Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние сверхкритической флюидной хроматографии 10
1.1. Основные принципы и особенности сверхкритической флюидной хроматографии 10
1.1.1. Подвижные фазы для СФХ и их свойства 11
1.1.2. Бинарные смеси диоксида углерода как подвижные фазы в СФХ 14
1.1.3. Динамические модификаторы подвижной фазы в СФХ и их влияние на разделение и форму пиков 16
1.1.4. Характеристика неподвижной фазы в СФХ 20
1.2. Характеристика особенностей разделения в сверхкритической флюидной хроматографии 23
1.2.1. Растворяющая способность подвижной фазы 23
1.2.2. Элюирующая сила подвижной фазы 27
1.2.3. Модели удерживания в СФХ 30
1.3. Метод линейной зависимости свободной энергии 32
1.3.1. Основы метода линейной зависимости свободной энергии 32
1.3.2. Выбор тестовых соединений и дескрипторов 35
1.3.3. Возможности метода ЛЗСС для характеристики взаимодействий в сверхкритической флюидной хроматографии 36
1.4. Выводы 40
Глава 2. Экспериментальная часть 42
2.1. Аппаратура, реактивы и материалы 42
2.1.1. Аппаратура 42
2.1.2. Неподвижная фаза 43
2.1.3. Подвижная фаза 43
2.1.4. Тестовые соединения для ЛЗСС-анализа 44
2.2. Методика проведения ЛЗСС-эксперимента 48
2.2.1. Характеристика неподвижных фаз 48
2.2.2. Влияние сорастворителя 49
2.2.3. Влияние давления и температуры 50
2.2.4. Влияние динамических модификаторов 51
2.3. Методика анализа реальных объектов 51
2.3.1. Объекты исследования и определяемые природные соединения 51
2.3.2. Приготовление градуировочных растворов 51
2.3.3. Экстракционное извлечение аналитов 52
Глава 3. Характеристика исследуемых неподвижных фаз методом ЛЗСС 53
3.1. Характеристика неподвижных фаз без учета ионных взаимодействий 53
3.2. Характеристика неподвижных фаз с учетом ионных взаимодействий 56
Глава 4. Оценка влияния различных факторов на удерживание аналитов 60
4.1. Влияние давления и температуры 60
4.2. Влияние сорастворителя 78
4.3. Влияние кислоты 81
4.4. Влияние основания 90
4.5. Влияние соли 97
4.6. Влияние воды 103
Глава 5. Применение разработанных рекомендаций для оптимизации разделения ароматических кислот 113
5.1. Выбор неподвижной фазы 113
5.2. Выбор сорастворителя 114
5.3. Подбор оптимальных условий разделения 115
5.4. Валидация и апробация 119
Заключение 123
Список сокращений и условных обозначений 125
Список литературы 126
- Динамические модификаторы подвижной фазы в СФХ и их влияние на разделение и форму пиков
- Характеристика неподвижных фаз с учетом ионных взаимодействий
- Влияние основания
- Валидация и апробация
Динамические модификаторы подвижной фазы в СФХ и их влияние на разделение и форму пиков
Когда простое добавление сорастворителя в подвижную фазу недостаточно для разделения всех аналитов с хорошей формой пиков, то зачастую используется третий компонент в форме кислоты, основания или соли [46, 47]. Этот компонент называется «динамический модификатор» или «добавка» и вводится в значительно меньших концентрациях, чем сорастворитель (обычно 0,05-1%). Даже при низких концентрациях модификатора наблюдаются существенные улучшения формы пиков и изменения в удерживании [48].
Влиянию добавок на разделение посвящено множество работ, однако, их роль не всегда понятна и может совмещать несколько механизмов действия.
1) При изменении кислотности подвижной фазы, может изменяться состояние ионизуемых аналитов или участков неподвижной фазы. Сильная кислота может выступать как подавитель ионизации кислотных аналитов [49], а сильное основание – основных [50]. Следовательно, может наблюдаться усиление или подавление ионообменных взаимодействий между аналитом и сорбентом, что повлияет как на удерживание, так и на форму пиков.
2) Полярные добавки могут адсорбироваться на полярных участках неподвижной фазы, подавляя нежелательные взаимодействия между аналитами и, например, остаточными силанольными группами сорбентов на основе силикагеля, результатом чего является уменьшение удерживания и улучшение формы пиков [51].
3) С другой стороны, адсорбция добавки на неподвижной фазе может приводить к созданию дополнительных участков, способных к взаимодействию с аналитами, что приводит к увеличению удерживания [50, 52].
4) Добавки в сочетании с молекулами сорастворителя могут образовывать кластеры вокруг молекул аналита, увеличивая полярность в данной области, таким образом, увеличивая элюирующую силу подвижной фазы [53].
5) Ионная добавка того же заряда, что и ионизируемый аналит может играть роль вытеснителя при ионообменном механизме взаимодействия [51].
6) Анионы или катионы, образующиеся в результате диссоциации кислотной добавки, протонирования основной добавки или при добавлении соли, могут формировать ионные пары с аналитами-ионами противоположного знака. Присутствие ион-парного механизма элюирования отмечено в нескольких работах [54-56].
Эффект, который добавка окажет на удерживание, зависит и от природы самого аналита. Соединения с функциональными группами, которые могут взаимодействовать с активными участками неподвижной фазы, такими как остаточные силанольные группы, показывают намного большие различия в удерживании по сравнению с прочими аналитами [57]. Как уже упоминалось, в качестве добавок могут использоваться кислоты, основания и соли. Среди кислотных добавок широкое распространение получила трифторуксусная кислота [48, 49], однако, из-за подавления ионизации аналитов в ионном источнике масс-спектрометра часто используются также муравьиная [57, 58] или уксусная кислоты [59, 60]. В ранних работах использовались этансульфоновая и лимонная кислоты [49, 53, 61, 62], которые, однако, могут осаждаться в коммуникациях хроматографической системы после сброса давления [63].
Основные добавки также получили широкое распространение, особенно при разделении лекарственных препаратов, которые зачастую имеют основную природу. Наиболее распространенными добавками являются изопропиламин [50,64], диэтиламин и триэтиламин [65,66]. Аммиак также может использоваться, поскольку он не влияет на масс-спектрометрическое определение ввиду высокой летучести [67].
В то время как некоторые авторы предлагают совместное использование кислотных и основных добавок [68, 69], ряд исследователей предпочитает использование совместимых с масс-спектрометрическим детектированием летучих солей, таких как формиат или ацетат аммония в концентрации 1-20 ммоль/л сорастворителя [70-73].
Стоит отметить, что добавки следует использовать с осторожностью. После введения добавки в подвижную фазу, она, в первую очередь, адсорбируется на поверхности сорбента [74], а затем, когда неподвижная фаза будет насыщена, начнет элюироваться с колонки, что может сказаться на качестве базовой линии [75]. Кроме того, взаимодействия между сорбентом и добавкой могут быть настолько сильными, что изменения в удерживании могут наблюдаться продолжительное время после того, как было прекращено использование добавки [76, 77].
Следует сказать несколько слов об использовании воды в подвижных фазах на основе диоксида углерода. На заре существования СФХ вода использовалась как модификатор для улучшения элюирования полярных соединений [78-80], поскольку она не препятствовала пламенно-ионизационному детектированию. Однако из-за ограниченной смешиваемости воды и СО2 [81] она вносилась в очень малых пропорциях (до 1%). Когда в СФХ стали использоваться набивные колонки и схожие с ВЭЖХ методы детектирования, совместимость с пламенно-ионизационным детектором была уже не так важна, что в какой-то степени объясняет, почему вода была забыта на несколько лет и предпочтение отдавалось другим сорастворителям.
В настоящее время вода снова широко используется в качестве динамического модификатора благодаря её способности улучшать форму пиков полярных соединений [70, 82]. Кроме того, добавка воды может вызывать незначительные изменения в селективности, которые, однако, могут быть полезны при оптимизации разделения сложных многокомпонентных смесей [83]. Стоит упомянуть, что введение большого количества воды в элюент может привести к фазовому разделению. Максимально допустимая доля воды зависит от применяемого сорастворителя, в частности, использование метанола позволяет вводить до 10%об. воды, а использование изопропанола – вплоть до 50%об. Получающиеся таким образом подвижные фазы способны растворять крайне полярные соединения, например, недериватизированные аминокислоты [70, 84].
Механизмы воздействия добавок на разделение в СФХ на протяжении длительного времени являются объектом тщательного изучения. В частности, в ранних работах Бергера и Дая [53, 63], показано, что кислотные динамические модификаторы способствуют улучшению характеристик разделения аналитов-кислот, что объяснялось взаимодействием добавок с активными центрами сорбента и, отчасти, подавлением диссоциации аналитов. С другой стороны, основные модификаторы необходимы при анализе соединений основной природы [50, 85], что также объяснялось блокировкой активных центров.
В ряде аналитических работ хроматографические эффекты нескольких добавок сопоставляются на качественном уровне для определенного типа компонента в ограниченном наборе условий в ходе оптимизации разделения. Например, в работе [48] при оптимизации метода разделения гинзенозидов исследовалось влияние типа и концентрации добавок, а именно трифторуксусной кислоты, диизопропиламина и ацетата аммония. В данном случае наилучшего результата позволила достичь кислотная добавка, что авторы объясняют возможным протонированием как гидроксильных групп самих аналитов, так и силанольных групп неподвижной фазы. В работе [86] в ходе разработки метода анализа шестидесяти полярных компонентов изучался эффект девяти добавок, включающих органические кислоты, основания (ряд алкиламинов и гидроксид аммония), аммонийные соли и воду. В качестве оценочных параметров были использованы ширина пиков у основания и разрешение. Тем не менее, в данном исследовании не затрагивались механизмы взаимодействия добавок с неподвижной фазой или аналитами. В работе [65] с использованием функции Дерринджера было оценено влияние восьми различных добавок, включая воду, на характеристики удерживания 160 соединений. Для каждой добавки оценивались такие характеристики, как количество элюируемых соединений, число симметричных пиков, шум базовой линии УФ-детектора, средний отклик УФ-детектора и средний отклик МС-детектора. Аналогичным образом, механизм действия добавок не рассматривался, кроме того, авторы отмечают, что их выводы не являются универсальными, и для других аналитов могут наблюдаться иные закономерности.
Стоит отметить ряд работ [51, 55, 87], в которых изучался механизм элюирования арилсульфонатов натрия с использованием в качестве добавок различных солей (ацетаты лития, аммония, тетраметиламмония, тетрабутиламмония, хлорид аммония и др.). Авторы пришли к выводу, что в данном случае доминирующими механизмами удерживания были образование ионных пар аналитов с добавками, а также замещение протонов на поверхности сорбента молекулами добавок, что подтверждается данными ядерно-магнитного резонанса. Тем не менее, данные выводы также не являются универсальными.
Несмотря на то, что полученная в ходе подобных исследований информация очень важна для данного определенного типа разделения, она не позволяет с уверенностью утверждать, какая добавка будет предпочтительней при других условиях.
Характеристика неподвижных фаз с учетом ионных взаимодействий
Поскольку для определения вклада ионных взаимодействий в удерживание необходимо использовать соединения с ионизируемыми группами, на следующем этапе работы в дополнение к уже имеющимся были определены коэффициенты удерживания 17 аналитов кислотной и основной природы, предположительно, обладающих положительным или отрицательным зарядом в подвижной фазе диоксид углерода – метанол. Константы хроматографических систем, рассчитанные с использованием этих соединений, представлены во второй и третьей строках таблицы 6.
Из полученных данных следует, что использование уравнения 2.1 приводит к ухудшению статистических показателей, в частности, коэффициента корреляции, что свидетельствует о возможном вкладе ионных взаимодействий в удерживание аналитов. В то же время, использование уравнения 2.3 (стр. 47, п. 2.2.1.) даёт более высокий коэффициент корреляции, хоть и меньший, по сравнению с результатами для нейтральных соединений. Исходя из этого, в дальнейшей работе использовалось уравнение 2.3. На рисунке 9 представлены ЛЗСС-коэффициенты исследуемых неподвижных фаз, рассчитанных по уравнению 2.3.
В соответствии с полученными данными, использование уравнения 2.3 не привело к существенному изменению коэффициентов e, s, a, b и v, в частности, цвиттер-ионная фаза по-прежнему характеризуется наибольшими значениями a и e.
Представленные сорбенты обладают различной склонностью к взаимодействиям с протонируемыми (параметр d+) и депротонируемыми (параметр d–) соединениями. Для цианофазы и силикагеля нехарактерны взаимодействия с депротонируемыми аналитами (d– 0) и при этом весьма заметны противоположные (d+ = 0,67 и 0,35 соответственно). В отношении параметра d– это предсказуемо, так как эти два сорбента не обладают функциональными группами, способными обеспечить интенсивное взаимодействие с кислотными депротонируемыми компонентами по иным механизмам, кроме водородной связи. Высокое значение d+ для фазы BEH может быть объяснено наличием кислых силанольных протонов, что должно обеспечивать выгодный контакт с протонируемыми аналитами (например, аминами). Аналогичное поведение нитрильной фазы менее очевидно.
Этилпиридиновая и цвиттер-ионная фазы демонстрируют противоположное поведение: пренебрежимо малый вклад взаимодействий с протонируемыми аналитами (d+ 0) и достаточно высокий с депротонируемыми (d– = 0,27 и 0,32, соответственно). Наиболее вероятное объяснение этому – наличие в структуре сорбентов нуклеофильных функциональных групп: пиридиновой в случае фазы 2-EP и аниона сульфогруппы в случае цвиттер-ионной фазы. Эти группы способны вступать в сильное кислотно-основное взаимодействие с депротонируемыми аналитами, такими как фенолы или карбоновые кислоты.
Исходя из этого можно предположить, что для этих двух фаз будет наблюдаться схожая селективность, однако, ввиду большей величины вектора сольватации u для цвиттер-ионной фазы, аналиты будут удерживаться на ней сильнее. Для проверки этого предположения несколько аналитов с кислотными свойствами были введены в колонки в идентичных условиях (скорость потока 1 мл/мин, содержание метанола в подвижной фазе – 10%, температура – 25С, обратное давление – 150 бар), для них были определены времена удерживания tR и рассчитаны коэффициенты удерживания k (таблица 7, рисунок 10) [180].
Для данных соединений, в самом деле, наблюдается практически идентичный порядок выхода, за исключением кислот – производных нафталина. В случае Nucleodur HILIC наблюдаются более высокие коэффициенты удерживания кислотных аналитов, что хорошо коррелирует с данными ЛЗСС-анализа.
Стоит также отметить, что пики аналитов на цвиттер-ионном сорбенте имеют большую ширину у основания, по сравнению с этилпиридиновым сорбентом, вероятно, ввиду слишком сильных взаимодействий с сорбентом, однако, данное предположение пока не подтверждено. Тем не менее, ряд дополнительных экспериментов с меньшими концентрациями аналитов, а также с колонкой большего диаметра позволил исключить из числа возможных причин перегрузку колонки аналитом и пристеночный эффект.
Исходя из всего вышесказанного, можно заключить, что выбранные сорбенты характеризуются достаточно разнообразным поведением в СФХ, следовательно, можно полагать, что оценка влияния параметров состояния флюида на удерживания с их использованием будет достаточно показательной.
Влияние основания
Динамические модификаторы основной природы используется при оптимизации условий разделения основных соединений. В качестве таких добавок могут выступать низшие органические амины или гидроксид аммония.
В данной работе в качестве основной добавки использовался диэтиламин (ДЭА). В ходе эксперимента варьировалось содержание диэтиламина в сорастворителе – метаноле, и для каждой концентрации в соответствии с уравнением (2.3) рассчитывали дескрипторы. Полученные данные представлены в таблице 19 и на рисунке 20.
Так же, как и в случае с кислотной добавкой, введение в систему основного динамического модификатора практически не влияет на значения коэффициентов e, s, a, b, v, что может расцениваться как доказательство значимости взаимодействий с ионизируемыми группами в удерживании аналитов в условиях СФХ. Следовательно, необходимым становится использование расширенного набора дескрипторов, учитывающих такого рода взаимодействия.
Согласно полученным результатам, в случае немодифицированного силикагеля, цианофазы и цвиттер-ионного сорбента основная добавка приводит к существенному росту коэффициента d–, следствием чего является повышенное удерживание аналитов с кислотными функциональными группами. В то же время, для соединений с основными группами существенных изменений в удерживании не наблюдается (рисунок 21), что хорошо согласуется с тем фактом, что коэффициенты b и d+ не изменяются при введении диэтиламина [184-187].
При более детальном рассмотрении можно отметить, что для силикагеля коэффициент d– возрастает в большей степени по сравнению с цианофазой, что приводит к большим изменениям в удерживании (рисунок 22, 23).
В отличие от других неподвижных фаз, диэтиламин не оказывает существенного влияния на ЛЗСС-коэффициенты этилпиридинового сорбента. Этот эффект может наблюдаться вследствие того, что этилпиридиновый лиганд сам по себе экранирует активные силанольные группы, действуя аналогично основной добавке [5]. Тем не менее, для аналитов кислотной природы наблюдается увеличение времен удерживания, хоть и незначительное по сравнению с другими сорбентами (рисунок 24).
Поскольку введение в элюент динамического модификатора основной природы не должно приводить к увеличению рН выше 5, характерного для смесей CO2-MeOH без добавки [188], повышенное удерживание аналитов-кислот уже не может быть объяснено с позиций перехода из молекулярной в диссоциированную форму.
Валидация и апробация
Поскольку выбранные аналиты характеризуются сильно различающимися спектрами поглощения в УФ-области, для достижения максимальной чувствительности анализа использовалось многоволновое детектирование, при этом аналитические длины волн () выбирались максимально близко к положению максимума поглощения (max) исследуемых соединений (табл. 23). Изучение градуировочных растворов с концентрациями 0,2 – 20,0 мг/л показало соблюдение линейности градуировочных зависимостей площади пика от концентрации, описываемых уравнением вида "y = ax" с коэффициентом корреляции (R2) более 0,995 для всех компонентов. Оценка уровня шумов базовой линии (среднеквадратичное отклонение) позволила на основе 3 критерия (соотношение сигнал/шум, равное 3) рассчитать пределы обнаружения (ПО) аналитов. Пределы количественного определения (ПКО) определялись соответственно, с использованием 10 критерия (табл. 23). Полученные значения ПО для исследуемых соединений лежат в диапазоне 13,0-51,3 мкг/л. Существенное повышение чувствительности анализа достигнуто, в первую очередь, за счет реализации сверхбыстрого хроматографического разделения и использования сорбента с ультрамалым размером частиц, что обеспечивает минимальное размывание хроматографических зон [191, 192].
Для апробации разработанного подхода на реальных объектах были проанализированы различные сорта вин, содержащих, по литературным данным, значительные количества свободных бензойных и коричных кислот. Полученные хроматограммы (рис. 39) показывают отсутствие существенных интерференций со стороны матрицы даже при минимальной пробоподготовке, а также достаточную чувствительность метода. Поскольку некоторые сопутствующие компоненты экстракта элюируются после определяемых соединений, анализ может быть продлен до 4 минут, либо, при необходимости обеспечения максимальной экспрессности, требуется промывка хроматографической колонки сильным растворителем (метанолом). Такой подход требует минимального времени благодаря быстрому уравновешиванию системы в среде сверхкритического флюида [191, 192].
В исследованных образцах были обнаружены 4-гидроксибензойная, кумаровая, сиреневая и феруловая кислоты в концентрациях на уровне от 0,2 до 5 мг/л (табл. 24).
Статистическая обработка результатов параллельных определений показала хорошую воспроизводимость предложенного метода - стандартное отклонение несколько превышает 10% лишь для наиболее низких концентраций, что связано с погрешностями экстракционного извлечения.
Таким образом, показана применимость сверхкритической флюидной хроматографии в качестве высокоэффективного и экспрессного метода определения природных ароматических кислот в растительном сырье и продуктах его переработки. Представленные в главе 4 рекомендации позволили подобрать неподвижную фазу и состав элюента, обеспечивающие оптимальное разделение.
Наилучшие результаты достигаются при использовании в качестве неподвижной фазы силикагеля с привитыми 2-этилпиридиновыми группировками, а в качестве элюента – диоксида углерода с добавкой метанола и трифторуксусной кислоты.
Установлена возможность использования цвиттер-ионного сорбента в качестве неподвижной фазы для СФХ, коэффициенты удерживания которой по отношению к ароматическим кислотам линейно коррелируют с удерживанием на этилпиридиновой неподвижной фазе.
Применимость разработанного подхода продемонстрирована на примере анализа различных образцов вин.