Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 11
1.1 Общие сведения о вирусах. Характеристика свиного цирковируса типа 2 (PCV2) 11
1.2. Методы изучения вирусов .14
1.2.1. Экспериментальные методы определения структуры вирусов 14
1.2.2. Компьютерные методы 17
1.3. Полноатомные модели и физико-химические задачи, в которых они используются 22
Глава 2.Экспериментальная часть .29
2.1. Детали моделирования методом МД 29
2.2. Распределение заряженных частиц в системе .32
2.3. Процесс уравновешивания систем .37
2.4. Анализ результатов моделирования МД 38
Глава 3. Обсуждение результатов .41
3.1. Модель целого капсида в растворе, имитирующем биологическую среду 41
3.2. Стабильность модели вирусного капсида 43
3.3. Водородные связи 47
3.4. Зависимость стабильности капсида от ионов электролита 50
3.5. Механизм разрушения пустого вирусного капсида 58
3.6. Моделирование отдельных блоков 71
3.7. Транспортные характеристика капсида 104
3.7.1. Исследование транспорта воды и ионов через стенку капсида 104
3.7.2. Определение размера пор капсида 107
Заключение 111
Итоги выполненного исследования 111
Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы 112
Литература 113
Приложение 129
- Компьютерные методы
- Распределение заряженных частиц в системе
- Стабильность модели вирусного капсида
- Моделирование отдельных блоков
Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение свойств и поведения сложных биомолекулярных систем, в том числе, в водной среде – одна из актуальных проблем современной физической химии. Среди таких объектов, представляющих огромный интерес, различные вирусы и их составляющие компоненты. Как известно, вирусы оказывают серьезное влияние на все живые организмы - от бактерий до человека. Однако механизмы, с помощью которых вирусы проникают в определенные клетки, размножаются, поражают организмы и мутируют, до сих пор окончательно не изучены.
Основными компонентами вируса являются нуклеиновая кислота (РНК или ДНК) и нескольких кодируемых ею белков, формирующих оболочку вокруг нуклеиновой кислоты – капсид. Последний, прежде всего, защищает геном (РНК или ДНК) от механических, физических, химических повреждений, которые могут вызываться внешними факторами (радиацией, скачками температуры, изменением рН среды и др. [1]). Другая функция капсида заключается в доставке генома вируса в клетку на начальной стадии ее заражения. Наличие устойчивости (стабильности) капсида на этапе его проникновения в клетку – необходимое условие обеспечения доставки и высвобождения генетического материала из капсида в клетке-хозяине для ее инфицирования. Многие вирусные капсиды проявляют устойчивость к значительным изменениям рН и температурам [2-5], высокому давлению [6-7] , влиянию различных ферментов и др.[1,8-11]. Однако до сих пор неизвестно, какие факторы и при каких условиях способны обеспечить устойчивость (стабильность) капсида. Их установление позволит приблизиться к реализации возможности управления этим этапом жизненного цикла вирусов, и таким образом, перейти к разработке лекарственных препаратов, которые обладали бы противовирусным действием на ранних этапах развития инфекций. Отметим, что уже сейчас капсиды находят практическое приложение: они используются в разработках по созданию вакцин (напр., вакцинация гепатита В основывается на инъекциях пустых капсидов гепатита В [12] [5, 13-14], а также рассматриваются в качестве контейнеров для доставки лекарственных препаратов в определенные клетки [4-5,11] и в противораковой терапии, где применение вирусов рассматривается для запуска механизмов уничтожения раковых клеток [15].
Вирусный капсид, в который заключен геном, построен из одинаковых субъединиц – капсомеров, представляющих собой группы повторяющихся белковых молекул, связанных нековалентными связями. Формирование упорядоченной структуры капсида из капсомеров осуществляется путем самосборки. Самосборка капсида – открытый вопрос, поскольку на сегодняшний день неизвестен не только ее механизм, но даже не определена структура белковых субъединиц капсида в клеточной среде. Решение этой проблемы важно еще и потому, что этапы жизненного цикла вируса (адсорбция вируса на поверхности клетки-хозяина, его проникновение в клетку, раскрытие капсида с высвобождением генома, сборка новых вирусных капсидов из новых белковых субъединиц, выход вируса из клетки) связаны, в том числе, со структурой капсида и ее изменениями при попадании вируса в клеточную среду [1, 16].
Существует два основных экспериментальных метода по определению структуры вирусов – рентгеноструктурный анализ и криоэлектронная микроскопия. Они
позволяют установить структуры вирусов с атомарным разрешением, с определением координат каждого атома системы. Однако определение этими методами структур происходит при низких температурах и в высококонцентрированных солевых растворах - в условиях, не соответствующих биологической (клеточной) среде, в том числе, ее рН. Альтернативой этим методам выступает полноатомное МД-моделирование (fully atomistic MD) - метод молекулярной динамики (МД) с учетом всех атомов системы, который для определения структуры капсида впервые был использован только в 2006 г. Цель исследования: Определение методом полноатомного МД-моделирования структуры капсида свиного цирковируса типа 2 с отсутствием генома внутри и условий ее стабильности в водном растворе 0.15М NaCl, имитирующем биологическую среду.
Выбор объекта исследования обусловлен тем, что свиной цирковирус типа 2 -самый простой и маленький вирус, а структура его капсида определена экспериментально с атомарным разрешением, что позволяет провести сравнение с расчетными данными. Расчеты были выполнены в растворе при рН~7, для которого экспериментально было показано наличие стабильности пустого капсида свиного цирковируса типа 2 [17-18]. В соответствии с целью, основными задачами исследования являлись:
-
разработка молекулярной модели вирусного капсида на основе данных рентгеноструктурного анализа с применением методов гомологического моделирования для восстановления неопределяемых экспериментом белковых участков;
-
установление структурных различий между структурой капсида вируса, полученной экспериментально в нефизиологических условиях, и модельной структурой капсида вируса в условиях, имитирующих клеточную среду;
-
исследование влияния гибких N-концевых доменов на стабильность структуры вирусного капсида;
-
проверка стабильности структуры вирусного капсида в различных силовых полях;
5) установление причин стабильности структуры вирусного капсида с
отсутствующим геномом;
-
Определение структурных характеристик вирусного капсида: диаметра пор, распределения зарядов на поверхностях капсида, вносимых ионами солевого раствора, особенностей водородного связывания между белковыми субъединицами капсида;
-
Исследование возможности транспорта воды и неорганических ионов через стенку капсида;
8) моделирование отдельных комплексов белковых субъединиц с целью
определения взаимосвязи стабильности структуры капсида – структурные
изменения белковой субъединицы.
Научная новизна исследования:
-
Построена первая полноатомная модель капсида свиного цирковируса типа 2 на основе данных метода молекулярной динамики;
-
Впервые обнаружен стабилизирующий характер влияния N-концов белковых субъединиц на структуру вирусного капсида, проявляющийся в дополнительных взаимодействиях N-концов белковых субъединиц друг с другом и с внутренней поверхностью соседних субъединиц;
3) Впервые установлено, что ионы физиологического раствора необходимы для
поддержания стабильности капсида свиного цирковируса типа 2 в отсутствии
генетического материала внутри;
4) Впервые показано, что стенка капсида свиного цирковируса типа 2
функционирует как полупроницаемая мембрана;
5) Впервые обнаружено, что изменения в пространственной структуре белка, в его
последовательности аминокислот с 33 по 40 аминокислоту способствует
разрушению его взаимодействий с соседними белками.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные данные расширяют научные представления об особенностях структуры и стабильности вирусов, необходимых для понимания сложных процессов, протекающих с их участием, и вносят вклад в развитие физической химии биологически активных соединений.
Созданная полноатомная компьютерная модель пустого вирусного капсида свиного цирковируса типа 2 позволяет определить его структуру в растворе, имитирующем биологическую среду, что на сегодняшний день невозможно сделать экспериментально, и объяснить причины ее стабильности.
На основе полученных данных показано, что при моделировании вирусных капсидов необходимо учитывать поверхностный заряд капсида для корректной подготовки системы для моделирования.
Полученные данные могут быть использованы в разработке лекарственных препаратов противовирусного действия и вакцин с применением капсидов, а также при создании на основе капсидов «наноконтейнеров», предназначенных для доставки молекул лекарственных препаратов в клетки-мишени.
Методология и методы исследования
Методологической основой исследования являются компьютерный эксперимент, системный подход, анализ, сравнение, обобщение.
Основным методом в работе являлся метод полноатомного молекулярно-динамического моделирования с учетом всех атомов растворителя. Моделирование уникальных по размеру систем (3-5 миллионов атомов) проводилось с использованием самых мощных компьютеров в мире (K-компьютер, MDGRAPE4 в научно-исследовательском институте RIKEN, Япония). Типичное машинное время моделирования составляло 3 месяца для одной системы. Дополнительно в работе использовались методы гомологического моделирования (MODELLER), графические методы визуализации структуры и динамики белков (VMD, MOE, CHIMERA).
Положения, выносимые на защиту
-
Полноатомная модель капсида свиного цирковируса типа 2 в водно-солевом растворе, имитирующем биологическую среду, включая структурные характеристики;
-
Гипотеза о причине стабильности капсида свиного цирковируса типа 2 в отсутствии генома внутри, которая заключается в распределении ионов, вносимых из биологического раствора, по внутренней поверхности капсида, что и приводит к его стабильности;
-
Дополнительные факторы, влияющие на стабильность пустого капсида свиного цирковируса типа 2 в водном растворе NaCl: N-концевые домены, водородные связи между субъединицами, распределение ионов по поверхности капсида,
изменения в пространственной структуре белка, в его последовательности аминокислот с 33 по 40;
4) Гипотеза о функционировании стенок капсида как полупроницаемой мембраны, основывающаяся на структурных особенностях капсида, установленных в рамках данной модели;
Достоверность полученных результатов и выводов
Достоверность результатов и выводов обеспечена непротиворечивостью полученных данных фундаментальным научным представлениям в области физической химии биологически активных соединений, согласованием структуры модельного капсида с экспериментальными данными (электронной микроскопией) и литературными данными по молекулярно-динамическому моделированию устойчивости капсидов других вирусов. Достоверность результатов подтверждается также публикациями в рецензируемых журналах с высоким импакт-фактором.
Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Работа выполнена в рамках тематик научных исследований Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Балтийский федеральный университет им. И. Канта». Работа поддержана грантами Королевского Химического Общества Великобритании (Royal Society of Chemistry, Researcher Mobility Fellowship № 550074, 2014), Фонда Сасакава Великобритании (The Great Britain Sasakawa Foundation, грант № 4679, 2015), грантом в рамках проекта повышения конкурентоспособности ведущих российских университетов среди ведущих мировых научно-образовательных центров «5-100» Балтийского Федерального Университета им. И. Канта (№958стс, 2016).
Апробация работы. Основные результаты и выводы работы представлялись на международных конференциях M5’s Advanced Manufacturing Conference (Великобритания, 2015); Hybrid Simulation Methods in Fluid Dynamics: Models, Software and Applications (Германия, 2015), CECAM-HQ-EPFL «Virus as a whole: meso- and macroscopic structure and dynamics at all atom resolution» (Лозанна, Швейцария, 2015); на международной конференции «Engineering bacteriophages for treating antimicrobial resistance using computational models» (Бирмингем, Великобритания, 2016); Recent Progresses on the Experimental & Theoretical Computational Techniques for the study of liquids and supercritical fluids from simple to complex systems (Греция, 2016).
Личный вклад автора заключается в анализе литературных данных, разработке модели, моделировании всех систем, указанных в работе, обработке полученных данных. Интерпретация результатов исследования и написание статей выполнены при участии соавторов публикаций и научного руководителя.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе, 3 статьи в зарубежных научных журналах из Перечня журналов и изданий, рекомендованных ВАК Российской Федерации, а также тезисы 5 докладов на международных конференциях.
Структура диссертации.
Диссертационная работа представлена на 129 страницах, содержит 3 таблицы, 60 рисунков и состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, заключения, списка литературы из 146 источников и приложения.
Компьютерные методы
Современное развитие компьютерных технологий и создание суперкомпьютеров, таких как ANTON [79] и MDGRAPE-4 [ 80], совместно с развитием новых вычислительных алгоритмов [81-85] все еще не достигло уровня, позволяющего моделировать большие системы, такие как бактерии и клетки. Их функционирование определяется совместной динамикой многих составляющих, зависящих друг от друга (белков, нуклеиновых кислот, липидов и пр.) на длительном промежутке времени. Вирусы являются удобным объектом для компьютерного моделирования, потому что они имеют относительно небольшие размеры (от 20 нм [19]) и могут рассматриваться независимо от других компонентов клетки. Более того, поскольку вирусные капсиды определенных вирусов способны существовать в растворе без генома внутри [4], то можно моделировать отдельные целые капсиды [32, 57, 83, 86-90].
Моделирование методом молекулярной динамики активно используется в изучении физико-химических свойств вирусных систем, позволяет определить структуру и динамику вирусных компонентов в условиях, имитирующих биологическую среду – при соответствующей температуре и в физиологическом растворе (0.15М NaCl) [22]. Определение структуры вирусных капсидов в таких условиях представляет высокую важность, т.к. они могут дать информацию о жизненном цикле вирусов, которую невозможно определить экспериментально.
Начальная структура моделируемой молекулы, которая представляет собой координаты каждого атома в пространстве, для биологических молекул находится в банке данных трехмерных структур, который называется Protein Data Bank (PDB) [91]. Эти структуры определены экспериментально рентгеноструктурным анализом и криоэлектронной микроскопией. В молекулярно – динамическом моделировании, стартуя с известной трехмерной структуры молекулы, можно проследить ее временную эволюцию.
В основе метода молекулярной динамики лежит решение системы классических уравнений движения Ньютона для всех атомов моделируемого объектаСилы, действующие на каждый атом со стороны других атомов, задаются через отрицательный градиент межатомного потенциала = - V , ( = - у) где V - потенциальная энергия взаимодействия атомов. Общая сила на каждой частице в момент времени t рассчитывается как векторная сумма взаимодействия этой частицы со всеми остальными частицами. Межатомный потенциал V зависит от типов взаимодействующих атомов. Математическое выражение и параметры, определяюшие потенциал, задаются эмпирически и в совокупности называются «потенциальным полем». Существует большое количество потенциальных полей откалиброванных для воспроизведения различных свойств разнообразных молекулярных систем. Например, поле GROMOS, разработанное и откалиброванное для воспроизведения структуры белков в водном растворе, может быть использовано для моделирования вирусного капсида, поэтому вирусные капсиды, содержащие только белковые компоненты в составе, могут быть рассчитаны в силовых полях, предназначенных для белков.
Интегрирование системы дифференциальных уравнений молекулярной динамики производится численно с использованием различных алгоритмов, например, один из самых распространенных - алгоритм Верле [92-93]
Алгоритм Верле для вычисления ускорения, скорости и координат в момент времени t + t использует ускорения, скорости и координаты в момент времени t и t- t:
r(t + At)= r(t) +Atv(t)+ A + .
r(t-At)= r(t) -Atv(t)+-A-...
при сложении получается следующее выражение
r(t + At)=2 r(t) r(t- At)+At2a(t) Для расчета скоростей используется следующее выражение v(t)= [93-94].
Во всех уравнениях t - это временной шаг, т.е. интервал времени, за который происходит обновление положений атомов в системе.
Выбор временного шага должен быть сделан корректно, потому что при выборе слишком большого временного шага численный алгоритм становится нестабильным, в то время как слишком маленький шаг интегрирования приводит к неоправданному замедлению вычислений. Как показывает практика, оптимальным значением шага по времени для жидких систем является значение порядка 1 фс что обеспечивает получить плавную динамику атомов системы [93, 95].
При моделировании вирусов используют два подхода в зависимости от целей и условий моделирования, к которым относятся исследуемый процесс и размеры вируса - огрубленные модели (Coarse-Grained model) и полноатомные (all-atom).
Как было показано в работе [96], моделирование на долгих временах дает большую точность. В то время, как моделирование больших полноатомных систем на длительные времена ограничиваются расчетными мощностями компьютеров, огрубленные модели позволяют не только моделировать процессы, происходящие на длительных промежутках времени [97-98], но и мембранные белки [99-101], вирусы [102-103], процесс сборки вирусных частиц [104-105]. В таких моделях уменьшается число степеней свободы, что значительно сокращает расчетное время моделирования. На сегодняшний день существует огромное количество методов и алгоритмов, например в которых фрагменты аминокислот или аминокислоты целиком представляются одной частицей, обладающих одними физико-химическими свойствами, или модели, которые используют комбинацию крупнозернистых моделей и полноатомных [106]. Эти алгоритмы подробно представлены в обзоре [99].
В то же время известно, что трехмерная структура белков и их функции определяются первичной последовательностью аминокислот белков, таким образом, необходимо учитывать все атомы белка для воссоздания корректной третичной структуры молекулы [107-108].
Полноатомные модели моделирования методом МД учитывают каждый атом системы, что делает такие расчеты трудоемкими, однако, это дает возможность получить структуру и физико-химические свойства, приближенные к реальным.
Многие важные процессы жизненного цикла вирусов до сих пор неизвестны. К таким процессам относятся: явление самосбоки вирусных частиц, изменение стабильности и структуры вирусных компонентов под влиянием рН и ионов среды, при взаимодействии вирусного капсида с геномом, упаковка генома [51, 62, 89, 109-112]. Вышеперечисленные процессы являются высокоупорядоченными и напрямую зависят от трехмерной структуры каждого компонента, поэтому для моделирования вирусов локальные взаимодействия его компонентов, в которых учитывается каждый атом, играют существенную роль для воспроизведения реальной картины.
Формирование третичной структуры белка и ее изменение во времени зависит от свойств окружающей среды. Ранее в работе [113 ] было продемонстрировано, что динамика частиц раствора является основным фактором, влияющим на структурные изменения белка при температуре раствора выше 180 К. Но преобладающее влияние подвижности частиц раствора на структуру белка меняется при более низких температурах [114]. Таким образом, очевидным становится тот факт, что влияние частиц раствора на структуру белковых молекул является существенным в интервале температур, характерных для живых организмов. Поэтому учет растворителя в особенности для биологических молекул крайне важен.
В МД моделировании используют две основные модели растворителя – модель явного растворителя и модель неявного растворителя [94]. В модели явного растворителя моделируется каждая молекула воды, в то время как модель неявного растворителя учитывает окружение с помощью поправки, что делает модель явного растворителя точнее, а неявного – менее затратным в расчетах. В работах [115-116] показано, что использование модели явного растворителя при описания структурных изменений в биологических молекулах позволяет получить результаты, которые лучше соотносятся с экспериментальными данными.
Распределение заряженных частиц в системе
Основная проблема моделирования такого большого комплекса заключалась в нестабильности структуры. Причем эту нестабильность можно выявить только на достаточно больших временах. Изначально ионы Na+ и Cl- были добавлены случайным образом в той же концентрации, равной 0.15М, система в целом была нейтральна. Однако, после 1нс моделирования структура капсида оказалась нестабильной. Межмолекулярные взаимодействия между субъединицами стали разрушаться, а капсид деформировался, как показано на Рисунке 2.3. На рисунке 2.4 представлена зависимость среднего квадратичного отклонения структуры капсида от времени моделирования. График среднего квадратичного отклонения стремительно растет все 1,2нс моделирования, достигает к концу моделирования величины 0.7нм и не выходит на постоянное значение [83].
Была использована ячейка большего размера, где расстояние от стенки белка до стенки ячейки составляло 6нм. Это было выбрано с целью исключить возможность влияния периодических копий капсида на исходный капсид. Количество атомов в такой системе составило 3 435 918. Однако, после 1 нс моделирования был получен подобный результат.
Для корректной подготовки начальной структуры был выполнен расчет распределения заряда на капсиде, Рисунок 2.5. Капсид без N-концевого домена несет сильно положительный заряд 360 e, а капсид, включающий N-концевой домен, имеет заряд 180 e [57].
Чтобы определить, как распределен заряд по капсиде, на Рисунке 2.5 приведена также зависимость плотности атомов капсида от расстояния, где максимум плотности атомов расположен на расстоянии 8.5нм от центра масс, что дает основание определить центр стенки капсида. Тем не менее, максимум интегрального заряда приходится на расстояние 7.8нм. Таким образом, видно, что распределение заряда неравномерное между внешней и внутренней поверхностью. Внутренняя стенка капсида обладает положительным зарядом, равным 606 для капсида без N-концевого домена и 407 для капсида, включающего в свою структуру N-концевой домен, как это нетрудно предположить из-за необходимости упаковать отрицательно-заряженный геном. Внешняя стенка капсида отрицательно заряжена, 246 для капсида без N-концевого домена и 227 для капсида с N-концевым доменом [57].
Чтобы подготовить системы к моделированию мы раздельно нейтрализовали избыточный заряд на поверхностях: внутрь капсида добавили Cl-, а во внешний раствор добавили Na+ в соответствующем количестве - для капсида без N-концевого домена было добавлено 606 хлорид-ионов, а для капсида с N-концевым доменом- 407 хлорид-ионов. Для нейтрализации заряда на внешней стенке капсида добавили 246 в систему без N-концевого домена и 227 в систему, содержащую N-концевые домены. Для воспроизведения условий, близких к физиологическим, чья концентрация NaCl составляет 0.15М, в систему было еще добавлено 1720 ионов Na+ и Cl-[57].В системы, которые содержали пониженное количество ионов , была добавлена только половина нужного количества ионов: для капсида без N-концевого домена внутрь добавили 300 Cl- и 60 Cl- снаружи, для системы, содержащей N-концевые домены, внутрь поместили 200 Cl- и 20 Na+ снаружи. В конечный раствор также добавили 1720 Na+ and Cl- для поддержания физиологических условий [57].
Эти данные сведены в следующих таблицах [57, 128].
Стабильность модели вирусного капсида
После 10 нс моделирования, проведенного как указано в методологии с соответствующим числом ионов, каждая структура целого капсида, содержащего N-концевые домены и без них, оказалась устойчивой, что можно видеть по анализу среднего квадратичного отклонения и радиуса инерции, Рисунок 3.3 [57, 128].На Рисунке 3.3 представлены графики среднего квадратичного отклонения (a,b) и радиуса инерции (c,d) моделируемых систем в двух силовых полях- GROMOS (a,c), AMBER (b,d) [57].
При моделировании в силовом поле GROMOS (Рисунок 3.3.a,c) капсидов без N-концевых доменов (черная кривая) видно, что значение среднего квадратичного отклонения структуры капсида относительно кристаллографической структуры продолжает медленно расти, однако, радиус инерции структуры без N-концевых доменов (Рисунок 3.3с, черная кривая) увеличивается незначительно, что позволяет сделать вывод о стабильной структуре. Увеличение среднего квадратичного отклонения структуры капсида, которое наблюдается на Рисунке 3.3а, можно объяснить «дыханием» капсида, вызванным тепловым движением молекул воды в системе, что вызывает незначительную динамику капсида, но не разрушает саму структуру. Аналогичным образом ведет себя структура капсида с N-концевыми доменами (Рисунок 3.3.a,c красная кривая). Значения среднего квадратичного отклонения у структуры с N-концевыми доменами (Рисунок 3.3.a красная кривая) больше, чем у структуры без N-концевых доменов (Рисунок 3.3.a черная кривая) поскольку структура имеет 60 N-концевых доменов, расположенных внутри капсида, обладающих динамикой в связи с тепловым движением молекул системы. Радиус капсида с N-концевыми доменами (Рисунок 3.3с) увеличивается до 8,35 нм в самом начале моделирования, после чего остается постоянным. Увеличение диаметра происходит за счет перестройки заряженных N-концевых доменов, после которого радиус остается прежним, поскольку появляются дополнительные взаимодействия боковых заряженных групп аминокислот на N-концевых доменах с боковыми заряженными группами аминокислот на соседник N-концевых доменах и внутренними поверхностями капсида, что удерживает радиус капсида и не позволяет ему увеличиваться.
Как следует из графиков, силовое поле AMBER (Рисунок 3.3b,d) дает более стабильную структуру, в то время как в силовом поле GROMOS среднее квадратичное отклонение и радиус инерции продолжают расти.
В силовом поле AMBER (Рисунок 3.3b,d) среднее квадратичное отклонение капсида без N-концевых доменов (Рисунок 3.3b черная кривая) медленно поднимается до значения 0,15-0,17 нм и остается постоянным. График зависимости радиуса инерции капсида без N-концевых доменов от времени моделирования (Рисунок 3.3d) все 10 нс остается постоянным, равным 8,3 нм, что свидетельствует о стабильности структуры вирусного капсида в поле AMBER. Значение среднего квадратичного отклонения структуры капсида с N-концевыми доменами во время моделирования относительно ее кристаллографической структуры ведет себя аналогично значению для капсида без N-концевых доменов, но значение достигает 0,21 нм, что вызвано влиянием динамики N-концевых доменов. Радиус капсида за время моделирования остается прежним после незначительного сжатия капсида в самом начале моделирования до значения 8,24 нм. Вероятно, что в поле AMBER N-концевые домены не вызывают увеличение диаметра капсида, а наоборот, стягивают за счет вносимых ими взаимодействий.
Рост среднего квадратичного отклонения для структуры с N-концевыми доменами более медленный, что можно объяснить большим числом взаимодействий между аминокислотами N-концевых доменов, как показано на Рисунке 3.3. Есть вероятность, что эти взаимодействия вызваны начальным положением N-концевых доменов, таким образом результаты, связанные с повышенной устойчивостью при наличии N-концевых доменов могут быть достоверными только в рамках данной модели. На Рисунке 3.4. изображен один из случаев возникновения дополнительных взаимодействий, стабилизирующих капсид в данной модели. На рисунке изображен целый капсид, содержащий N-концевые домены, с выделенными двумя белковыми мономерами капсида, чьи N-концевые домены взаимодействуют друг с другом своими боковыми группами аминокислот.
Второй вариант дополнительных взаимодействий, вносимых N-концевыми доменами, представлен на Рисунке 3.5. Красным цветом выделена одна субъединица, чей N-концевой домен расположен вдоль внутренней стенки капсида, взаимодействуя с соседними мономерами целого капсида.
Таким образом, в рамках данной модели вирусного капсида с N-концевыми доменами можно сделать вывод о стабилизирующем характере N-концевых доменов на вирусный капсид. В работе [142] авторы тоже нашли стабилизирующий характер N-концевых доменов на бактериофаг.
Моделирование отдельных блоков
Экспериментально было показано, что межмолекулярные связи между белковыми мономерами сохраняются в целом капсиде [19]. Моделирование методом молекулярной динамики согласуется с экспериментальными данными. Экспериментальных данных о существовании отдельных белковых олигомеров данного вируса нет.
В данном разделе представлены результаты моделирования методом молекулярной динамики нескольких олигомеров, представленных в минимально возможных комбинациях мономеров: димер, тример и пентамер. Данные олигомеры заключают в себе три основные оси симметрии икосаэдрического вирусного капсида: ось симметрии второго порядка проходит через димер, ось симметрии третьего порядка – через тример, ось симметрии пятого порядка – через пентамер. Таким образом, учтены все элементы симметрии в целом икосаэдрическом капсиде.
Первым этапом было определение структуры белковых мономеров отдельно от состава всего капсида.
На рисунке 3.23. приведены начальные структуры белковых мономеров, содержащий N-концевой домен (рисунок 3.23а ) и без него (рисунок 3.23а).
Структуры мономеров после моделирования продолжительностью 30 нс и график среднего квадратичного отклонения структур от начальной структуры представлены на рисунке 3.24. На графике среднего квадратичного отклонения (рисунок 3.24с) видно, что структура белкового мономера, не содержащего N-концевой домен (красная кривая), медленно увеличивается в течение 15нс моделирования до величины 0,5нм, после чего выходит на постоянное значение. Аналогичным образом себя ведет структура белкового мономера, содержащая N-концевой домен (синяя кривая), которая также растет первые 15 нс моделирования до величины 0,5нм.
На рисунке 3.25 представлены графики среднего квадратичного отклонения каждой аминокислоты мономера с N-концевым доменом (3.25а), и мономера без N-концевого домена (3.25b) после 30нс моделирования относительно их кристаллографической структуры.
Анализируя зависимость среднего квадратичного отклонения от времени моделирования обоих белковых мономеров (рисунок 3.24с), можно заключить, что их структуры одинаково нестабильны, несмотря на наличие N-концевого домена. Детальный анализ среднего квадратичного отклонения каждой аминокислоты (рисунок 3.25) показывает, что наличие N-концевого домена не приводит к значительному различию в структурных изменениях аминокислот.
На рисунке 3.25 видно, что в обоих случаях (а - для мономера без N-концевого домена, b - для мономера, содержащего N-концевой домен) есть значительное отклонение структуры в области 80 (70-90), 160-177, в области, которая следует за отсутствующим N-концевым доменом (33-40) и в области С-концевого домена (220-226) (Приложение А).
Были также определены аминокислоты, которые взаимодействуют с ионами электролита. После 30 нс моделирования мономер без N-концевого домена взаимодействует только с Cl-ионами. Хлорид-ионы взаимодействуют с аминокислотами 92 (Аргинин), 95 (Лизин), 175 (Аргинин). Мономер с N-концевым доменом взаимодействует только с одним ионом хлора на аминокислоте 92 (Аргинин).
Схематический рисунок (использован с сайта Viperdb и модифицирован) приведен для наглядности, где расположены в целом капсиде белковые олигомеры, которые изучались в данной работе (Рисунок 3.26).
Димеры были построены из мономеров, находящихся в положениях 1, 2, согласно рисунку 3.26, тример – из трех мономеров, размещенных в положениях 1,3,4, пентамер – 1,5,6,7,8. Это позволило рассмотреть все возможные варианты взаимодействия мономеров, составляющих капсид, с целью изучения их стабильности. Тример составляет область оси симметрии третьего порядка, а пентамер - область оси симметрии пятого порядка, к тому же пентамер составляет пору, через которую происходит обмен молекул воды.
Каждая субъединица в димере выделена отдельным цветом. Было проведено 30 нс моделирования димеров в одинаковых условиях, после чего структура димеров осталась стабильной в обоих случаях. На рисунке 3.28 представлен график зависимости среднего квадратичного отклонения димера от времени моделирования относительно его начальной структуры. Из графика видно, что структура димера подвергается структурным изменениям, однако, взаимодействия, поддерживающие мономеры в димерах (рисунок 3.28, 3.29), остаются достаточно сильными, чтобы удержать структуру димера.
Рисунок 3.29 демонстрирует, что комплекс димера без N-концевых доменов не разрушился после 30 нс моделирования, что позволяет предположить возможность существования в растворе изолированных димеров.
Наблюдаются структурные изменения в мономерах, но межмолекулярные взаимодействия не разрушаются. На рисунке 3.30 представлен график среднего квадратичного отклонения структуры каждого мономера после 30 нс моделирования относительно его кристаллографической структуры. На этом графике видно, что часть мономеров, на которой расположены первые 75 аминокислот, сохраняет начальную структуру. Есть структурные изменения в области аминокислотной последовательности 75-85 и 125-135 в обоих мономерах, и в первом мономере отклонения в последовательности 165-175, 220-226.
Димер с N-концевыми доменами аналогично димеру без них подвергается структурным изменениям, что не разрушает межмолекулярные взаимодействия между мономерами (рисунок 3.31). N-концевые домены взаимодействуют с внутренней поверхностью соседнего мономера, что, вероятно, вносит дополнительную стабилизизацию в димер. На рисунке 3.32 представлены графики среднего квадратичного отклонения аминокислот каждого мономера в димере относительно их начальных положений. Аналогично димеру без N-концевых доменов первые 55 аминокислоты последовательности мономера не подвержены значительным структурным изменениям за 30 нс моделирования. Отмечаются структурные изменения 120-130 аминокислот первого мономера, 160-170 второго мономера и 220-226 обоих мономеров.
Интересный результат был получен при моделировании тримеров. На рисунке 3.33 изображены начальные структуры тримеров.
Структура N-концевых доменов тримера, содержащего N-концевые домены, была выбрана произвольным образом, поскольку экспериментальных данных о структуре N-концевых доменов нет.