Введение к работе
Актуальность теш. Термохимическое изучение гидролитических ферментативных реакций представляет не только теоретический но и интерес, практический, поскольку в настоящее время ферменты используются в качестве катализаторов различныххимических процессов, в том числе и реакций гидролиза, что обеспечивает их протекание с высокой селективностью в мягких условиях. Термохимические характеристики для реакций гидролиза ортофосфатов типа модельного субстрата фосфатаз п-нитрофенилфосфата необходимы в медицинской промышленности и в биоаналитической химии, как при разработке новых методов постадий-ного контроля промышленного производства фосфатаз и степени их чистоты, так и в ишуноферментном анализе. Величины знтальпий изученных реакций могут быть использованы также в тонком органическом синтезе при планировании внедрения ферментативных процессов в производство .
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является надежное установление величины энтальпии гидролиза п-нитрофенилфосфата (pNPP), основного модельного субстрата ферментов класса гидролаз
(КФ 3) подкласса фосфатаз (КФ 3.1), а также энтальпий гидролиза
других субстратов аденозин - 5 - монофосфата (АМФ-5) и цитидин -5 - монофосфата (ЩЮ-5).
Задачи исследования:1!. Экспериментальное определение величин энтальпий изучаемых реакций и термодинамических параметров ионизации компонентов реакций. 2. Расчеты величин стандартных энтальпий исследуемых реакций и средних значений энтальпий реакций гидролиза ортофосфатов (в расчете на недиссоциированное состояние компонентов). 3- Разработка микрокалориметрических методик определения активности щелочной фосфатазы, и оценки ее субстратной специфичное-
ти. 4. Изучение термостабильности щелочной фосфатази. 5. Определение концентрации активных центров щелочной фосфатази с использованием обратимого ингибитора - ортованадата натрия.
Научная новизна работы. Впервие надежно установлена стандартная величина энтальпии гидролиза pNPP двумя независимыми путями на основе определения энтальпии реакции гидролиза щелочной фосфата-зой в щелочной среде и кислой фосфатазой в кислой среде, а также впервые определены энтальпии гидролиза АМФ-5 и ЩМ-5; установлены значения энтальпий ионизации 7 компонентов исследованных реакций (3 из них впервые).
Разработаны микрокалориметрические методики определения активности щелочной фосфатази и экспресс-оценки субстратной специфичности этого фермента.
Практическая значимость. 'Результаты экспериментальных определений энтальпий реакций гидролиза могут слухигь для термодинамических расчетов оптимальных химико-технологических условий протекания этих реакций, способствовать выявлению новых областей применения этих процессов.
Апробация работы. Результаты выполненных исследований доложены на -IV Всесоюзной конференции по методам получения и анализа биохимических препаратов (Олайне, 1982 г.), XI Всесоюзной конференции по калориметрии и химической термодинамике (Новосибирск, 1986 г.), V и VI Всесоюзной конференции по термодинамике органических соединений (Куйбышев, 1987 г., Минск, 1990 г.).
Публикации. По материалам диссертации имеется 10 публикаций.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста (в том числе 30 таблиц и 24 рисунка) и состоит из введения, 6 глав, включаючих литературный обзор, описание установок, экспериментальную часть, обсуждение результатов, основных итогов работы, списка цитируемой литературы из 8 наименований и приложений.