Молекулярный обмен в биологических клетках по данным ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля Авилова Ирина Алексеевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 10

1.1. Общие понятия о мембране и транспорте веществ 10

1.2. Эритроциты 16

1.3. Фуллерены как биологически активные вещества 19

1.4. Общие понятия о методе ЯМР

1.4.1. Основы метода ЯМР 22

1.4.2. Самодиффузия 25

1.4.3. ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля 27

1.4.4. ЯМР ИГМП в многофазных системах с обменом

1.5. Возможности метода ЯМР ИГМП в исследовании биологических систем 34

1.6. Заключение 43

Глава 2. Объекты и методы исследования 45

2.1. Модельные биологические системы 45

2.2. Эритроциты крови мыши 46

2.3. Водорастворимые производные фуллерена С60 47

2.4. Метод ЯМР ИГМП 49

Глава 3. Водный обмен в модельных системах и эритроцитах. Латеральная диффузия в эритроцитарных мембранах 51

3.1. Водный обмен в модельных системах 51

3.2. Водный обмен в эритроцитах крови мыши 58

3.3. Латеральная диффузия в мембране эритроцитов 68

3.4. Заключение к главе 3 73

Глава 4 Самоорганизация водорастворимых производных фуллерена С60 в водных растворах 75

4.1. ЯМР ИГМП на ядрах 31Р 75

4.2. ЯМР ИГМП на ядрах 1Н 79

4.3. Оценка времени жизни ассоциатов в водных растворах 87

4.4. Заключение к главе 4 89

Глава 5. Взаимодействие водорастворимых производных фуллерена С60 с эритроцитами крови мыши 90

5.1.Заключение к главе 5 99

Выводы 100

Заключение 102

Благодарности 104

Список сокращений и условных обозначений 105

Список цитируемой литературы

• Фуллерены как биологически активные вещества
• Эритроциты крови мыши
• Водный обмен в эритроцитах крови мыши
• Оценка времени жизни ассоциатов в водных растворах

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Молекулярный и ионный обмен в биологических клетках является одним из основных процессов в живых организмах. Установление механизмов молекулярного обмена в биологических системах представляется весьма актуальной задачей.

В качестве модельных систем для исследования обменных процессов часто используются дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые являются ключевым элементом во многих технологических процессах перерабатывающих отраслей аграрно-промышленного комплекса. Проницаемость клеток дрожжей, в частности для воды, играет большую роль в интенсификации процессов брожения.

Особый интерес для изучения молекулярного обмена представляют эритроциты, так как они являются основным компонентом крови и выполняют ключевую роль в формировании ее реологических параметров. Диффузия воды и функциональных веществ через мембраны эритроцитов имеет принципиальное биологическое значение. Важным является установление механизмов проницаемости эритроцитов для воды, поскольку она играет ключевую роль в функционировании клеток. Изучение латеральной диффузии (т.е. движения молекул липидов, образующих мембрану клетки, по ее поверхности) дает более полное представление о состоянии клеточной стенки эритроцитов. Большое значение имеют исследования механизмов взаимодействия различных биологически активных соединений с эритроцитами, их влияние на структуру биомембран.

В последние годы внимание исследователей привлекают водорастворимые производные фуллеренов (ВПФ) как соединения, обладающие широким спектром биологической активности. Установлено, что производные фуллеренов проникают через биомембраны и могут накапливаться в клетках. Наряду с химическим строением ВПФ, важнейшим фактором, определяющим их биологические свойства, является состояние этих соединений в водном растворе. Как правило, фуллереновые производные в водных растворах образовывают ассоциаты. Актуальным является изучение самоорганизации производных фуллеренов в водных растворах и исследование механизма проницаемости данных соединений через мембраны, их накопление в клетке.

Выполнить комплексное исследование водного обмена, латеральной диффузии и диффузии водорастворимых производных фуллеренов в биологических клетках дает возможность метод ЯМР c импульсным градиентом магнитного поля (ЯМР ИГМП). Помимо этого, данный метод позволяет получить уникальную информацию о самоорганизации водорастворимых производных фуллеренов в растворах.

Целью работы являлось выявление с помощью метода ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля основных особенностей водного обмена и латеральной диффузии в биологических системах, а также механизмов образования фуллереновых агрегатов в водных растворах и способности этих агрегатов включаться в биологические мембраны и транспортироваться в них.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка способов оценки размеров клеток методом ЯМР в образцах клеточных культур в модельных системах.

2. Оценка проницаемости клеточных мембран методом ЯМР ИГМП в дрожжевых клетках и в эритроцитарных мембранах.

3. Исследование латеральной диффузии в мембранах эритроцитов.

4. Исследование самоорганизации фуллереновых молекул в водных растворах.

5. Исследование взаимодействия водорастворимых производных фуллерена С₆₀ с мембранами эритроцитов.

Научная новизна. Впервые показана возможность исследования механизмов взаимодействия фуллереновых производных с биологическими мембранами методом

Методом ЯМР ИГМП измерены коэффициенты латеральной диффузии липидов мембран эритроцитов, получены значения параметров, позволяющие оценивать размеры биологических клеток и проницаемость клеточной мембраны для молекул воды.

Установлена зависимость размеров ассоциатов биологически активных водорастворимых производных фуллерена Сбо от их концентрации в водных растворах.

Практическая значимость. Апробирован способ измерения проницаемости биологических мембран, основанный на методе ЯМР ИГМП. Получены величины проницаемости для молекул воды эритроцитов крови мыши в температурном диапазоне от 5 до 35оС. Данная методика может быть применена для исследования метаболизма в других биологических системах.

С использованием метода ЯМР ИГМП установлены различия процессов водного обмена в дрожжевых клетках, обладающих различными физиолого-морфологическими свойствами. Сравнительная оценка проницаемостей дрожжевых клеток является чрезвычайно важной с практической точки зрения для пищевой промышленности, так как может быть использована в качестве критерия для оценки способности различных штаммов дрожжей сбраживать концентрированные зерновые среды.

Установление зависимости размеров ассоциатов фуллереновых производных от их концентрации в водных растворах позволит регулировать процессы транспорта через клеточные мембраны, а также биодоступность этих соединений, что является важной задачей при создании эффективных лекарственных препаратов на основе водорастворимых производных фуллеренов.

Положения, выносимые на защиту:

6. Оценены размеры клеток и проницаемости биологических мембран для молекул воды на модельных клеточных системах (дрожжевых штаммах Y-3137 и Y-3327) и эритроцитах. Для эритроцитов крови мышей размер клеток 2.1 мкм, проницаемость изменяется от 0.3 до 0.510" м/с в температурном диапазоне от 5 до 35оС. Энергия активации проницаемости 24.1±1.9 кДж/моль, время жизни молекул воды внутри клетки 20 мс.

7. Измерены коэффициенты латеральной диффузии липидов эритроцитарной мембраны в интервале температур от 5 до 35оС, энергия активации самодиффузии липидов 25±2.9 кДж/моль. Область ограничений латеральной диффузии составляет -1.4 мкм.

8. Ряд водорастворимых производных фуллерена Сбо (с пятью фосфонатными аддендами, пятью фрагментами каптоприла, метилпиперазина, натриевая соль аддукта фуллерена Сeo с меркаптопропансульфоновой кислотой, производное С₆₀ с пятью фрагментами меркаптопропионовой кислоты) образуют ассоциаты в водных растворах. Водорастворимые производные фуллерена Сбо находятся в растворах в виде изолированных и агрегированных молекул, которые характеризуются различными коэффициентами самодиффузии. Рассчитаны гидродинамические радиусы и времена жизни ассоциатов производных фуллерена Сбо-

9. Коэффициенты самодиффузии водорастворимых производных фуллерена С₆₀ в суспензии эритроцитов: (8.5±1.8)10" м/с - производное Сбо с пятью фрагментами метилпиперазина; (6±1)10"¹² м²/с - натриевая соль аддукта фуллерена Сбо с меркаптопропансульфоновой кислотой; (5±1)10"¹² м²/с - производное С₆₀ с пятью фрагментами меркаптопропионовой кислоты, что близко к величинам коэффициентов

латеральной диффузии липидов эритроцитарной мембраны (5810^-12 м²/с). Производные фуллерена С₆₀ включаются в мембрану эритроцитов.

Достоверность полученных результатов. Полученные результаты для модельных систем совпадают с данными, приведенными в литературе. Экспериментальные результаты исследования воспроизводимы. Полученные экспериментальные данные согласуются с результатами аналогичных исследований, выполненных другими методами.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на российских и международных конференциях: «Магнитный резонанс и его приложения» (Санкт-Петербург, 2012, 2015); «Органические и гибридные наноматериалы» (Иваново, 2012, 2015); VI Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» (Троицк, 2014); Х международная конференция «Bimolecular NMR and related phenomena» (Санкт-Петербург, 2014); «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах. От эффектов в растворах к новым материалам» (Иваново, 2015); «Биомедицина, материалы и технологии XXI века» (Казань, 2015); международный симпозиум «Магнитный резонанс: от фундаментальных исследований к практическим приложениям» (Казань, 2016).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, индексируемых Web of Science, 11 тезисов докладов на всероссийских и зарубежных конференциях.

Личный вклад автора.

Совместно с к.б.н. Смолиной А.В. (лаб. ФХБФАС, ОКХиБП, ИПХФ РАН) и Солдатовой Ю.В. (лаб. ФХБФАС, ОКХиБП, ИПХФ РАН) автор диссертационной работы участвовал в получении образцов эритроцитов. Образцы водорастворимых производных фуллерена С₆₀ были предоставлены сотрудниками лаборатории ФМЭМ, ОКиК, ИПХФ РАН. Образцы клеток дрожжей были предоставлены ВНИИПБТ.

Подготовка образцов для ЯМР исследований, экспериментальные ЯМР ИГМП измерения и обработка полученных результатов были проведены диссертантом лично. Регистрация и расшифровка ЯМР спектров высокого разрешения растворов водорастворимых производных фуллерена С₆₀ были выполнены к.х.н. Черняком А.В. (лаб. ЯМР, АЦКП, ИПХФ РАН).

Постановка задачи, обсуждение полученных результатов, подготовка материалов для публикаций выполнены автором совместно с научным руководителем д.ф.-м.н., профессором Волковым В.И. (зав. лаб. ЯМР, АЦКП, ИПХФ РАН), к.ф.-м.н. Котельниковой Р.А. (зав. лаб. ФМЭМ, ОКХиБП), д.ф.-м.н. Котельниковым А.И. (зав. отделом ОКХБП, ИПХФ РАН) и к.х.н. Трошиным П.А. (зав. лаб. ФМЭМ, ИПХФ РАН).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и списка литературы, включающего 131 наименование. Работа содержит 122 страницы машинописного текста, в том числе 66 рисунков и 5 таблиц.

Фуллерены как биологически активные вещества

Мембранные липиды представляют собой смесь из нескольких сотен различных соединений [12, 13]. Наиболее распространенными являются фосфо- и гликолипиды, холестерин. Они имеют четко выраженную амфифильность, т.е. разделяются пространственно на полярную и неполярную части. В молекуле фосфолипида гидрофильная «головка» образована фосфатной группой, соединенной с остатком холина, этаноламина, серина. От головки отходят два гидрофобных «хвоста» – цепи жирных кислот. Большинство белков мембран представлены сложными белками (например, гликопротеины). Углеводы в мембране входят в состав сложных липидов и белков – гликолипидов и гликопротеинов. Распределение компонентов клеточной мембраны ассиметрично, т.е. различно во внешнем и внутреннем слое мембраны. Такая асимметрия обуславливает существование латеральной диффузии – самодиффузии молекул липидов в плоскости бислоя, которая связана со многими характеристиками биомембран (текучесть, упорядоченность, проницаемость). Поэтому исследованию процессов латеральной диффузии посвящен ряд работ [3, 13]. Как правило, такие исследования выполняются на модельных биологических мембранах, которые представляют собой моно- или бислойные липидные везикулы. Для изучения молекулярной подвижности липидов используются различные методы: оптические методики, методы флуоресцентного анализа, радиоактивных меток, ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Поскольку клетка является термодинамически открытой системой, которая непрерывно обменивается с окружающей средой веществом и энергией, то транспорт веществ через биологические мембраны является необходимым условием жизни. Важнейшим свойством биомембраны является избирательная проницаемость, т.е. способность пропускать одни вещества и не пропускать другие. Перенос веществ через биомембраны связан процессами метаболизма клетки, биоэнергетическими процессами, генерацией нервного импульса и др. Процессы мембранного переноса принято разделять на два основных типа: пассивный и активный.

За счет пассивного транспорта осуществляется перенос веществ по градиенту концентраций из области высокой концентрации в область низкой без затрат энергии (диффузия, осмос). Способы диффузионного переноса многообразны: диффузия жирорастворимых веществ через липидную часть мембраны, перенос гидрофильных веществ через поры, образуемые мембранными липидами и белками, облегченная диффузия с участием специальных молекул-переносчиков. В липидной фазе мембраны хорошо растворимы неполярные вещества: органические и жирные кислоты, эфиры, т.к. они обладают повышенным сродством к липидному бислою. В то же время полярные вещества (неорганические соли, сахара) плохо проходят через липидный бислой. Однако для воды величина проницаемости составляет порядка 10-6 м/с, которая является довольно большой для полярного вещества, нерастворимого в липидах [14]. Объяснение этому явлению было найдено с открытием аквапоринов – интегральных мембранных белков, формирующих поры в мембранах клеток, через которые избирательно пропускаются молекулы воды, позволяя ей поступать в клетку и покидать её, в то же время не пропускаются ионы и другие растворимые вещества [15]. В настоящее время установлено, что некоторые аквапорины пропускают и другие растворенные вещества (глицерин, мочевину, аммиак и др.) [16]. Таким образом, для воды существует два пути проникновения в клетку: через липидный бислой и через аквапорины.

Гидрофильные липидные и белковые поры обуславливают транспорт молекул веществ, нерастворимых в липидах, и водорастворимых гидратированных ионов, окруженных молекулами воды. Для таких веществ мембрана выступает в роли молекулярного сита: чем больше размер частицы, тем меньше проницаемость мембраны для этого вещества. Набор пор определенного радиуса обеспечивает избирательность переноса. [14]

Активный транспорт – это перенос вещества через биомембрану, протекающий против градиента концентрации (из области низкой концентрации в область высокой), т.е. с затратой свободной энергии (как правило, процесс гидролиза молекул аденозинтрифосфата – АТФ). Различные транспортные АТФазы локализованы в клеточных мембранах и участвуют в механизмах переноса веществ. Они являются основным элементом молекулярных устройств – насосов, обеспечивающих избирательное поглощение и удаление определенных веществ (например, электролитов) клеткой. С точки зрения термодинамики активный транспорт удерживает клетку в неравновесном состоянии. За счет него в клетке создаются разности концентраций, разности электрических потенциалов, давления [14].

В исследовании проницаемости биомембран для различных соединений используют ряд физико-химических методов: осмотические, основанные на измерении изменения объема клеток при помещении их гипер- или гипотонические растворы; индикаторные, основанные на изменении окраски клеточного содержимого при введении определенных веществ; химические, основанные на анализе состава внутриклеточного содержимого; метод меченых атомов, основанный на использовании радиоактивных и стабильных изотопов; и др. [17]. Активно применяются методики ЯМР для исследования строения молекул белков [18-20], входящих в состав биомембран, установления особенностей взаимодействия молекул липидов между собой и с холестерином [13, 19-21] и транспорта веществ через клеточную мембрану [22-24].

Особое значение имеет определение проницаемости клеточных мембран для лекарственных веществ. При создании лекарственных препаратов на основе новых классов химических соединений важным является установление механизмов их проникновения в клетки. Данное понятие включает в себя оценку взаимодействия соединений с клеточными мембранами, их влияние на липидную структуру мембран, накопление в клетке. Все это характеризует мембранотропные свойства лекарственных веществ. Решению данных вопросов посвящено большое количество работ [25-30]. Например, авторы [25] рассмотрели классы препаратов, оказывающих различное влияние на биологические мембраны. Они описали механизмы действия соединений, вызывающих дезорганизацию мембран или изменения проницаемости для катионов, оказывающих ингибирующее действие на связанные с мембраной ферменты. Большое значение имеют работы, посвященные изучению влияния различных антибиотиков на грамположительные [26, 27] и грамотрицательные бактерии [28]. В данных работах основное внимание уделено взаимодействию антибиотиков с мембранами бактерий и установлению путей их проникновения в клетку. Авторы работы [29] изучили влияние местных анестетиков, таких как бупивакаин, на липидную структуру мембран. Они установили корреляцию между содержанием анионных фосфолипидов в мембране и псевдоожижающим эффектом местных анестетиков.

Эритроциты крови мыши

В качестве модельных объектов исследования для отработки методики проведения экспериментов ЯМР ИГМП были выбраны дрожжи Saccharomyces cerevisiae рас Y-3137 и Y-3327. Исследуемые расы дрожжей, селекционированные и предоставленные ВНИИ пищевой биотехнологии, различаются по физиолого-морфологическим свойствам. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae Y-3137 обладают осмофильными и термотолерантными свойствами и способны сбраживать зерновое сусло с концентрацией растворимых сухих веществ до 26% при повышенных температурах (35-37С). Раса спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-3327 является осмофильной и выдерживает высокое осмотическое давление зернового сусла с концентрацией растворимых сухих веществ до 36%, обладает направленной биосинтетической способностью по отношению к этанолу, устойчива к повышенным концентрациям спирта до 17-18% об., оптимальная температура культивирования 30-32С.

Первый образец раса Y-3137. Родословная штамма: семейство Saccharomycetacea, род Saccharomyces Меуп, вид Saccharomyces cerevisiae. Штамм получен селекционным путем. Клетки дрожжей расы Y-3137 крупные, округлые, яйцевидной формы, реже овальной, удлиненной. Средний размер клеток 7.0-10.0 х 5.0-7.5 мкм. Дрожжи выращивали на солодовом сусле с концентрацией сухих веществ 15% при температуре 35С, время выращивания составляло 24 и 48 ч.

Второй образец раса Y-3327. Родословная штамма: семейство Saccharomycetacea, род Saccharomyces Меуп, вид Saccharomyces cerevisiae. Штамм получен методом селекции и мутагенеза. Клетки дрожжей расы Y-3327 округлые, реже овальной формы. Средний размер клеток 2x2 - 6x6 мкм. Дрожжи выращивали на солодовом сусле с концентрацией сухих веществ 15% при температуре 30С, время выращивания составляло 24 и 48 ч.

Клетки дрожжей промывали водопроводной водой и центрифугировали. Данную операцию повторяли 3 раза с целью отмывки клеток от питательной среды. Полученные образцы переносили в стандартные 5 миллиметровые ампулы, которые помещали в ЯМР-спектрометр.

Для исследования процессов водного обмена, латеральной диффузии, а также оценки взаимодействия водорастворимых производных фуллеренов с мембранами были выбраны эритроциты крови мыши. Выбор обусловлен тем, что мыши являются модельной системой одной линии и их развитие и состояние легко контролировать. Образцы клеток были предоставлены отделом кинетики химических и биологических процессов ИПХФ РАН. Приготовление образцов эритроцитов осуществляли по стандартной методике.

Забор крови производили от предварительно наркотизированной эфиром мыши посредством ее декапитации. В качестве антикоагулянта использовали 0,11 М раствор цитрата натрия (3.8% р-р цитрата натрия 5.5 водного : 3.8 г цитрата натрия (C6H5O7Na35,5 H2O + 100 мл воды). Кровь собирали в пробирку, куда предварительно добавляли раствор антикоагулянта, соблюдая соотношение цитрат/кровь – 1/5.

Кровь центрифугировали в течение 15 минут при 1500g (1000 об/мин). Плазму декантировали. Осадок эритроцитов осторожно ресуспендировали в изотоническом растворе NaCl (0.85% NaCl, содержащий 5 mM Na-фосфатный буфер, Ph=7.4). Операцию центрифугирования повторяли троекратно (второй и третий раз по 7 минут). После каждого центрифугирования супернатант декантировали, осадок эритроцитов ресуспендировали в новой порции изотонического раствора NaCl. Оставшийся на дне пробирки осадок – эритроцитарная масса. Отбирали 1 мл эритроцитарной массы и добавляли 1 мл изотонического раствора. Эритроцитарную массу, полученную после последнего центрифугирования, хранили в холодильнике при 4 оС не более 36 часов.

Для проведения ЯМР-экспериментов образцы дополнительно отстаивали в течение 3-4 часов. Отбирали 0.5 мл пробы и переносили в стандартные ЯМР-ампулы. При проведении измерений температуру образцов варьировали посредством ее понижения от 35оС до 5оС с шагом в 5оС, после каждого изменения температуры образцы термостатировали в течение 20 минут.

Водный обмен в эритроцитах крови мыши

Одной из основных задач предлагаемой работы является исследование методом ЯМР ИГМП процессов водного обмена в эритроцитах крови мыши. Образцы клеток эритроцитов для исследований были получены по методике, описанной в главе 2.

Коэффициенты самодиффузии измеряли на ядрах 1Н методом ЯМР ИГМП на частоте 400.22 МГц. Длительность импульсного градиента магнитного поля =1 мс, максимальная амплитуда импульса градиента магнитного поля g=11 Тл/м, интервал между импульсами градиента магнитного поля варьировался от 10 до 500 мс, число точек в диффузионном затухании 64. На рисунке 3.6 представлены протонные спектры суспензии эритроцитов при различных значениях амплитуды импульсного градиента поля g.

Наиболее интенсивный сигнал (рисунок 3.6а) с химическим сдвигом 4.7 м.д. принадлежит молекулам воды. Слабые сигналы, отчетливо проявляющиеся при больших величинах амплитуды градиента g, принадлежат мембране эритроцитов. Более интенсивные сигналы с химическими сдвигами 1.4 и 0.8 м.д. относятся к (СН2)n и СН3 группам липидов, соответственно [13, 130]. Сигналы в области 6-9 м.д. принадлежат к белковой компоненте эритроцитов (в частности, ароматические группы, NH и ОН группы) [130].

Были проанализированы диффузионные затухания (ДЗ) сигнала спинового эхо 1Н молекул воды. Примеры диффузионных затуханий, полученных при различных временах диффузии td и температурах, представлены на рисунке 3.7. а

Диффузионные затухания молекул воды в суспензии эритроцитов: а – при различных температурах (значения температур указаны во вставке, td = 20 мс); б – при различных временах диффузии (значения td указаны во вставке, температура 35оС).

Полученные диффузионные затухания носят сложный характер и описываются уравнением (1.16). Диффузионные затухания молекул воды в эритроцитах, как и диффузионные затухания в дрожжевых клетках, аппроксимировались суммой трех экспонент, которые характеризуются коэффициентами самодиффузии Ds1, Ds2, Ds3 и относительными долями молекул р1, р2, р3. Пример разложения диффузионного затухания молекул воды в суспензии эритроцитов на компоненты показан на рисунке 3.8. Разложение проводилось путем последовательного вычитания «хвоста» диффузионного затухания.

Анализ кривых ДЗ при различных временах диффузии td показывает, что величины населенностей р1, р2 и КСД Ds1, Ds2 зависят от времени диффузии td.

На рисунке 3.9 представлены экспериментальные зависимости Ds1, Ds2, Ds3 от времени диффузии td. На рисунке 3.10 приведена зависимость относительных долей молекул воды р1, р2, р3 от времени диффузии td. Рис. 3.9. Зависимость КСД Ds1, Ds2, Ds3 молекул воды в суспензии эритроцитов от времени диффузии td при 35оС.

Зависимость относительных долей молекул воды р1, р2, р3 от времени диффузии td при 35оС. Как видно из рисунка 3.9, с увеличением времени диффузии td КСД Ds1 и Ds2 уменьшаются, а величина Ds3 не меняется и по своему значению близка к КСД объемной воды. Также наблюдается уменьшение заселенностей р1 и р2 и увеличение величины р3 с ростом td (рисунок 3.10).

Как и в предыдущей части работы и [115, 116] выделено три типа воды в суспензии эритроцитов: объемная, межклеточная и внутриклеточная. В дальнейшем обсуждении основное внимание уделено внутриклеточной воде, поведение которой характеризуется Ds1 и р1.

На рисунке 3.11а приведены зависимости экспериментальных коэффициентов самодиффузии молекул внутриклеточной воды Ds1 от времени диффузии td при температурах 5, 20 и 35оС. Как видно из рисунка, зависимость Ds1(td) более пологая по сравнению с td-1. С использованием скейлингого подхода из уравнения (1.23) определены эффективные коэффициенты самодиффузии Dseff молекул воды при различных температурах. Параметры D0 и Dp составили: при 10оС D0=2.710-9 м2/с, Dp=2.510-12 м2/с; при 25оС D0=2.710-9 м2/с, Dp=4.510-12 м2/с; при 35оС D0=2.710-9 м2/с, Dp=6.010-12 м2/с. На рисунке 3.11б представлены полученные зависимости Dseff (td ) .

Зависимость экспериментальных КСД Ds(td) (a) и эффективных КСД Dseff (td ) (б) от времени диффузии td для внутриклеточной воды в эритроцитах при различных температурах. Значения температур указаны во вставках. Прямая линия на рисунке (б) пропорциональна td t-1 d

Как видно из рисунка 3.11б, Щ (td)octdl начиная с 20 мс. Также Df(td) не зависит от температуры образца. Что позволяет сделать вывод о том, что размер ограничений диффузии молекул воды а (размер клетки эритроцита) не меняется при изменении температуры. Размер ограничения диффузии а рассчитан из уравнения (1.22), и его величина составила 2.1 мкм.

При расчете Df(td)внутриклеточной воды в суспензии эритроцитов из уравнения (1.23) были получены значения КСД Dp- КСД молекул воды в режиме усреднения по всему объему образца. Для описания полученной температурной зависимости использовано уравнение Аррениуса. В этом случае температурная зависимость КСД молекул воды имеет вид: Еп D= V0 ехр( ) (1.26) RT где Д) - независящая от температуры постоянная, ED - энергия активации самодиффузии, R - универсальная газовая постоянная, Т - абсолютная температура. Из наклона этих зависимостей в координатах \n(D) - \1Т определяют параметр ED.

На рисунке 3.12 представлена зависимость величины Dр от температуры Т в координатах Аррениуса. Как следует из (1.24) при условии D0»Dр данная зависимость фактически отражает зависимость проницаемости Р клеточных стенок от температуры Т. Энергия активации самодиффузии составила Ejj=24.\±\.9 кДж/моль. Рассчитанная величина энергии активации хорошо согласуется с данными, полученными Benga с коллегами методом ЯМР с парамагнитным допингом для эритроцитов крови мыши Ejj=27 кДж/моль [99].

Величина проницаемости Р клеточной мембраны эритроцитов крови мыши, рассчитанная в соответствии с уравнением (1.24), изменяется от 0.3-10"5 до 0.5-10"5 м/с с ростом температуры от 5 до 35 оС. Измеренные значения проницаемости клеточных стенок эритроцитов ниже значений, полученных авторами [105]. Данное различие можно объяснить тем, что в работе [105] спад спинового эха наблюдали при уменьшении сигналов спинового эхо в пределах одного порядка, что не дает возможности корректно измерить коэффициент самодиффузии Ds\, характеризующий компоненту внутриклеточной воды. В предлагаемой работе диффузионные затухания молекул воды анализировались в пределах двух и трех порядков, что позволяет более точно оценить Ds\.

Оценка времени жизни ассоциатов в водных растворах

Как отмечалось ранее, при создании лекарственных препаратов на основе новых классов химических соединений важным является установление механизма проникновения соединений в живые клетки, который определяется типом взаимодействия этих соединений с клеточными мембранами.

В предлагаемой работе методом ЯМР ИГМП оценена способность водорастворимых производных фуллерена С60 включаться в биологические мембраны и транспортироваться через них.

Для изучения процессов самодиффузии водорастворимых производных фуллеренов в эритроцитах использовали эритроциты крови мыши, методика получения которых описана в главе 2, пункте 2.2. В суспензию клеток вводили водные растворы ВПФ II-V и проводили ЯМР измерения. Концентрация водорастворимых производных фуллерена С60 II-V в клетках эритроцитов составила 10-2 М.

Коэффициенты самодиффузии ВПФ в эритроцитах измеряли на ядрах 1Н методом ЯМР ИГМП на частоте 400.22 МГц. Длительность импульсного градиента магнитного поля =1 мс, максимальная амплитуда импульса градиента магнитного поля g=11 Тл/м, интервал между импульсами градиента магнитного поля варьировался от 10 до 1000 мс в зависимости от эксперимента, число точек в диффузионном затухании 64. Наиболее интересные результаты были получены при введении в суспензию эритроцитов соединений III-V.

На рисунках 3.33а, 3.34а и 3.35а представлены протонные спектры растворов используемых соединений III-V. На рис. 3.33б, 3.34б и 3.35б – протонные спектры эритроцитов с введенными ВПФ. Как видно из спектров, в суспензии эритроцитов хорошо различимы сигналы производных фуллеренов. а

Спектры 1Н: а – водный раствор соединения IV концентрации 60 мг/мл; б – суспензия эритроцитов с введенным соединением IV. Приведены химические сдвиги компонентов производных фуллерена. Рис. 3.35. Спектры 1Н: а – водный раствор соединения V концентрации 47 мг/мл; б – суспензия эритроцитов с введенным соединением V. Приведены химические сдвиги компонентов производных фуллерена.

Как видно из рисунков 3.33-3.35 при введении водорастворимых производных фуллерена С60 в эритроциты наблюдается изменение их химических сдвигов, что может быть объяснено межмолекулярным взаимодействием ВПФ с эритроцитами.

На рисунках 3.36-3.38 представлены протонные спектры исследуемых систем при различных значениях амплитуды градиентного импульса. Как видно из приведенных рисунков компоненты водорастворимых производных фуллерена С60 могут быть однозначно выделены из спектров сигналов спинового эхо. а

Спектры спинового эхо 1Н суспензии эритроцитов с введенным соединением V: а – при величине градиента g=0.5 Тл/м; б – при величине градиента g=6 Тл/м.

Для каждого соединения получены диффузионные затухания сигнала спинового эхо в суспензии эритроцитов при различных временах диффузии td (рисунки 3.39б, 3.40б и 3.41б). Анализ затуханий выполнен в соответствии с уравнением (1.16). Для сравнения на рисунках 3.39а, 3.40а, 3.41а представлены диффузионные затухания молекул ВПФ в водных растворах. а

Диффузионные затухания спинового эхо на ядрах 1Н при различных временах диффузии td молекул ВПФ IV: а – в водном растворе; б – в суспензии эритроцитов. Значения времен диффузии td указаны во вставках. Рис. 3.41. Диффузионные затухания спинового эхо на ядрах Н при различных временах диффузии td молекул ВПФ IV: а - в водном растворе; б - в суспензии эритроцитов. Значения времен диффузии указаны во вставках.

При анализе диффузионных затуханий исследуемых соединений в системе было выделено три коэффициента самодиффузии Д, Д2, и Д3. Полученные значения КСД соединений II-V в суспензиях эритроцитов приведены в таблице 3.4. Для сравнения представлены величины КСД этих соединений в водных растворах.

Из полученных результатов видно, что значения Д2 и Д3 соединений III, IV и V в суспензиях эритроцитов практически совпадают с КСД Ді и Д2 этих же соединений в водных растворах. Но при введении ВПФ III-V в суспензию эритроцитов для данных соединений наблюдались компоненты с КСД Ді=610 м/с (ПІ), Ді=8.510 м/с (IV) и Ді=510 м/с (V). Их значения близки к коэффициенту латеральной диффузии липидов мембран (Д=7Ю"12 м2/с). Наличие КСД Ді ВПФ в суспензии эритроцитов, практически совпадающих с DL позволяет сделать вывод о взаимодействии молекул ВПФ III-V с эритроцитами: по-видимому, молекулы водорастворимых производных фуллеренов включаются в мембранные стенки эритроцитов.

Для соединения III сделанный вывод подтверждается результатами работы [124], авторами которой была оценена антибактериальная активность по отношению к грамотрицательным Escherichia coli и грамположительным Bacillus subtilis бактериям. Установлено, что молекулы соединения III взаимодействуют с биомембранами клеток, образуя на их поверхности кластеры размерами 15-50 нм. Эти кластеры представляют собой агрегаты соединения III, локализованные в отрицательно заряженных областях клеточных стенок за счет электростатического взаимодействия. На рисунке 3.42 показаны полученные АСМ изображения контрольной группы и клеток, обработанных соединением III.

Рис. 3.42. АСМ изображения клеток Escherichia coli: а – контрольная среда; б – с введенным соединением III [124]. Зависимости относительных долей р1, p2, p3 молекул ВПФ в суспензии эритроцитов от времени диффузии td показаны на рисунке 3.43. Значения относительных долей р1 молекул ВПФ в мембранах эритроцитов составили 0.13, 0.12 и 0.05 для соединений III, IV и V, соответственно. Зависимость р1(td) соответствует изменению относительных долей молекул ВПФ на поверхности эритроцитарной мембраны. В соответствии с уравнением (1.25) произведена оценка среднего времени нахождения молекул ВПФ на поверхности мембраны.