Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Методы определения параметров спектров ЯМР высокого разрешения 8
2.1.1. Анализ одномерных спектров ЯМР высокого разрешения 9
2.1.1.1. Прямая спектральная задача. Расчет одномерных спектров ЯМР 9
2.1.1.2. Способы задания оценочной функции 12
2.1.1.3. Методы оптимизации спектральных параметров 16
2.1.2. Особенности подготовки и обработки экспериментальных спектров 17
2.1.2.1. Методы получения однородного магнитного поля В0 17
2.1.2.2. Методы предварительной обработки спектров 20
2.1.3. Методы многоимпульсной и многомерной спектроскопии 24
2.1.3.1. Прямое наблюдение сигнала ЯМР 24
2.1.3.2. Генерация частот в непрямом измерении 25
2.1.3.3. Моделирование многоимпульсного эксперимента ЯМР 28
2.1.4. Определение спектральных параметров с помощью многоимпульсных
экспериментов 31
2.1.4.1. Метод спинового эха 31
2.1.4.2. Измерение величин и установление относительных знаков КССВ по кросс-пикам COSY 36
2.1.4.3. Методы измерения КССВ по двумерным мультиплетам 40
2.1.4.4. Селективные импульсы для регистрации фрагмента двумерного спектра 42
2.1.4.5. Методы измерения КССВ между спинами с низким естественным содержанием 43
2.2. Методы теоретического предсказания констант спин-спинового взаимодействия 55
2.2.1. Конформационные зависимости констант спин-спинового взаимодействия 56
3. Обсуждение результатов 60
3.1. Постановка задачи настоящего исследования 60
3.2. Развитие методов анализа одномерных спектров 62
3.2.1. Усовершенствование подхода VALISA 62
3.2.2. Исследование стратегии дополнительных уширений в случае локальных минимумов 63
3.2.3. Метод имитации отжига
3.3. Анализ формы линий сигналов в двумерных гетероядерных J-спектрах 75
3.4. Демонстрация возможностей разработанных методов расшифровки мультиплетной структуры для характеристики структурных свойств молекул 81
3.4.1. Анализ спектров ЯМР стирола 81
3.4.1.1. Анализ протонных спектров ЯМР стирола 81
3.4.1.2. Измерение некоторых гетероядерных 1H -13C КССВ в стироле
3.4.2. Анализ спектров коричного альдегида 92
3.4.3. Анализ спектров (-)-ментола
3.4.3.1. Анализ протонных спектров (-)-ментола 96
3.4.3.2. Измерение некоторых гетероядерных 1H -13C КССВ в (-)-ментоле 101
3.4.3.3. Измерение 13C-13С КССВ в (-)-ментоле 105
3.4.3.4. Исследование конформационного равновесия в растворе ментола
3.4.4. Анализ спектров L-пролина 116
3.4.5. Определение относительной конфигурации производного гексагидропиримидинтиона по данным 1H ЯМР спектров. 122
4. Экспериментальная часть 124
4.1. Протокол регистрации спектров ЯМР 124
4.2. Процедура калибровки селективных импульсов 125
4.3. Особенности компьютерных вычислений
5. Выводы 127
6. Список публикаций по теме диссертации 128
7. Приложение 130
8. Список литературы
- Особенности подготовки и обработки экспериментальных спектров
- Измерение величин и установление относительных знаков КССВ по кросс-пикам COSY
- Исследование стратегии дополнительных уширений в случае локальных минимумов
- Процедура калибровки селективных импульсов
Введение к работе
Актуальность работы. Спектроскопия ЯМР составляет важнейшую часть комплекса физико-химических методов исследования строения и свойств органических соединений. Использование различных методик ЯМР позволяет получать информацию не только о структуре и конформационной динамике молекулярных систем, но также о супрамолекулярных взаимодействиях и ориентации молекул в магнитных полях. Для решения таких задач необходимы точные значения констант спин-спинового взаимодействия, включая их относительные знаки. Установление величин констант спин-спинового взаимодействия по спектрам ЯМР сложных молекулярных систем требует комплексного подхода, включающего решение обратной задачи при анализе одномерных спектров с дополнением недостающих данных из двумерных спектров ЯМР. Недостатками существующих реализаций данного подхода являются: необходимость предварительного извлечения точных значений частот переходов из экспериментальных спектров (при использовании программных комплексов семейства LAOCOON, LAOCOON-PAREMUS); трудоемкость или невозможность (в случае спектров сложных многоспиновых систем) ручного соотнесения экспериментальных и теоретических значений частот линий (в программном комплексе LAOCOON); недостаточная эффективность методов сглаживания оценочной функции при анализе спектров по полной форме линии (в программных комплексах NMRCON, VALISA, PERCHit). Кроме того, во всех случаях в расчетных методах реализованы алгоритмы локальной оптимизации, использование которых накладывает определенные ограничения на начальные значения оптимизируемых параметров. Таким образом, разработка новых методов расшифровки мультиплетной структуры спектров ЯМР, в том числе с привлечением данных, получаемых из двумерных спектров, является актуальной задачей.
Цель работы. Разработка комплексного подхода к получению точных значений параметров спиновых систем при анализе одномерных и двумерных спектров ЯМР высокого разрешения. Для достижения поставленной цели планировалось решить следующие задачи:
детально проанализировать существующие подходы к расшифровке тонкой мультиплетной структуры спектров ЯМР, выявить преимущества и ограничения опубликованных методов;
разработать методы, позволяющие преодолеть ограничения существующих подходов, повысить эффективность и степень автоматизации процесса анализа тонкой мультиплетной структуры спектров ЯМР;
адаптировать методики двумерной гомо- и гетероядерной спектроскопии ЯМР для измерения параметров спиновых систем (реализовать режимы регистрации двумерных спектров с высоким разрешением);
определить параметры спиновых систем для ряда модельных соединений с использованием разработанных методов.
Научная новизна работы.
Разработан новый подход с оптимизацией методом Монте-Карло (имитация отжига) для анализа тонкой мультиплетной структуры спектров ЯМР высокого разрешения по полной форме линии.
Показано, что неградиентный алгоритм локальной оптимизации Пауэлла обладает лучшей сходимостью и устойчивостью при поиске решения спектральных задач в подходе VALISA по сравнению с методом Левенберга-Марквардта.
Установлена связь параметров гетероядерного импульсного эксперимента J-спектроскопии с видом двумерного спектра. Предложен метод обработки спектральных данных двумерных гетероядерных J-спектров, позволяющий получать надежные значения КССВ.
Полностью расшифрована мультиплетная структура спектров ЯМР 1H растворов стирола, коричного альдегида в CDCl3, CD3CN, C6D6, ментола в CDCl3, L-пролина в CD3OD. С помощью двумерных J-спектров с селективной инверсией определены основные конформационно значимые константы nJC,H в стироле и ментоле. Методами 2D-INADEQUATE установлены значения КССВ nJC,C для ментола.
На основе полученных данных проведено исследование конформационного равновесия в ментоле, учитывающее одновременное вращение гидроксильной и изопропильной групп. С использованием точных значения КССВ установлена относительная конфигурация производного гексагидропиримидинтиона.
Теоретическая и практическая значимость результатов работы. Разработанный в работе подход к анализу спектров ЯМР высокого разрешения по полной форме линии с применением вероятностного метода оптимизации (имитации отжига) позволяет в значительной степени автоматизировать процесс расшифровки тонкой мультиплетной структуры спектров, существенно повысить сходимость и устойчивость процесса поиска решения, а также обеспечить надежность получаемых результатов. Предложенный в работе алгоритм регистрации и обработки гетероядерных J-спектров с селективной инверсией предоставляет возможность точного измерения малых по величине гетероядерных КССВ nJXH. Данные, извлекаемые из спектров ЯМР с использованием разработанных методик, позволят надежно охарактеризовывать структуру и динамику молекулярных систем.
Личный вклад автора. Систематизация литературных данных. Реализация импульсных экспериментов 2D гетероядерной J-спектроскопии, 1H,1H-Soft-COSY, включая разработку импульсных последовательностей, оптимизацию параметров накопления и обработки спектров. Разработка программы анализа спектров по полной форме линии с применением метода симулированного отжига на стадии оптимизации; практическая реализация алгоритма деконволю-ции спектров по опорному сигналу при обработке одномерных спектров. Расшифровка мульти-плетной структуры экспериментальных спектров модельных соединений с помощью существу-4
ющего и разработанного программного обеспечения. Подготовка материалов к публикации, представление полученных результатов на конференциях.
Положения, выносимые на защиту.
Новый метод анализа спектров ЯМР по полной форме линии с применением вероятностного метода оптимизации (алгоритм симулированного отжига). Метод успешно проверен на тестовых задачах по расшифровке четырех модельных спектров сильносвязанных систем типа ABCD, использован при анализе экспериментального спектра L-пролина.
Параметры спиновых систем (включая относительные знаки дальних КССВ nJH,H) и полностью расшифрованная тонкая мультиплетная структура протонных спектров стирола и коричного альдегида (растворы в CDCl3, CD3CN и C6D6), ментола в CDCl3, L-пролина в CD3OD.
Связь вида двумерного гетероядерного J-спектра с параметрами импульсного эксперимента; алгоритм обработки двумерных гетероядерных J-спектров, позволяющий получать пики лоренцевой формы линии в обоих частотных измерениях.
Величины основных конформационно значимых констант nJCH для стирола и ментола, измеренные с помощью двумерных гетероядерных J-спектров с селективной инверсией; величины констант nJC,C для ментола, измеренные с помощью 2D INADEQUATE.
Исследование конформационного равновесия в ментоле, связанного с одновременным вращением гидроксильной и изопропильной групп.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международной конференции “EuroMAR 2011” (Германия, Франкфурт-на-Майне, 2011); V всероссийской конференции “Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях” (Россия, Казань, 2011); 10 международном симпозиуме и летней школе “Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter” (Россия, Санкт-Петербург, 2013), 11 международном симпозиуме и летней школе “Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter” (Россия, Санкт-Петербург, 2014), международной конференции “EuroMAR 2016” (Дания, Орхус, 2016).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи в научных журналах, отвечающих требованиям ВАК, и тезисы 6 докладов на конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка публикаций автора по теме диссертации, приложения и списка литературы. Материал диссертации изложен на 153 страницах, содержит 21 таблицу и 67 рисунков. Список литературы включает 170 наименований.
Особенности подготовки и обработки экспериментальных спектров
В простейшем случае протонный спектр ЯМР (1H) содержит группы отдельно стоящих хорошо разрешенных мультиплетных сигналов, по которым можно определить химические сдвиги и КССВ. При появлении в спектре эффектов непервого порядка и перекрывании сигналов непосредственное извлечение спектральных параметров становится невозможным. В общем случае при анализе спектров ЯМР решают обратную задачу - проводят поиск таких значений параметров, при которых достигается наилучшее соот ветствие между экспериментальным и рассчитанным спектрами. Обратная задача вклю чает в себя прямую спектральную задачу (расчет теоретического спектра по спектральным параметрам), задание оценочной функции и оптимизацию параметров с целью локализа ции ее глобального минимума. В настоящее время для решения обратной задачи используют численные итерационные методы. Существует несколько программных комплексов по анализу спектров ЯМР: LAOCOON [11], LACX [12], MLDC [13], LAME [14], SYMTRY [15], UEAITR [16], NMRCON [17], DAVINS [18, 19], PERCHit [20, 21], PAREMUS [22], VALISA [23, 24]. Они имеют ряд концептуальных различий, связанных с особенностями реализации стадий решения обратной задачи. Рассмотрим эти стадии в следующих разделах более подробно.
Прямая задача состоит в расчете частот и интенсивностей линий в теоретическом спектре по заданным параметрам. Для расчета используют уравнение Шредингера для спиновой системы [1, с. 103], [2, с. 135], решение которого заключается в нахождении собственных функций и собственных значений оператора Гамильтона Я. Облучение радиочастотным полем можно представить как возмущение V стационарного гамильтониана Н. Это возмущение может инициировать в системе переходы между собственными состояниями [1, с. 109]. Частоты переходов определяются разностью собственных значений, а их вероятности пропорциональны квадратам модулей матричных элементов оператора V, рассчитанного в собственном базисе Я. Оператор Гамильтона для спектроскопии ЯМР высокого разрешения имеет вид [4, с. 171]: я = Z?=1 vtla + I.WLl=i+iJijhlj + S?=iZ7=i+i diphzh - hty, (1) где 7j - оператор спинового момента / -того ядра, 7iz - оператор проекции момента спина на направление поля, слагаемое Yi=ivJiz соответствует взаимодействию спинов с внешним магнитным полем и химическому сдвигу, Hf=iliy=j+i/jy/j/y - спин-спиновому взаимодействию, Zf=1Z"=i+1 dijfrlfzljz - IJj) - остаточному диполь-дипольному взаимодействию.
Волновые функции задаются линейной комбинацией базисных мультипликативных функций [1, с. 105]. Система, состоящая из п спинов-, описывается набором 2п мультипликативных функций. В случае двух спинов они имеют вид:
lal)la2) — \аа)\ lal)l/?2) — \аР)\ l l)la2) — \Ра)\ \Pl)\Pl) — \РР) Решение уравнения Шредингера состоит в диагонализации оператора Н с помощью преобразований подобия. Для системы п спинов- необходимо проводить диагонализа-цию матрицы размерности 2п. Если матрица имеет блок-диагональный вид, то необходимым является только диагонализация ее блоков. Приведение гамильтониана к блок-диагональному виду называется факторизацией [1, с. 106].
Для определения соотношения интенсивностей линий при расчете спектров можно принять V = Zjfx [1, с. 109]. Разрешенными являются переходы между состояниями, для которых изменение Z-проекции суммарного спина (Hn7jz) составляет +1.
Факторизация гамильтониана основывается на свойствах собственных векторов и собственных значений коммутирующих операторов [4, с. 132]. Если эрмитовы операторы А и В коммутируют, и все собственные значения оператора А невырожденные, то собственные функции оператора А будут также собственными функциями оператора В. Матричные представления операторов А и В, рассчитанные в базисе собственных функций оператора А, будут иметь диагональный вид: 00 а2 0 ), В 0 аг Если у оператора А встречаются вырожденные состояния, то матричное представление оператора В, рассчитанное в базисе собственных функций оператора А, будет иметь блок-диагональный вид: А = ( 0 а2 0 V В = ( 0 022 Ъ20 . \0 0 а2/ \0 Ь32 Ь33/ Попл и др. [1, с. 105] показали, что оператор Н коммутирует с оператором суммарного спина In7jZ. Поэтому оператор полной энергии будет иметь блок-диагональный вид, где в блоках окажутся мультипликативные функции с одинаковым значением суммарного спина. Для системы из п спинов- число таких блоков составляет п + 1, а их размеры определяются биномиальными коэффициентами.
Для случая, когда оператор К = L + S и операторы L и S не коммутируют (матричное представление оператора S в собственном базисе оператора L будет содержать ненулевые недиагональные элементы), было показано [4, с. 611], что собственные значения и собственные векторы оператора К изменятся незначительно, если при расчете К в собственном базисе L допустить упрощение - приравнять нулю недиагональные элементы, для которых выполняется условие S[j\ « Ijj — Ljj\. Такой расчет оператора называется секулярным приближением.
Ситуация, когда разница резонансных частот спинов сильно превышает константы спин-спиновых и остаточных диполь-дипольных взаимодействий, получила название слабой (спиновой) связи [2, с. 31]. Спины, разница резонансных частот которых сопоставима с КССВ и остаточными диполь-дипольными взаимодействиями (ДДВ), называют сильно связанными. Если спиновая система состоит из групп сильно связанных спинов, а между группами связь слабая, то при расчете гамильтониана можно воспользоваться секулярным приближением. В этом случае блоки гамильтониана с одним значением n 7JZ дополнительно разбиваются на подблоки с одинаковыми значениями суммарного спина в группах сильно связанных спинов [2, с. 33].
Было показано [3, с. 127], что если молекула обладает элементами симметрии, то из мультипликативных функций можно составить линейные комбинации, являющиеся базисами неприводимых представлений (НП) группы симметрии спиновой системы. Порядок группы спиновой симметрии может быть ниже порядка группы симметрии молекулы [3, с. 129]. В симметризованном базисе операторы симметрии принимают блок-диагональный вид, размеры блоков соответствуют размерностям НП, а характеры блоков определяют НП. Поскольку операторы симметрии коммутируют с Н, гамильтониан в симметри зованом базисе принимает блок-диагональный вид, где в один блок попадают функции, относящиеся к одному НП группы.
Гамильтониан инвариантен относительно попарных перестановок в группе магнитно-эквивалентных спинов. Соответствующие операции образуют группу перестановок, которая также характеризуется неприводимыми представлениями, что позволяет факторизовать Я [2, с. 95].
В разных программных комплексах факторизация гамильтониана реализована в разной степени. Например, в программе LACX [12] реализован учет слабой связи, в программах LAME [14] и UEAITR [16] - магнитной эквивалентности ядер. В NMRCON [17] учитывается магнитная эквивалентность групп ядерных спинов, а также симметрия по точечной группе d. Наконец, программа SYMTRY [15] использует все перечисленные выше методы факторизации Я
Следует отметить, что факторизация гамильтониана не влияет на результат решения прямой задачи, однако сильно сокращает требования к вычислительным ресурсам компьютера и позволяет эффективно применять параллельные вычисления.
Измерение величин и установление относительных знаков КССВ по кросс-пикам COSY
Многоимпульсные эксперименты ЯМР представляют собой последовательности радиочастотных импульсов и импульсных градиентов магнитного поля, действующих че 28 рез определенные промежутки времени; в конце регистрируют радиочастотный отклик от образца (сигнал ССИ). Моделирование многоимпульсных экспериментов связано с решением нестационарной квантово-механической задачи для ансамбля спиновых систем. Использование временнго уравнения Шредингера для волновой функции в данном случае крайне трудоемко, поскольку корректно усреднить по ансамблю можно только средние значения наблюдаемых величин, а не волновые функции [4, с. 238]. От волновой функции можно перейти к оператору спиновой плотности р = \Щ-ф\, который является эквивалентным описанием состояния спиновой системы. В отличие от волновой функции, р можно усреднить по ансамблю [4, с. 259]. Исходя из временнго уравнения Шредингера и определения оператора плотности, Лиувиль и фон Нейман вывели уравнение изменения р во времени: =-ЇЯі/ = =-і[Н,р]. (22)
Если гамильтониан в некоторый промежуток времени постоянен (что иногда можно получить при переходе к вращающейся системе координат), уравнение Лиувиля - фон Неймана имеет простое решение -р(т) = е іНтр0еіНт, в остальных случаях необходимо решать систему дифференциальных уравнений. Соренсен, Эрнст и др. [50] показали, что р можно представить в виде суммы спиновых мультипликативных операторов с коэффициентами сj = Гг(р/). При использовании жестких радиочастотных импульсов динамику спиновых систем первого порядка удобно описывать с помощью мультипликативных операторов.
Поскольку действие большинства импульсных последовательностей, как правило, достаточно продемонстрировать на системе двух спинов, рассмотрим применение метода мультипликативных операторов для спиновой системы AX. В этом случае матрицу плотности можно разложить по базису шестнадцати мультипликативных операторов, являющихся прямым произведением операторов отдельных спинов A \AE,AX,AY,AZ) и X \- -Е? X? Y? Z ) — -Е Е 5 X 5 - У? Z 5 X "-У Z X Z? -Y Z -Z Z XX? 2AYXX, 2AZXX, 2AXXY, 2AYXY, 2AZXY. В состоянии теплового равновесия р определяется распределением Больцмана р0 = Az + Xz [50]. Действие импульса описывается соответствующим гамильтонианом (например, Hpuise,y = Upuise{Ay + Ху)) и уравнением Лиувиля - фон Неймана: e-iojpuise(AY+XY)Tґд __ j \eiojPuise(AY+XY)T _ cos(wPuiseT) (Az + Xz) + sm((joPulser) {Ax + Xx), (23) выражение можно записать более кратко: Az + Xz (Az + Xz) cos(wPuiseT) + (Ax + Xx) sm(o)Pulsex). (24) (f) После (90)y-импульса (шРи1зет = -) p = Ax + Xx, или Az + Xz Л Ax + Xx. Затем под действием магнитного поля В0 происходит свободная прецессия: Нргее = ПААг + ПхХг + 2nJAXAzXz, (25) Ах + (nAAz+nxXz+2nJAXAzXz)r COS( T) co nhxT) Ах + СО ПАТ) sin(nhxT) 2AyXz + sm(nAr) cos(nJAXr) AY — sm(nAr) sm(nJAXT) 2AXXZ + COS(DXT) cos{n]AXx) Xx + COS(DXT) sm(nJAXx) lAzXY + sin(/3zr) cos(nJAXr) XY - sm(nxr) sm(nJAXr) 2AZXX. (26) Действие компонент гамильтониана на мультипликативные операторы подробно описано в [50] и [5, с. 76]. При квадратурном детектировании спектрометр ЯМР регистрирует комплексный сигнал ЛІ(ЇХ І) + ІІІ(/У,І): [(Ах) + (Хх)] + l[(AY) + (Яу)] = [cos(nAr) cos(nJAXr) + COS(HXT) cos(nJAXr)] + i[sm(nAx) COS(TTJAXT) + sin(/3zr) COS(TTJAXT)] = COS(TTJAXT) \ЄІПАХ + еІПхТ], (27) которому соответствует спектр, содержащей четыре линии с частотами ПА + - -, ПА ——, п J_ 1АХ п JAX 11Х "г 2 г llX 2 Мультипликативные операторы и их линейные комбинации можно классифицировать по порядку когерентности p [4, с. 383]: когерентность нулевого порядка: Az, Xz, 2AZXZ; когерентность первого порядка: Ах, AY, Хх, XY, 2AXXZ, 2AYXZ, 2AZXX, 2AZXY; многоквантовая когерентность: 2AXXX, 2AYXX, 2AXXY, 2AYXY.
К появлению наблюдаемого сигнала приводят только когерентности первого порядка, входящие в состав р к началу регистрации. Если в результате действия импульсной последовательности помимо интересующей информации регистрируются нежелательные сигналы, порожденные когерентностями порядков отличных от целевой, их можно подавить, циклически изменяя относительные фазы импульсов и приемника, а также импульсными градиентами магнитного поля [5, с. 189].
Закономерности многоимпульсных экспериментов ЯМР, полученные для спиновой системы AX, как правило, переносимы на системы с бльшим числом спинов. Применение метода мультипликативных операторов для систем многих спинов приведено, например, в [50] и [51, с. 320].
Определение спектральных параметров возможно с помощью специальных многоимпульсных экспериментов, целью которых является упрощение мультиплетной структуры сигналов, при сохранении интересующей информации – расщеплений, химических сдвигов, данных о знаках КССВ и т.п.
Существует несколько вариантов последовательности спинового эха [52, 53]. Все они характеризуются использованием 180 рефокусирующего импульса (рис. 6). В работе [51, с. 158] Килер приводит анализ этих последовательностей для спиновой системы AX. Поскольку слагаемые гамильтониана, соответствующие химическому сдвигу и спин-спиновому взаимодействию, коммутируют, можно проследить их действие во время импульсной последовательности по отдельности.
Исследование стратегии дополнительных уширений в случае локальных минимумов
По расщеплениям и трансляциям спектральных компонент в двумерных мультипле-тах COSY можно судить о величинах и относительных знаках КССВ. Однако, ввиду не очень высокого разрешения (особенно по оси х) и достаточно сложной структуры мультиплетов, прямое измерение КССВ не всегда возможно. Для упрощения структуры сечений кросс-пиков COSY предложен метод DISCO (от англ. difference or sum in COSY) [70, 71], который состоит в сложении или вычитании нормированных по интенсивности сечений мультиплетов диагональных (IP, от англ. in-phase, рис. 14) и кросс-пиков (APi, АР2, от англ. antiphase, рис. 14). Суммарные и разностные мультиплеты сечений кросс-пиков (АРі±АРг) содержат расщепления, соответствующие суммам и разницам модулей активных констант. Сложение и вычитание сечений кросс- и диагональных пиков (1Р±АР) приводит к мультиплетам, содержащим расщепления, обусловленные пассивными взаимодействиями, при этом суммарный и разностный мультиплеты смещены относительно друг друга на величину активной КССВ. Если извлечение синфазного мультиплета из двумерного спектра затруднено из-за перекрывания сигналов, или он отсутствует, как, например, в спектрах DQF-COSY, его можно взять из двумерных спектров NOESY или TOCSY [70].
Кросс-пики с упрощенной мультиплетной структурой (типа E.COSY) можно получить непосредственно при регистрации двумерных спектров E.COSY. В простейшем случае интенсивности спектральных компонент, обусловленные перемешиванием спиновых состояний пассивных ядер, могут быть существенно уменьшены при использовании смешивающего импульса с малым углом (от 10 до 45; последовательность -COSY), получающиеся спектры получили название P.E.COSY (от англ. primitive E.COSY) [77]. Гризингер, Соренсен и Эрнст пришли к выводу, что спектр E.COSY можно представить в виде комбинации нескольких спектров DQF-COSY [74-76], отличающихся квантовыми фильтрами. Оказалось, что можно составить программу фазовых циклов для последова тельности DQF-COSY, приводящую непосредственно к спектрам E.COSY, однако время регистрации такого спектра в три раза больше, чем -COSY.
Структуру кросс-пиков с трансляциями по F± и F2 за счет взаимодействий с пассивными гетероядрами (например, 19F, 31P или в соединениях, изотопно-обогащенных по 13C и 15N) следует ожидать в гомо- и гетероядерных двумерных спектрах (COSY, TOCSY, HSQC), при регистрации которых пассивные ядра не затрагивались действием ни импульсов, ни развязки [70, 78-80]. В случае магнитно-активных гетероядер с низким естественным содержанием, сигналы соответствующих спиновых систем можно выделить с помощью BIRD-фильтра [81], его модификации TANGO [82, 83] и гетероядерного фильтра- (от англ. “X half-filter”) [84]. В гомоядерной спектроскопии эффект “гетероядра” можно получить применением селективных импульсов возбуждения [85, 86].
Схема применения метода DISCO для упрощения мультиплетной структуры сечений кросс-пиков COSY (а) и экспериментальные спектры DISCO производного дииодотирозина [71] (б). 2.1.4.4. Селективные импульсы для регистрации фрагмента двумерного спектра
Точность измерения КССВ по расщеплениям спектральных компонент в двумерных мультиплетах (например, в кросс-пиках E.COSY и DISCO) лимитирована низким разрешением двумерного спектра, особенно по частотному измерению Fx и, как правило, не превышает ±0.3 Гц [5, с. 361]. Повысить разрешение двумерного спектра можно увеличением числа инкрементов по tt либо уменьшением регистрируемых частотных полос. Увеличение числа инкрементов по гх приводит к чрезмерному возрастанию времени накопления спектра и объема спектральных данных (в основном, содержащих сведения о частотах, не представляющих интереса). Кроме того в течение всего эксперимента необходимо поддерживать высокую однородность магнитного поля, что не всегда удается.
Простое ограничение спектральной полосы непрямого измерения приводит к отражению сигналов, поэтому для корректной регистрации спектра необходима дополнительная частотная фильтрация по Fx. Эрнст с сотр. [86] показали, что роль такого частотного фильтра могут выполнять селективные импульсы в период подготовки. Например, при замене в последовательности COSY первого импульса на селективный (рис. 15а), регистрируемый двумерный спектр по оси Fx содержит сигналы, попавшие в полосу возбуждения селективного импульса (рис. 15г).
Применение одинаковых (при необходимости, отличающихся фазами) селективных импульсов в период подготовки и смешения (последовательность endo-COSY, рис. 15б) позволяет более подробно регистрировать квадратный фрагмент спектра COSY (рис. 15д), содержащий главную диагональ. Последовательность Soft-COSY (рис. 15в) содержит три селективных импульса. Первые два определяют частотную полосу по Fb должны иметь одну частоту и ширину возбуждения, третий селективный импульс определяет частотную полосу по измерению F2. Получающийся таким образом спектр схематично представлен на рисунке 15е.
Купче и Фриман [87] предложили для регистрации спектров Soft-COSY использовать селективные импульсы quiet-SNEEZE, характеризующиеся ровным по фазе и амплитуде профилем возбуждения, а также высокой селективностью (уменьшено возбуждение вне полосы действия импульса по сравнению с импульсами семейства BURP). Спектры регистрируются без искажений, даже если импульсы quiet-SNEEZE имеют смежные полосы возбуждения и в период смешения подаются одновременно.
Процедура калибровки селективных импульсов
В литературе имеются сведения о конформационном анализе ментола [165], проведенном на основании данных квантово-химических расчетов (B3LYP/6-31G(d,p)) геометрии конформеров и химических сдвигов 13C. Было установлено, что реализуется только одна кресловидная конформация; химические сдвиги 13C, рассчитанные для конформера ментола с G– ориентацией изопропильной группы находятся в наилучшем соответствии с экспериментальными данными: коэффициент корреляции составил 0.9969, стандартное отклонение 1.42 м.д. Конформационное состояние гидроксильной группы в [165] не изучалось. Позже конформационное равновесие исследовали методами оптической спектроскопии (дисперсии оптического вращения (ДОВ) и кругового дихроизма (КД)) в совокупности с квантово-химическими расчетами (MPW1PW91/CC-PVDZ, IEFPCM: аце-тонитрил) [166] в рамках модели, учитывающей вращение гидроксильной группы при G– ориентации изопропильной группы. Было получено следующее соотношение конформе-ров (G(ккал/ моль)/заселенность): G–T (0.00/41.2), G–G+ (0.12/33.9), G–G– (0.30/24.9).
Мы считаем, что опубликованные исследования не являются полными, поскольку не учитывают всех конформаций ментола, которые могут реализоваться. Мы исследовали конформационное равновесие (-)-ментола в рамках модели, учитывающей девять стабильных конформаций, связанных с вращением гидроксильной и изопропильной групп (рис. 33, 34).
Для каждого конформера были проведены глубокая оптимизация геометрии методом MP2 в базисе 6-311+G(2df,2p) и расчет свободных энергий Гиббса (Gaussian 09W, Rev. A02 [167]). Относительные энергии, а также заселенности конформеров, рассчитанные в приближении распределения Больцмана для 303 K, приведены на рисунке 33. Для полученных геометрий были рассчитаны КССВ в приближении DFT/FPT (B3LYP в базисе 6-311++G(2df,2p) с применением двухступенчатой схемы расчета с уточненным вычислением Ферми-контактного члена (в режиме “Mixed” [168]). Рассчитанные значения некоторых КССВ 1H-1H, 1H-13C и 13C-13C для девяти конформеров ментола приведены в таблицах 14, 15 и 16.
По характеру конформационной зависимости КССВ можно условно разделить на три группы: сильно конформационно зависимые с диапазоном изменения более 5 Гц (6 констант – 3J1-H,OH, 3JOH,2-C, 3JOH,6-C, 3J2-H,7-H, 3J7-H,3-C, 3J2-H,9-C), средней зависимости с диапазоном изменения от 1 до 5 Гц (21 константа – 3J2-H,8-C, 3J7-H,1-C, 3J3-C,9-C, 3J1-C,8-C, 1J1-C,6-C, 2J1-H,6-C, 1J1-C,2-C, 3J1-C,9-C, 2J1a-H,2-C, 3J3-C,8-C, 2J7-H,8-C, 1J2-C,3-C, 2J7-H,9-C, 2J7-H,2-C, 2J3-C,7-C, 2J6a-H,6e-H, 1J7-C,8-C, 3J1a-H,7-C, 1J5-C,6-C, 3J1a-H,2a-H, 2J2a-H,1-C) и слабо зависимые – от 0.5 до 1 Гц – (19 констант), менее 0.5 Гц (24 константы).
Исходя из конформационных зависимостей КССВ и заселенности конформаций, мы рассчитали величины констант с учетом конформационного равновесия и провели сравнение с экспериментальными значениями КССВ. Полученные результаты приведены в таблице 17, график соответствия теоретических и экспериментальных значений КССВ приведен на рисунке 35, коэффициент достоверности линейной регрессии составил 99.82%, СКО по КССВ – 0.70 Гц, что свидетельствуют о хорошем соответствии теоретических и экспериментальных данных.
Cпектры ЯМР 1H растворов L-пролина (рис. 36) в дейтерометаноле были зарегистрированы на спектрометрах с рабочими частотами 600 МГц (0.03 M) и 300 МГц (0.10 M) при 303 K. Мы обнаружили, что опубликованные спектральные параметры для раствора про-лина в дейтерометаноле [169] были определены некорректно и не соответствуют экспериментальному спектру. Сопоставление сигналов протонов 4t-H, 4c-H рассчитанных по литературным данным с экспериментальным спектром (600 МГц) приведено на рисунке 37. Поэтому мы решили провести анализ протонного спектра пролина независимо.
Сложность анализа протонного спектра L-пролина определяется несколькими обстоятельствами: по спектру невозможно сделать отнесение сигналов протонов 4t-H, 4c-H и 5t-H, 5c-H, поэтому возникает четыре варианта сочетаний параметров, затрагивающих 3Jцис (4-H,5-H) и 3Jтранс (4-H,5-H). Имеется неопределенность в величинах и относительных знаках дальних констант 4J. Из спектра следует, что не все дальние КССВ проявляются в виде расщеплений, а те, которые проявляются, невозможно сопоставить с конкретными взаимодействиями. С учетом дальних КССВ и их знаков, число возможных сочетаний параметров значительно возрастает. Следует отметить, что КССВ одного типа (3Jцис, 3Jтранс или 4J) характеризуются близкими значениями, что приводит к появлению локальных минимумов. После нескольких неудачных попыток проанализировать спектр с помощью программы VALISA-CSS мы решили применить метод имитации отжига для спектра, зарегистрированного на частоте 600 МГц [155]. Использованные при отжиге параметры приведены в таблице 19.