве флуоресцентных биометок. В 1996 году было показано, что яркость флуоресценции КТ и стабильность их растворов могут быть значительно улучшены путём покрытия нанокристаллов слоем более широкозонного полупроводника [67]. КТ состава CdSe/ZnS были переведены в воду [13] и впервые сконъюгированы с биомолекулами, таким образом, была показана возможность практического применения КТ в биоанализе. Фактически именно после работ, посвященных созданию более ярких и стабильных КТ структуры ядро-оболочка [24,61,67,69] и началось бурное развитие в области применения КТ в качестве флуоресцентных биометок.
Основная задача оболочки из более широкозонного полупроводника -оградить флуоресцирующее ядро от окружающей среды: важно, чтобы и электрон, и дырка удерживались внутри ядра и не проникали в оболочку. Для удержания и электрона, и дырки внутри ядра необходимо, чтобы край зоны проводимости материала оболочки находилась вьппе края зоны проводимости ядра, а валентная зона - ниже (рис. 4.1.) [32]. Кроме того, для эффективного наращивания оболочек на столь малых нанокристаллах материал оболочки должен иметь сходство по структуре и составу с материалом ядра. Из вышесказанного ясно, что материалом для оболочек на CdSe могут служить халькогениды кадмия и цинка благодаря близости свойств и кристаллической структуры. Среди халькогенидов цинка-кадмия оптимальным материалом для оболочки CdSe является сульфид цинка,
Однако разница между параметрами кристаллической решётки селенида кадмия и сульфида цинка велика — 12% (табл. 4.1.) [17,63], что может вызвать напряжение на границе этих двух решёток, возникновение дефектов, и, как следствие, уменьшение KB флуоресценции.
Ранее было показано, что наращивание ZnS непосредственно на ядрах CdSe эффективно только в случае использования ядер малых размеров (d(CdSe) 3 нм), поскольку в этом случае разница в параметрах кристаллических решёток не столь критична [67]. Первоначально КТ CdSe/ZnS получали медленным добавлением прекурсоров серы и цинка к ядрам CdSe при высокой температуре; в качестве растворителя использовали ТОФО [61,69]. При этом применяли очень нестабильные прекурсоры, такие как диметил цинка, бис(триметилисилил) сульфид, которые требовали жёсткого соблюдения инертной атмосферы. В последнее время начали появляться работы по синтезу CdSe/ZnS с использованием более стабильных прекурсоров, таких как ацетат цинка [55], этилксантат цинка [65], диэтилдитиокарбамат цинка [118].
Для наращивания оболочек на ядрах с большим диаметром (d(CdSe) 3 нм) часто используют метод послойного наращивания оболочек (известный в зарубежной литературе как Successive Ion Layer Adsorption and Reaction (SILAR)). Суть метода послойного наращивания оболочек заключается в попеременном добавлении прекурсоров металла и халькогенида в раствор КТ CdSe при высоких температурах (200С - 250С) [62,63,74]. Ранее для нанесения оболочек прекурсоры вводили одновременно, при этом необходимо было обеспечить медленное добавление прекурсоров, чтобы исключить зарождение кристаллов материала оболочки. В методе SILAR рассчитывают количество прекурсоров, необходимое для наращивания одного монослоя и прекурсоры металла и халькогенида добавляют с некоторым временньш интервалом (5-15 мин). Чтобы избежать дефектов на стыке двух кристаллических решёток (селенида кадмия и сульфида цинка) между ними помещают слой селенида цинка или сульфида кадмия, которые имеют промежуточные между CdSe и ZnS параметры кристаллической решётки (табл. 4.1.).
Толщина одного монослоя, нм Тип кристаллической решётки Постоянная решётки, нм Ширина запрещённой зоны, Есо, эВ 0.28кубическая0.56682.69 0,35кубическая0.60772.49 0,31кубическая0.5413.61
Таким образом сочетание двух методов позволяет создавать оболочки более широкозонных полупроводников на ядрах CdSe любого диаметра: для увеличения яркости ядер CdSe маленького диаметра (d(CdSe) 3 нм) их непосредственно покрывают оболочкой ZnS, в случае ядер CdSe большего диаметера используют метод послойного наращивания с применением промежуточного слоя сульфида кадмия между ядром селенида кадмия и оболочкой ZnS.
Обзор публикаций показал, что в подавляющем большинстве работ, посвященных не только синтезу КТ структур ядро-оболочка с высокой яркостью (КВ 40%), но и дальнейшелгу применению этих КТ в качестве биометок, для нанесения оболочки сульфида цинка на CdSe продолжают применять диметил - диэтил цинка, силилсульфиды [68], в случае получения структур типа CdSe/CdS/ZnS оболочки более широкозонных полупроводников наносят на ядра CdSe, обладающие сами по себе высокой яркостью (-20-30%). Для получения таких ярких КТ используют дорогие и требующие строгих условий использования реагенты: фосфониевые кислоты, ТОФО [61,63].
KB флуоресценции КТ ядро-оболочка, полученных из более стабильных реагентов, как правило, не превышает 40%, при этом данные статьи содержат, как правило, только синтез КТ без последующего их применения в реальных системах в качестве флуоресцентных меток. Таким образом актуальной задачей является разработка методик наращивания оболочек ZnS и CdS/ZnS на ядрах CdSe с изначально малым KB ( 2%) с применением стабильных и доступных реагентов с целью получения КТ состава CdSe/ZnS и CdSe/CdS/ZnS с высокой яркостью флуоресценции (КВ 40%) для дальнейшего применения в качестве меток. В связи с этим задачами данной главы явились: - Оптимизация методики наращивания оболочки ZnS на ядрах CdSe путём исследования влияния основных параметров синтеза на KB флуоресценции, морфологию и кристаллическую структуру КТ; разработка воспроизводимой методики наращивания оболочки ZnS на ядрах CdSe. - Исследование влияния кристаллической структуры и размера исходных кристаллов CdSe на оптические свойства КТ структуры ядро-оболочка, полученных методом послойного наращивания.
Наращивание оболочки проводили в трёхгорлой колбе при постоянном контроле температуры в атмосфере аргона (Глава 2, рис. 2.1.). Для наращивания оболочки сульфида цинка сначала готовили прекурсоры цинка и серы. Прекурсор серы (0,1 М) был приготовлен растворением серы (0,002 моль, 0.064 г) в 20 мл ОДЕ при 150 С в атмосфере аргона. Прекурсор цинка (0.1 М) был получен растворением ацетата цинка (0.0015 моль, 0.275 г) в смеси 4 мл ОЛА и И мл ОДЕ при 120С в атмосфере аргона. Прекурсор цинка хранили в атмосфере аргона. Для непосредственного наращивания оболочки ZnS смесь прекурсоров серы и ОДЕ помещали в колбу, продували в течение 20 мин аргоном, затем добавляли прекурсор цинка и концентрированный раствор КТ CdSe в гексане. Концентрация КТ CdSe в реакционной смеси составляла 10 мкмоль. Температуру смеси поднимали до 140С, затем смесь выдерживали при этой температуре 1-4 часа при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки, и после охлаждали. К полученному раствору добавляли ацетон до образования стойкой опалесценции (У(ацетон):У(раствора КТ в ОДЕ) 2:1), после чего смесь центрифугировали при 4000 об. в течение 10 мин. Полученный осадок промывали ацетоном и растворяли в толуоле.
Влияние послойного наращивания оболочки на оптические свойства полученных квантовых точек
Ранее было отмечено, что при щелочном гидролизе полимеров ПМАО или ПСМА кольца малеинового ангидрида раскрываются с образованием карбоксильных групп, и полимеры становятся водорастворимыми (рис. 5.6. (а)). Таким образом, КТ, покрытые модифицированными полимерами, могут быть переведены в водные растворы.
Первоначально были предприняты попытки покрытия КТ полимером следующим образом: КТ структуры ядро-оболочка, растворённые в хлороформе, добавляли в хлороформовый раствор полимера ПМАО или ПСМА. Смесь оставляли для перемешивания на магнитной мешалке на ночь, затем растворитель медленно удаляли на роторном испарителе. К образовавшейся на стенках колбы плёнке добавляли щелочной раствор (рН 12) и смесь ставили в ультразвуковую ванну на 20 мин. В этих условиях только малая часть КТ покрывается полимером, о чём свидетельствует слабая флуоресценция полученного раствора. Основная масса КТ остаётся в виде осадка. Нагрев раствора при 75С не дал результата. Мы полагаем, что при этих условиях малеиновое кольцо не раскрывается, поскольку при проведении этой процедуры только для полимера (без КТ) полимер также не растворяется в щелочном растворе без длительного нагревания.
Поэтому КТ покрывали полимером по другой методике: КТ структуры ядро —оболочка, растворённые в хлороформе, добавляли к полимеру ПМАО (ПСМА), предварительно растворённому в хлороформе. Полученную смесь оставляли на магнитной мешалке на ночь. Использовали мольное соотношение п(КТ):п(ПМАО):п(ПСМА)= 1:40:100. На следующий день к раствору добавляли водный раствор щелочи, из расчёта п(КОН)=3 п(малеиновых групп). Для полимера ПСМА считали, что п(малеиновых групп)=5 п(ПСМА), для полимера ПМАО п(малеиновых групп)=100 п(ПМАО). Полученную эмульсию помещали на магнитную мешалку на 30 мин, затем на роторный испаритель и медленно удаляли хлороформ. При испарении хлороформа, КТ и полимер постепенно переходят в верхнюю водную фазу. При этом КТ переходят в раствор за счёт гидрофобного взаимодействия с углеводородными цепочками полимеров (рис. 5.12. (I-MI, I-MV)).
Водные растворы КТ, покрытые ПМАО, стабильны во времени и устойчивы в щелочных буферных растворах. KB полученных КТ падает на 25% по сравнению с KB этих КТ в толуоле (рис. 5.13), что гораздо лучше по сравнению с KB КТ, переведённых в воду путём замены лигандов на МПК. Кроме того, пик флуоресценции только незначительно смещается в длинноволновую область ( 1 нм). Стоит обратить внимание, что после перевода в воду с помощью МПК пик флуоресценции смещается на 2-5 нм в длинноволновую часть спектра. Это свидетельствует о том, что при покрытии КТ полимером поверхность КТ подвергается меньшему внешнему воздействию, чем в результате замены лигандов. КТ, покрытые ПМАО, в кислых средах выпадают в осадок. Связано это с тем, что растворы в данном случае стабилизированы за счёт электростатического отталкивания карбоксилат-ионов (рис. 5.12.(11)). При рН 6-7 карбоксильные группы не депротонированы, не заряжены, поэтому раствор теряет коллоидную стабильность и наблюдается образование осадка флуоресцирующих КТ.
Водные растворы КТ, покрытых ПСМА, стабильны только в щелочных растворах так же, как и КТ, покрытые ПМАО. Однако снять спектры флуоресценции КТ, покрытых ПСМА, не удалось, поскольку при разбавлении раствора для измерения флуоресценции, раствор терял коллоидную стабильность, и КТ выпадали в осадок.Возможно такая нестабильность связана со слишком большим различием в длине гидрофобных цепей исходных лигандов на поверхности КТ (С 18) и кумольных фрагментов полимера ПСМА (рис. 5.12.(1V)). Из-за этого гидрофобное взаимодействие между цепями очень слабое и при разбавлении растворов молекулы ПСМА отцепляются от гидрофобных КТ, что приводит к выпадению последних в осадок.
Для покрытия КТ ПЭГ-содержащим полимером использовали два подхода. По первой методике [85] КТ структуры ядро-оболочка, растворённые в хлороформе, смешивали с полимером и оставляли на магнитной мешалке на ночь. Затем хлороформ удаляли на вакуумном испарителе и полученную плёнку растворяли в воде или щелочном растворе в ультразвуковой ванне. В ходе оптимизации методики было выяснено, что важно удалять полностью следы хлороформа, поэтому после удаления видимой жидкости на роторном испарителе, колбу вакуумировали в течение часа с помощью вакуумного масляного насоса. Кроме того, для полного перевода КТ таким способом необходим большой избыток полимера. Например, КТ CdSe/CdS/ZnS ( (эмиссии) =610 нм) переходили полностью в водные растворы при мольном соотношении п(КТ):п(ПМАО)= 1:200. При использовании меньшего количества полимера КТ оставались в виде осадка.
