Содержание к диссертации
Введение
I Литературный обзор 19
1.2.1. ID -QSAR-методы 23
1.2.2. 2D-QSAR-MCTO№I 23
1.2.3. 3D-QSAR-METOflbI 23
1.2.4. Методы расчета дескрипторов, зависимые от выравнивания 25
1.2.5. Независимые от выравнивания методы расчета дескрипторов 25
1.2.6. Статистические подходы выбора соответствующих молекулярных дескрипторов 26
1.2.7. Ограничения методов 3D-QSAR 26
1.2.8. Преимущество методов 3D-QSAR перед ID- и 2D-QSAR-техниками моделирования активности 27
1.2.9. 4D-QSAR 27
1.2.10. Независимый от рецептора 40-С)8АК-метод 29
1.2.11. Зависимый от рецептора 4D-QSAR-no№«w 29
1.2.12. LQTA4D-QSAR 30
1.2.13. 5D-QSAR. Концепция QUASAR 30
1.2.14. 6D-QSAR-Mero№i 32
1.3.1. Методы конформационного анализа, используемые в 3D-6D-QSAR-noAxoAax 34
1.3.2. Конформационный анализ с помощью методов систематического поиска 35
1.3.3. Конформационный анализ методом Монте-Карло 37
1.3.4. Конформационный анализ методами молекулярной динамики... 37
1.3.5. Проблема выбора метода для конформационного анализа 39
1.4.1. Алгоритм постепенного конструирования 42
1.4.2. Генетический алгоритм как метод поиска биоактивных конформаций лигандов в методах молекулярного докинга 42
1.4.3. Табу-поиск биоактивных конформаций лигандов з
1.4.4. Моделирование отжига 44
1.4.5. Метод Монте-Карло 45
1.4.6. Методы подгонки формы 45
1.4.7. Основные оценочные функции, применяемые в молекулярном докинге 45
1.4.8. Проблемы лиганд-протеинового докинга 47
1.4.8.1. Учет гибкости фермента 47
1.4.8.2. Гибкий докинг 48
1.4.8.3. Исследование ротамеров 48
1.4.8.4. Ансамбль белковых структур 49
1.4.8.5. Молекулярная динамика как метод поиска биоактивных конформаций лигандов в методах молекулярного докинга 49
1.4.8.6. Наличие структурных молекул воды 50
1.4.8.7. Проблема учета энтропии в методе молекулярного докинга 52
1.6.1. Перспективы применения методов ТРО для моделирования взаимосвязи «структура-свойство» 56
1.7. Современные компьютерные системы для изучения взаимосвязи «структура-свойство» методами SAR 58
1.7.1. Методология и принципы работы программы PASS 58
1.7.2. Перспективы применения системы PASS для прогноза разных видов биологической активности органических соединений 59
1.7.3. Компьютерная программа GUSAR 60
1.7.4. Компьютерная система исследования связи 62
«структура-свойство» SARD-21 62
1.7.5. Основные этапы исследований в КС SARD-21 62
1.7.6. Перспективы прогноза разных спектров биологической активности с использованием КС SARD-21 64
II Методика эксперимента 72
2.1.1. Характеристика обучающих и экзаменационных выборок для установления связи «структура-свойство» и построения моделей прогноза ингибиторов биосинтеза простагландинов и соединений с выраженной противоопухолевой активностью 72
2.1.2. Методики биологических испытаний 74
2.1.3. Изучение противовоспалительной активности проводили на каррагениновой модели 74
2.1.4. Изучение ульцерогенной (влияние на язвообразование) активности 75
2.2.1. Построение математических моделей прогноза и распознавания эффективных ингибиторов 15-ЛОГ с использованием QSAR-методологии в пакете программ МОЕ 75
2.2.2. QSAR- моделирование с использованием программы GUSAR 76
2.2.2.1. Построение QSAR-моделей прогноза параметра 1С5о 77
для ингибиторов ЦОГ-2 77
2.2.2.2. Построение QSAR-моделей прогноза параметра 1С5о для ингибиторов ЦОГ-1 81
2.2.2.3. Построение QSAR-моделей прогноза индекса селективности I для ингибиторов изоформ ЦОГ 83
2.2.2.4. Построение QSAR-моделей прогноза параметра 1С5о для ингибиторов 5-липоксигеназы 84
2.2.2.5. Построение QSAR-моделей прогноза параметра 1С5о 89
для ингибиторов 15-ЛОГ 89
2.2.2.6. Построение QSAR-моделей прогноза параметра 1С5о 90
для ингибиторов FLAP 90
2.2.2.7. Построение QSAR-моделей прогноза параметра 1С5о для ингибиторов лейкотриен А4-гидролазы 91
2.2.2.8. Построение QSAR-моделей прогноза параметра 1С5о и IQ для блокаторов рецепторов, чувствительных к цистеиниллейкотриенам 93
и лейкотриенам ЛТБ4 93
2.2.2.9. Построение QSAR-моделей прогноза параметра 1С5о для ингибиторов гена hERG Homo sapiens 97
2.2.2.10. Построение QSAR-моделей прогноза параметра 1С5о для ингибиторов тимидилат синтазы Mus museums 99
2.3.1. Исходные вещества и их очистка 102
2.3.2. Методика кинетического эксперимента 105
2.4.1 Моделирование активного центра 5-липоксигеназы
2.4.2. Моделирование пероксидазного центра изоформ ЦОГ 111
III Результаты и их обсуждение 112
3.2.1. Корреляционный анализ ингибиторов ЦОГ-2 116
3.2.2. Корреляционный анализ ингибиторов ЦОГ-1 122
3.2.3. Корреляционный анализ ингибиторов 5-ЛОГ 122
3.2.4. Корреляционный анализ блокаторов рецепторов БЛТі/БЛТг 125
3.2.5. Количественный прогноз активности ингибиторов изоформ ЦОГ, 5-ЛОГ и блокаторов лейкотриеновых рецепторов 126
3.3.1. SAR-моделирование и структурный анализ соединений с выраженной противовоспалительной и противоопухолевой активностью 129
3.3.2. Молекулярный дизайн ингибиторов биосинтеза простагландинов, лейкотриенов и соединений с потенциальной противоопухолевой активностью 140
3.3.3. Виртуальный скрининг производных хромана, изоборнил фенола и селенсодержащих органических соединений по SAR-моделям 156
3.4.1. 30 8АК-моделирование ингибиторов 15-ЛОГ 158
3.4.1.1. QSAR-моделирование производных триптамина и гомотриптамина 159
3.4.1.2. QSAR-моделирование производных имидазола 161
3.4.1.3. QSAR-моделирование N-замещенных производных сульфонамидов и бензола 162
3.4.1.4. Апробация ЗО-С АЯ-моделей 163
3.4.2. Моделирование количественной взаимосвязи «структура свойство» для ингибиторов биосинтеза простагландинов, лейкотриенов
и предшественников биосинтеза нуклеиновых кислот 166
3.4.2.1. Выбор метода расчета QSAR-моделей 166
3.4.2.2. Изучение количественной взаимосвязи «структура-активность» для ингибиторов каталитической активности изоформ ЦОГ, ЛОГ, FLAP, ЛТАДЇ, ТС и гена hERG 168
3.4.2.3. Структурный анализ ингибиторов биосинтеза простагландинов 177
3.4.2.4. Виртуальный скрининг структур хитов, полученных в результате молекулярного дизайна НІ 1ВП 185
3.5.1. Моделирование активных центров изоформ ЦОГ и ЛОГ. Решение проблемы координационно связанной воды 196
3.5.2. Исследование механизма комплексообразования разных классов БАВ с активным центром ЦОГ-2 202
3.5.3. Исследование механизма комплексообразования разных классов БАВ с активным центром ЦОГ-1 216
3.5.4. Исследование механизма комплексообразования разных классов БАВ с активным центром FLAP 235
3.5.5. Исследование механизма комплексообразования разных классов БАВ с активным центром ЛТАДЇ 242
3.5.6. Исследование механизма комплексообразования модификантов ДВ НПВП «Кетопрофен», «Диклофенак», «Индометацин», «Рофекоксиб» и ресвератрола с активными центрами оксигеназ и топоизомеразы-1... 252
2.5.6.1. Исследование механизма комплексообразования модификантов ДВ НПВП «Кетопрофен», «Рофекоксиб» и производных хромана с активным центром 5-ЛОГ 253
3.5.6.1. Исследование механизма комплексообразования модификантов ДВ НПВП «Кетопрофен», «Диклофенак», «Индометацин», производных трансстильбена и хромана с активным центром ЦОГ-1 256
3.5.6.2. Исследование механизма комплексообразования модификантов ДВ НПВП «Кетопрофен», «Диклофенак», «Индометацин», производных трансстильбена и хромана с активным центром ЦОГ-2 268
3.5.6.3. Исследование механизма комплексообразования некоторых терпеноидов и производных хромана с активным центром топоизомеразы-1 278
3.5.6.4. Анализ избирательности действия модификантов ДВ НПВП в отношении ЦОГ-2 280
3.6.1. Количественное изучение антиокислительных свойств биологически активных веществ 284
3.6.2. Биологические испытания соединений-хитов 293
Заключение 295
Выводы 297
Список литературы
- Преимущество методов 3D-QSAR перед ID- и 2D-QSAR-техниками моделирования активности
- Перспективы применения методов ТРО для моделирования взаимосвязи «структура-свойство»
- Построение QSAR-моделей прогноза параметра 1С5о для ингибиторов 5-липоксигеназы
- Молекулярный дизайн ингибиторов биосинтеза простагландинов, лейкотриенов и соединений с потенциальной противоопухолевой активностью
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Исследование связи между структурой и реакционной способностью разных классов органических соединений представляет собой одно из важнейших направлений современной физической химии. В ее задачи входит не только термодинамическое описание растворов, законов взаимодействия микро- и макрообъектов, изучение динамики элементарного химического акта, но также разработка математического аппарата, алгоритмов и подходов для моделирования взаимосвязи между строением и физико-химическими свойствами в классических открытых и закрытых модельных и реальных термодинамических системах, включая биологические и другие объекты. В последнее десятилетие научный интерес большинства исследовательских групп физического и физико-химического профиля направлен на разработку математического аппарата (разработка эмпирических оценочных функций) и алгоритмов моделирования комплексных соединений по принципу «гость-хозяин» применительно к высокомолекулярным соединениям, моделирование динамики белков и т.д. Базовые принципы классических математических и физических дисциплин переносятся на биологические объекты с целью детального изучения их свойств. В частности, известно, что в основе моделирования биологической активности в SAR- и QSAR-подходах, методах молекулярного до-кинга и молекулярной динамики лежат классические законы квантовой физики, химии, термодинамики, математики и математической статистики. Так, например, для расчета константы нестойкости, характеризующую устойчивость виртуальных комплексов «макромолекула-лиганд» в методах молекулярного докинга, используется уравнение Гиббса-Гельмгольца. Силовые оценочные функции в этих методах базируются на расчете потенциала Леннарда-Джонса и потенциала Колумба. Этот факт неудивителен, поскольку биологическая активность низко- и высокомолекулярных соединений зависит от множества физико-химических факторов, включая химическую устойчивость этих веществ, их способность к различным конформационным переходам, влияющим на транспортные характеристики через мембрану клеток, растворимость, липо-фильность. В конечном итоге биологическая активность низкомолекулярных соединений является следствием их взаимодействия с определенными полипептидами, включая рецепторы, ферменты. В целом, биологические объекты можно рассматривать как открытые термодинамические системы, функционирование которых осуществляется благодаря чрезвычайно огромному многообразию возникающих между ними различного рода химических и физический взаимодействий. Так, например, результатом комплексообразования между циклооксигеназой-2 (ЦОГ-2)
и низко молекулярными объектами является подавление воспалительного процесса в живых системах. Популярность выбора в качестве моделируемых объектов разных видов биологической активности объясняется высоким уровнем современных методик и техник сканирования биологических эффектов, что значительно упрощает интерпретацию полученных результатов. Так, например, активность фермента ЦОГ-2 может быть измерена не только с применением классических физико-химических подходов (спектрофотометрически или радиолигандным методами), но и по степени снижения воспалительного процесса, анализируя концентрацию образующихся простагландинов и т.д.
В настоящее время для моделирования различных видов биологической активности широко привлекаются методы виртуального скрининга. Наиболее общеизвестными из них являются методы, основанные на SAR (Structure-Activity Relationships)-, QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships)-noflxoflax, метод молекулярного докинга и метод динамического моделирования поведения молекулярных и супрамоле-кулярных систем. Их применение позволяет в десятки раз сократить временные и материальные затраты на поиск и скрининговые испытания структур-хитов на доклинической стадии. Это в тысячи раз удешевляет разработку новых лекарственных препаратов как узконаправленного, так и полифункционального действия.
Актуальность моделирования ингибиторов биосинтеза простагландинов, лейкотриенов и антиоксидантов обусловлена тем, что чрезмерная выработка метаболитов арахидоновой кислоты и предшественников нуклеиновых кислот при нарушении антиоксидантного статуса организма животных и человека приводит к развитию различных патологических процессов вплоть до канцерогенеза органов и тканей. Этот факт неудивителен, так как антиокислительная активность (АОА) является одним из наиболее важных компонентов биологической активности веществ (БАВ). В частности, известно, что антиокислительными свойствами обладают многие известные ингибиторы 5-липоксигеназ (5-ЛОГ), изоформ ЦОГ и соединения с выраженной противоопухолевой активностью (зилеутон, кверцетин, физетин, 5-гидрокси-б-метилурацил, 5-фторурацил и т.д.). Актуальность поиска антагонистов лейкотриено-вых рецепторов объясняется тем, что именно через них реализуется негативное действие лейкотринов, образующихся с участием липокси-геназной ферментативной системы на живые системы, в то время как в настоящее время в фармакологической практике ассортимент ингибиторов лейкотриенов и блокаторов их активности представлен недостаточно.
Степень разработанности темы. Благодаря современному высокопроизводительному комбинаторному синтезу виртуальные библиотеки и базы данных ежедневно пополняются сотнями тысяч новых соединений. Необходимость их виртуального скрининга с целью отбора из них структур хитов требует огромных временных затрат и дорогостоящих вычислительных и человеческих ресурсов. Традиционно для моделирования взаимосвязи «структура-свойство» с целью дальнейшего поиска новых структур хитов большинство исследователей использует статистические методы, такие как: метод опорных векторов и SAR- подход, реализованный в программе PASS, а также метод искусственных нейронных сетей. Эти методы достаточно надежно позволяют классифицировать структуры исследуемых соединений на противоклассы, однако они не позволяют определять приоритетные направления модификации исследуемых структур. Фармакофорный поиск, который может с успехом применяться для поиска селективных ингибиторов изоформ ЦОГ, лейкотриен А4-гидролазы (ЛТА4Н) и белка FLAP, с большой осторожностью применим для поиска ингибиторов 5-й 15-ЛОГ, для которых практически отсутствуют надежные кристаллографические данные о координатах их лигандов в активных центрах этих ферментов. По причине отсутствия модельных молекул рецепторов БЛТі/БЛТ2, а также CysLT-Ri/R2, этот метод неприменим для поиска эффективных блокаторов лейкотриеновых рецепторов. В этих условиях особую актуальность приобретает поиск рационального системного подхода к моделированию взаимосвязи «структура-свойство» и дизайну соединений с требуемым фармакологическим профилем, направленного на экспрессное и, вместе с тем, объективное изучение закономерностей в строении БАВ с требуемым комплексом свойств, на котором мы сосредоточили свои усилия. В нашем исследовании виртуальный скрининг использован для поиска потенциальных ингибиторов изоформ ЦОГ, ЛОГ, белка FLAP, ЛТА4Н и тимидилат синтазы (ТС).
Целесообразность изучения антиокислительных свойств БАВ кинетическими методами обусловлена тем, что до настоящего времени отсутствует единый критерий количественной оценки антиокислительных свойств природных соединений и активных компонентов лекарственных препаратов, что существенно затрудняет их сравнительное исследование. Количественное изучение АОА с использованием современных методов физической химии позволит прогнозировать эффективность антиокислительного действия соединений-хитов и соединений-лидеров при изменении условий окисления субстрата или при изменении содержания этих веществ в реакционной смеси.
В связи с этим, целью настоящего исследования является разработка нового системного подхода к установлению связи «структура-
свойство» и поиску структур хитов в ряду биологически активных органических соединений с выраженной противовоспалительной, антиокислительной и противоопухолевой активностью.
Работа выполнена при поддержке программы сотрудничества «Михаил Ломоносов», реализуемой в 2008-2009 гг. совместно с Германской службой академических обменов (DAAD), программы стратегического развития Башкирского государственного университета, гранта РФФИ 14-04-97035 «Механизм комплексообразования азот-, кислород-и серусодержащих соединений с ферментами липоксигеназной окислительной системы и полисахаридам» и проекта №4.299.2014/К, выполняемого в рамках проектной части государственного задания Минобрнау-ки РФ в сфере научной деятельности.
В задачи исследования входило:
- изучение возможности использования информационной си
стемы SARD-21 (Structure-Activity Relationships and Design)-211 для
моделирования избирательности ингибирующего действия биологиче
ски активных соединений на каталитическую активность ряда фермен
тов, задействованных в биосинтезе простагландинов, лейкотриенов, а
также для моделирования антагонистической активности органических
соединений в отношении чувствительных к лейкотриенам рецепторам;
- изучение возможности использования интервального подхода
к построению SAR-моделей распознавания ингибиторов изомерных
форм ЦОГ и ЛОГ (5/15-ЛОГ) и ЛТАДі, конструированию новых инги
биторов данных ферментов, а также прогноза степени выраженности их
активности, моделирования селективности ингибирования ферментов;
определение границы применимости классического QSAR-моделирования и консенсус подхода к построению QSAR- моделей для количественного прогноза активности ингибиторов изоформ ЦОГ, ЛОГ, ЛТА4Н, FLAP и блокаторов лейкотриеновых рецепторов;
выявление сайтов связывания гетероциклических органических соединений, для которых известны экспериментальные значения параметров биологической активности (IC50, IQ) с активными центрами изоформ циклооксигеназ, белка FLAP и ЛТА4-гидролазы;
выявление ферментативной специфичности структур хитов, сконструированных по созданным SAR- и QSAR-моделям;
определение физико-химических характеристик виртуальных комплексов «макромолекула-лиганд», позволяющих классифицировать
Тюрина Л.А., Тюрина О.В., Колбин A.M. Методы и результаты дизайна и прогноза биологически активных веществ. - Уфа: Гилем, 2007. - 336 с.
структуры мишеньспецифических ингибиторов по эффективности их связывания с активными центрами изоформ ЦОГ, FLAP, ЛТА4Н;
разработка нового подхода виртуального скрининга и моделирования взаимосвязи «структура-свойство» для направленного поиска структур хитов в ряду разных классов ингибиторов биосинтеза проста-гландинов, лейкотриенов и предшественников нуклеиновых кислот с использованием интервального и консенсусного подходов к построению SAR- и QSAR-моделей соответственно;
оценка профиля биологической активности структур-хитов, представляющих собой производные хромана и селенохромена, на основе предложенного подхода к моделированию взаимосвязи «структура-свойство»;
оценка применимость разработанного системного подхода для разработки новых структур соединений, перспективных в качестве потенциальных противовоспалительных и противоопухолевых препаратов.
Научная новизна. Предложен новый системный подход к установлению взаимосвязи «структура-свойство» и поиску новых БАВ с выраженной противовоспалительной и противоопухолевой активностью, который базируется на законах математической статистики и химической термодинамики. В основе разработанной научной концепции поиска закономерностей в строении мишень-специфических ингибиторов и новых структур хитов лежит методология комплексного использования SAR-, QSAR-подходов и метода молекулярного докинга. При этом для моделирования избирательности действия разных классов БАВ в отношении ферментов впервые использована новая версия информационной системы SARD - SARD-21. В ней реализован алгоритм «фронтального поиска» и псевдоканонизации записи молекулярного графа для идентификации циклических фрагментов в углеводородах, новый подход к формированию решающих наборов признаков. Этот подход базируется на методах теории распознавания образов (ТРО), максимальной информативности и минимальной корреляции, а также оптимального «покрытия» новых анализируемых структур, который оценивается на основе эвристических критериев, эмпирически подбираемых самим исследователем. Кроме того, для дифференциации прогностических оценок в эту систему внедрены новые критерии ранговых оценок на стадии прогноза активности моделируемых соединений, основанные на определении их структурного сходства с расчетными эталонами. Эта информационная система в нашем исследовании впервые использована для моделирования ферментативной специфичности разных классов БАВ.
Другим элементом новизны данной работы является идеология применения интервального подхода к построению SAR-моделей прогно-
за ферментативной активности с использованием системы SARD-21. Этот метод прогнозной оценки свойств имеет ряд преимуществ перед другими аналогичными методиками моделирования биологической активности, так как он позволяет: 1) проводить экспрессный виртуальный скрининг потенциальных лекарственных препаратов и предсказать степень проявления целевого свойства потенциального лекарственного средства; 2) приблизиться к количественной оценке целевого свойства в биологических объектах.
С использованием идеологии SARD-21 разработаны прогнозирующие системы оценки противовоспалительной активности на основе оригинальных моделей прогноза эффективных ингибиторов биосинтеза метаболитов арахидоновой кислоты. В результате количественного изучения взаимосвязи «структура-свойство» с использованием консенсус подхода, реализованного в программе GUSAR (General Unrestricted Structure Activity Relationships)2 на базе 140 статистически значимых QSAR- моделей прогноза значений 1С5о и К„ разработана система количественной оценки противовоспалительной и противоопухолевой активности, а также гастро- и кардиотоксичности для разных классов гетероциклических соединений с учетом избирательности их действия на каталитическую активность изоформ ЦОГ, ЛОГ, ЛТАДЇ, ТС, гена hERG и блокаторов лейкотриеновых рецепторов.
Продемонстрирована возможность использования онлайн версии программы PLATINUM для интерпретации результатов молекулярного докинга, выполняемого с использованием программы AutoDock, что значительно сокращает и упрощает стадию анализа результатов виртуального скрининга. Установлено, что программа PLATINUM корректно определяет сайты взаимодействия лигандов с активными центрами изоформ ЦОГ, 5-ЛОГ, ЛТА4Н и белка FLAP, найденные с помощью алгоритмов AutoDock 4.2. Для ингибиторов изоформ ЦОГ, FLAP и ЛТА4Н установлена корреляция расчетных геометрических характеристик, оцениваемых с помощью PLATINUM на основе структуры виртуальных комплексов «макромолекула - лиганд», найденных методом молекулярного докинга, с экспериментальными значениями параметра ICso-Все расчетные параметры, получаемые ранее с использованием данной программы, служили только дополнительными характеристиками моделируемых комплексов «макромолекула - лиганд».
Предложен новый способ повышения точности расчета координат лигандов методом молекулярного докинга в активных центрах металло-
Filimonov D.A., Zakharov A.V., Lagunin, A.A. Poroikov, V.V. QNA based «Star Track» QSAR approach II SAR and QSAR in Environmental Research. - 2009. - V. 20.-P. 679-709.
протеинов, ионы металлов которых не описаны в соответствующих параметрических файлах используемых программ, например, в AutoDock, Dock. Он заключается в репараметризации активного центра металло-протеина на основе значений парциальных атомных зарядов, предварительно рассчитанных полуэмпирическими методами квантовой химии для хелатных комплексов, входящих в данные реакционные центры. На примере 5/15-ЛОГ показано, что корректное описание распределения зарядов в активных центрах металлопротеинов, полученное на основании результатов квантово-химических расчетов полуэмпирическим методом РМ6, позволяет добиться совпадения координации тестовых лигандов с их нативным положением в активных центрах, установленных методом рентгеноструктурного анализа (R.M.S.D < 0.2 нм). Достоверность этого подхода подтверждена результатами координации тестовых лигандов в активных центрах ферментов 5/15-ЛОГ и ЛТА4Н. Данный подход позволяет избежать необходимости использования дорогостоящих программных пакетов молекулярного докинга, предлагающих для решения подобного рода проблем метод перебора оценочных функций и является более корректным и достоверным способом описания свойств термодинамических систем с точки зрения физической химии. Он также может быть использован для репараметризации активных центров металлопротеинов в топологических файлах, предназначенных для моделирования устойчивости макромолекулярных комплексов ферментов с лигандами методами молекулярной динамики. Используя аналогичный способ корректировки парциальных атомных зарядов на атомах лигандов, для которых также отсутствует соответствующая информация в параметрических файлах, разработана методика молекулярного докинга селенсодержащих органических соединений в программе AutoDock 4.2. На основании комплексного подхода к прогнозу биологической активности для сконструированных соединений, сочетающего последовательное использование методов SAR-, QSAR- и молекулярного докинга, разработана новая методика виртуального скрининга, позволяющая конструировать и осуществлять поиск селективных ингибиторов изо-форм ЦОГ, ЛОГ и блокаторов лейкотриеновых рецепторов. В результате молекулярного дизайна БАВ ресвератрола и активных компонентов нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) Диклофе-нак», «Индометацин», «Кетопрофен», «Фенилбутазон», «рофекоксиб» и противоопулевого лекарственного препарата «Левоглюкозенон», выполненного на основе разработанной методики, предложено более 50 новых структур хитов и соединений-лидеров, перспективных для дальнейших испытаний в качестве потенциальных противоопухолевых и противовоспалительных средств. Одновременно найдено, что эти веще-
ства обладают выраженными антиокислительными свойствами и низкой, либо умеренной токсичностью.
Практическая значимость работы. Показано, что алгоритмы, лежащие в основе работы ИС SARD-21, могут быть использованы для моделирования избирательности действия в отношении ферментов, ответственных за биосинтез лейкотриенов и простагландинов, а также для моделирования активности блокаторов лейкотриеновых рецепторов и конструирования новых соединений с выраженным противовоспалиель-ным действием, селективно ингибирующих каталитическую активность изоформ ЦОГ, ЛОГ.
SAR-модели интервального прогноза и распознавания эффективных ингибиторов изоформ ЦОГ, ЛОГ, ЛТА4Н и блокаторов рецепторов БЛТ/БЛТг могут быть использованы в виртуальном скрининге для обоснованного отбора структур-хитов с целью разработки на их основе новых лекарственных средств с выраженным противовоспалительным действием при снижении уровня гастротоксичности, а также отсева структур с неблагоприятным фармакологическим профилем. Кроме того, эти модели могут быть использованы для скрининга виртуальных библиотек с целью поиска новых структур соединений-хитов для создания на их основе новых противовоспалительных лекарственных средств.
QSAR-модели, построенные с использованием программ GUSAR и МОЕ (Molecular Operating Environment)3 могут найти применение в виртуальном скрининге для прогноза значений IC50 и IQ в отношении изоформ ЦОГ, ЛОГ, ЛТА4Н, гена hERG и тимидилат синтазы у потенциальных лекарственных средств противовоспалительного и противоопухолевого действия. На основании этой информации может быть установлен диапазон биологической активности, фармакологический профиль, а также выявлены побочные эффекты, включая гастро- и кар-диотоксичность, у соединений-хитов.
Закономерности, установленные в результате структурного анализа эффективных ингибиторов изоформ ЦОГ и ЛОГ, могут быть учтены при молекулярном дизайне новых соединений-хитов и модификации активных компонентов противовоспалительных и противоаллергических препаратов с целью повышения избирательности их действия в отношении ЦОГ-2, 5-ЛОГ и ЛТА4Н, а также рецепторов БЛТі/БЛТ2, CysLT-Rj/Rz.
Прогнозные системы оценки численных значений 1С5о по предложенным QSAR-моделям для БАВ в отношении изоформ ЦОГ, ЛОГ, ЛТА4Н и белка FLAP позволяют оценивать профиль их биологической активности методами in silico и их ферментативную селективность.
3 (дата обращения: 21.05.2015).
Кроме того, численные значения 1С5о для ингибиторов гена hERG, и изо форм ЦОГ могут быть использованы для предварительной оценки кардио- и гастротоксичности исследуемых соединений-хитов и соединений-лидеров.
В процессе виртуального скрининга при целенаправленном поиске новых нестероидных противовоспалительных средств и отсеве потенциально неэффективных соединений целесообразно последовательно использовать методы SAR-, QSAR и молекулярного докинга, что позволяет с одной стороны сократить количество прогнозируемых соединений-хитов, а с другой - увеличить уровень достоверности прогноза целевой активности.
Найденные кинетические характеристики для аналогов а-токоферола, производных изоборнилфенола и селеноорганических соединений позволяют: 1) ранжировать эти вещества по эффективности антиокислительного действия; 2) предсказывать эффективность антиокислительного действия в изменяющихся условиях.
В результате разработанного системного подхода предложены новые структуры БАВ, обладающих противовоспалительными и противоопухолевыми свойствами с уровнем распознаваемости не менее 70 %. При этом для ряда веществ из этого массива установлены антиокси-дантные свойства и получены количественные характеристики их эффективности.
Методология и методы исследования. Разработанный системный подход к моделированию взаимосвязи «структура-свойство» в ряду разных классов БАВ с выраженным противовоспалительным, противоопухолевым и антиокислительным действием базируется на современных методах виртуального скрининга, включая SAR-, QSAR-методы и метод молекулярного докинга. Выбор каждого из этих методов осуществлялся на основании проверки получаемых с его помощью результатов с экспериментальными данными.
Положения, выносимые на защиту.
- новый системный подход к виртуальному скринингу на базе комплекса методов, основанных на SAR-, QSAR-методах и методе молекулярного докинга для поиска соединений-хитов, избирательно инги-бирующих каталитическую активность изоформ ЦОГ, ЛОГ, ТС и блокирующих чувствительность лейкотриеновых рецепторов;
SAR-модели интервального прогноза и распознавания БАВ с выраженной противоопухолевой активностью;
модели интервального прогноза и распознавания ингибиторов изоформ ЛОГ, блокаторов рецепторов БЛТі/БЛТ2, чувствительных к лейкотриенам ЛТБ4, а также модель прогноза и распознавания селективных ингибиторов изоформ ЦОГ;
модели прогноза индекса селективности I, характеризующего избирательность действия БАВ в отношении ЦОГ-1 и ЦОГ-2 для ингибиторов биосинтеза простагландинов;
модели прогноза численных значений параметров ІС50 и IQ для эффективных/селективных ингибиторов изоформ ЦОГ и ЛОГ, а также блокаторов рецепторов БЛТі/БЛТ2 и CysLT-Rj/R^, чувствительных к лейкотриенам ЛТБ4 и цистеиниллейкотриенам;
новые соединения-хиты с выраженной противовоспалительной активностью и умеренной/низкой токсичностью, полученные в результате модификации активных компонентов НПВП «Диклофенак», «Кето-профен», ДВ «Рофекоксиб»;
результаты молекулярного докинга соединений-хитов, строение которых предсказано методами ТРО, в активные центры изоформ ЦОГ и 5-ЛОГ.
количественные характеристики антиокислительного действия для флавоноидов, производных хромана и селенсодержащих органических соединений и их корреляция с потенциальными фармакологическими характеристиками.
Достоверность и обоснованность результатов исследований.
Достоверность полученных результатов теоретических и экспериментальных исследований обеспечивается корректностью используемых методов компьютерного моделирования в соответствии с поставленными задачами. В частности, достоверность построенных SAR-моделей прогноза разных видов биологической активности подтверждается удовлетворительным уровнем распознавания по ним степени выраженности целевых свойств у органических соединений, входящих в обучающие и экзаменационные выборки. Использование информационной системы SARD-21 для конструирования новых структур хитов оправдано тем, что для найденных с ее помощью потенциально активных ингибиторов биосинтеза простагландинов, лейкотриенов, роста опухолевых клеток и антиоксидантов экспериментально установлены выраженные противовоспалительные, антиокислительные и противоопухолевые свойства. Обоснованность применения новой отечественной программы GUSAR для построения QSAR-моделей прогноза значений 1С5о и К! для ингибиторов биосинтеза простагландинов и лейкотриенов подтвеждена удовлетворительным уровнем прогноза количественных показателей биологической активности для разных классов органических соединений с известным фармакологическим профилем. Достоверность предложенного нами способа повышения точности моделирования координат лигандов в активных центрах ферментов методом молекулярного докинга подтверждается удовлетворительным совпадением расчетных и нативных положений тестовых лигандов. Адекватность
результатов предсказанной координации моделируемых соединений обеспечивается удовлетворительным совпадением их структур со структурами близких к ним по строению тестовых лигандов.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены на международных конференциях: Международная научно -техническая конференция «Наука и образование» (Мурманск, 2007, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013); Международная конференции «Биоанти-оксидант» (Москва, 2006, 2010); IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск. 2006); Международной конференции по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бейлынтейна до современности» ( Санкт-Петербург, 2006); International Symposium on Advances in Synthetic and Medicinal Chemistry ASMC 07 (Saint-Petersburg, 2007); XVIII Менделеевский Съезд по общей и прикладной химии ( Москва, 2007); XIX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011); Fourth International Symposium on Computational Methods in Toxicology Integrating Internet Resources (CMTPI-2007, Moscow); XVI Международная конференция по химической термодинамике (Иваново, 2007); JFB07 (Belgium, Namur, 2007); German conference on chemoinfor-matics (Goslar, 2009); Kazan Summer School on Chemoinformatics (Kazan, 2013); II Международной научной Интернет-конференции «Математическое и компьютерное моделирование в биологии и химии» (Казань, 2013); 20 EuroQSAR Understanding chemical-biological interactions (St-Petersburg, 2014).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 67 научных трудах, в том числе: 36 статей (в изданиях Перечня ВАК — 35) и патента на изобретение.
Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в проведении экспериментальных и теоретических исследований, в обработке и интерпретации полученных результатов, а также в подготовке к изданию научных публикаций.
Автор выражает глубокую признательность своему научному консультанту д.х.н., проф. Герчикову А.Я., д.б.н., в.н.с. Веселовскому А.В., д.б.н., в.н.с. Лагунину А.А., и д.б.н., проф. Зарудию Ф.С. за ценные научные консультации во время выполнения работы.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 332 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 475 источников. Работа включает 104 таблицы и 87 рисунков.
Преимущество методов 3D-QSAR перед ID- и 2D-QSAR-техниками моделирования активности
Методы 1D-QSAR является "классической" формой методов QSAR, в основном сосредоточенным на макроскопических свойствах химических соединений, представляя их в линейной форме, например, в виде молекулярных формул [22, 32-34]. Предопределенные переменные рассчитываются по их количеству в формуле вручную или с помощью калькулятора. Концепция построения уравнений в этом случае та же, что и в классическом подходе, разработанным Hansen. Для построения QSAR-моделей используется количество атомов того или иного типа, а также другие индикаторные переменные [19].
Методы 2D-QSAR по качеству описания свойств молекул значительно превосходят классический подход [22, 23, 27, 35, 36]. Они основаны на знаниях и требуют для построения модели информацию о строении соединений [37-39]. Топологическая закодированная информация является достаточным условием для построения модели. Для построения QSAR-уравнений используется ограниченное число переменных [27]. Эти дескрипторы достаточно легко и быстро рассчитываются из молекулярной структуры [40]. Для оценки предсказательной силы модели используются линейные и нелинейные методы, такие как метод множественной линейной регрессии, GA, GA-PLS и PLS [41]. Так как в 2D-QSAR-noflxofle модель строится на основе 2В-дескрипторов, то не требуется информация о пространственном строении и стереоизомерии моделируемых соединений. Однако в этом заключается существенный недостаток этого подхода при моделировании ферментативной избирательности низкомолекулярных соединений [42].
Подход 3D-QSAR является передовой, хорошо организованной и наиболее часто используемой техникой для изучения взаимосвязи «структура-активность». Его концепця ориентирована на предсказание биологической активности на основе 3D-свойств соединений-лидеров при использовании серии линейных и нелинейных аналитических методов прогноза. Цель этого метода заключается в повышении активности соединения-лидера путем его оптимизации или структурной модификации, отношения изучить структуру деятельности [43]. Количественная взаимосвязь между трехмерной структурой и активностью сосредоточена на таких свойствах атомов соединениях, которые зависят от геометрического строения, электростатической и квантовой природы молекулярной структуры. Упомянутые свойства впервые были изучены Hansh и др. с использованием мультилинейного регрессионного уравнения [44-45]. В SD-QSAR-методах эти свойства представлены в виде дескрипторов и описывают пространственную структуру молекул [45-46]. Прогноз биологической активности химических соединений, в основном, осуществляется на основе детальной информации о молекулах рецептора и лиганда. Эти методы могут дать косвенную информацию о пространственном строении активного центра моделируемого фермента в том случае, если информация о ЗБ-структуре молекул рецепторов неизвестна [47-48]. Первым шагом в исследовании 3D-QSAR является генерирование исходной геометрии структур лигандов и ее последующей корректировкой, опираясь на термодинамические характеристики, например, полную энергию. Наиболее часто для решения задачи оптимизации энергии используют полуэмпирические методы квантовой химии, молекулярную и квантовую механику [27]. На следующем этапе происходит корректировка геометрической структуры соединений-лидеров и создание базы данных конформеров, что достигается благодаря конформационной подвижности фрагментов моделируемых молекул. Затем этот набор конформеров включается в QSAR- исследование. Для конкретного исследования из набора конформеров выбираются биологически активные конформации. Отбор «правдоподобных» биологически активных конформеров происходит в результате совмещения набора конформеров со структурным аналогом, для которого экспериментально известны координаты в активном центре моделируемого фермента. В случае отсутствия таких данных теоретически рассчитывается афиинность всех конформеров с активным центром фермента. В дальнейшем в рамках автоматической процедуры происходит выравнивание всего конформационного набора. После процедуры выравнивания все биологически активные конформеры помещаются в масштабированную кубическую решетку и для каждого из них с использованием пробного зонда на каждом заданном исследователем шаге рассчитываются стерические и электростатические свойства. Полученный таким путем набор количественных данных представляет собой дескрипторное множество, содержащее информацию о физико-химических, геометрических и биологических свойствах молекул [43]. Расчет дескриптор может быть выполнен в сочетании с выравниванием биологически активных конформеров или без него [27].
Существует несколько методов, которые перед расчетом ЗО-дескрипторов используют процедуру выравнивания биоактивных конформеров органических соединений. Эти методы производят расчет дескрипторов путем отображения атомов рецепторов или лигандов или комплексов рецепторов с лигандом. Примерами методов, реализующих данный подход являются Сравнительный анализ молекулярных полей (CoMFA в английской аббревиатуре), Сравнительный анализ индексов молекулярного подобия (CoMSIA в английской аббревиатуре), Генетическое моделирование развивающегося рецептора (GERM в английской аббревиатуре), Сравнительный анализ связывающей энергии (CoMBINE в английской аббревиатуре), Адаптация полей для молекулярного сравнения (AFMoC в английской аббревиатуре), Пояснительный анализ взаимодействующих полей (ИГРА в английской аббревиатуре), Сравнительный анализ взаимодействий остатков (CoRIA в английской аббревиатуре) [27, 49-50]. Детальное описание алгоритмов работы этих методов с указанием достоинств и недостатков приведено в работах [19, 43, 50-59].
Традиционные методы, основанные на подходе выравнивания имеют достаточно много ограничений в использовании, так как они требуют значительных временных ресурсов и могут привести исследователя к выбору неверной потенциально биоактивной конформации лигандов, что способствует снижению предсказательной способности ЗО-С АЯ-модели. Для преодоления всех этих сложностей был разработан новый класс методов, которые не зависят от выравнивания, расположения и трансформации моделируемых молекул. В эту категорию входят такие наиболее общеизвестные методы Сравнительный анализ молекулярных моментов (СоММА), COMPASS, Holo-QSAR (HQSAR), метод взвешенных целостных инвариантных молекулярных дескрипторов (WHIM), Сравнительный спектральный анализ (CoSA), Решетка независимых дескрипторов ( GRIND) [19, 60-67]. 1.2.6. Статистические подходы выбора соответствующих молекулярных дескрипторов
В результате 2D- и 3D- QSAR- моделирования биологической активности органических соединений с использованием различных вышеупомянутых подходов генерируется огромное множество разного типа дескрипторов. Для сокращения признакового пространства традиционно используют следующие статистические подходы:
3D-QSAR подход ориентирован на распознавание фармакофорных фрагментах в биологически активных соединениях, оказывающих существенный вклад (положительный / отрицательный) в моделируемую активность [43]. Для облегчения восприятия результатов во всех этих методах предусмотрена визуализация найденной информации [67]. При этом по сравнению с классическими подходами 2D-QSAR, 3D-QSAR-методы допускают большее структурное разнообразие моделируемых молекул. Однако существенное отличие 3D-QSAR-MeTOflOB от 2В-подходов заключается в более жестком и надежном отборе независимых дескрипторов за счет использования метода главных компонент в сочетании с другими статистическими подходами для сокращения признакового пространства [32, 36]. В ряде случаев, где ID- и 2D-QSAR-подходы не «работают» 3D-QSAR-MeTOflbi могут выявить статистически значимые корреляционные зависимости между строением и биологической активностью органических соединений.
Перспективы применения методов ТРО для моделирования взаимосвязи «структура-свойство»
В результате окислительных превращений АК и других ПНЖК, катализируемых ЛОГ, образуются различные гидропероксиды, которые приводят к структурным изменения клеточных мембран.
Окисление АК включает отрыв Н-атома, который является лимитирующей стадией окислительных превращений АК, рисунок 1.5. В результате этого образуются радикальные интермедиаты, которые в дальнейшем превращаются через стадию образования сопряженных диенов в пероксиды липидов. Радикальный механизм метаболизма ПНЖК под действием изоформ ЛОГ детально представлен в работах [311-312].
Известно, что образование ПГ из АК также протекает по радикальному механизму. К настоящему времени спектрофотометрически методом ЭПР идентифицированы радикальные интермедиаты, образующиеся на разных стадиях в пероксидазном центре изоформ ЦОГ. Тем же методом измерены константы скорости некоторых элементарных стадий. Однако детальный механизм трансформации одних интнермедиатов в другие окончательно не установлен. Детали окислительных превращений АК в ПГ дискутируются многими исследователями [312].
Биосинтез ЛТ протекает в несколько стадий. На первом этапе под действием 5 ЛОГ образуется нестабильный молекулярныйинтермедиат - 5 гидроксиэйкозатетраеновая кислота (5-НРЕТЕ), которая затем превращается в лейкотриен ЛТА4. Гидролиз ЛТА4 под дейтвием ЛТА4-гидролазы (ЛТА4Н) приводит к образованию лейкотриенов ЛТБ4. Под действием ЛТС4-синтазы, гамма-глутамилтранспептидазы и дипептидазы из ЛТА4 последовательно синтезируются ЛТС4, ЛТД4 и ЛТЕ4.
Биологическое действие ЛТ на живые организмы реализуется посредством специфичных рецепторов: БЛТ1/БЛТ2 и CysLT-Rl/R2, которые чувствительны к ЛТБ4 и цистеиниллейкотриентам ЛТД4 и ЛТЕ4 соответственно. Специфичные к ЛТС4 рецепторы к настоящему времени не идентифицированы, в связи с чем полагают, что весь спектр побочных эффектов на фоне интенсивного протекания аллергических реакций обусловлен биотрансформацией ЛТС4 в ЛТД4 и ЛТДЕ4.
Известно, что ингибирование циклооксигеназного пути метаболизма АК приводит к активации механизма биосинтеза лейкотриенов, и, наоборот, ингибирование биосинтеза ЛТ способствует интенсивной выработке ПГ и и Тх из АК под действием изоформ ЦОГ.
Кроме того, продукты метаболизма арахидоновой кислоты, образующиеся с участием липоксигеназной ферментативной системы, а также ЦОГ-2 способны участвовать в канцерогенезе разичных органов и тканей [339-345].
Таким образом, комплексное ингибирование циклооксигеназного и липоксигеназного путей биосинтеза ПГ и ЛТ, а также блокирование чувствительных к ним рецепторов позволит предотвратить чрезмерную выработку этих эйкозаноидов и устранить их негативное влияние на живые организмы. Анализ литературных данных показал, что тематика систематического изучения взаимосвязи «структура 71 ингибирующая активность в отношении изоформ ЦОГ/ЛОГ» достаточно актуальна среди отечественных и зарубежных исследователей. Актуальность поиска антагонистов лейкотриеновых рецепторов объясняется и тем, что в настоящее время в фармакологической практике представлен довольно узкий ассортимента ингибиторов лейкотриенов и блокаторов их активности. Это зилеутон, монтелукаст зафирлукаст, пронлукаст.
Среди ферментов, участвующих в канцерогенезе различных органов и тканей следует выделить 12/15-ЛОГ, топоизомеразы и тимидилат синтазу. Топоизомераза I это локализованный в ядре клетки фермент, функция которого заключается в катализе топологических изменений, протекающих с молекулой ДНК в процессах репликации и транскрипции. Тимидилат синтаза катализирует метилирование дезоксиуридинмонофосфата (дУМФ) с превращением его в тимидинмонофосфат (ТМФ). Известно, что повышенная активность этих ферментов наблюдается в опухолевых клетках, вследствие их высокой скорости роста и развития. Поиск биологически активных веществ, способных ингибировать активность топоизомеразы -1 и тимидилат синтазы, а следовательно, замедлить процессы репликации и транскрипции опухолевых клеток, за счет ингибирования синтеза в них нуклеиновых кислот, является важной практической задачей медицинской химии, направленной на разработку эффективных лекарств для химиотерапии
В условиях избыточного количества информации по разным видам биологической активности БАВ интуитивный подход к анализу биологических данных о фармакологическом профиле новых потенциальных лекарственных средств без вовлечения методов компьютерной химии представляет собой трудновыполимую задачу, требующую значительных временных затрат. По этим же причинам синтез новых БАВ, основанный исключительно на интуитивном опыте исследователя, также является нерациональным. Современным и более эффективным способом решения фундаментальных и прикладных задач поиска новых эффективных потенциальных лекарств среди разных классов гетероциклических соединений является привлечение методов виртуального скрининга, базирующихся на анализе взаимосвязей «структура -активность» и оценце стерического соответствия лигандов с моделируемыми ферментами. Эти методы позволяют уже на досинтетической стадии создания потенциальных лекарственных соединений количественно предсказывать их биологическую активность [3, 14, 17-18, 67] и, следовательно, отобрать соединения для дальнейших доклинических и клинических испытаний.
Для исследований взаимосвязи "структура - свойство" использована компьютерная система SARD-21, реализующая основные принципы метода ТРО. Построение SAR-моделей, анализ связи «структура-свойство», а также конструирование структур новых соединений-хитов проводили на базе специальных процедур по методике, описанной в работах [346-368].
Характеристика обучающих и экзаменационных выборок для установления связи «структура-свойство» и построения моделей прогноза ингибиторов биосинтеза простагландинов и соединений с выраженной противоопухолевой активностью SAR-моделирование взаимосвязи «структура-противовоспалительная активность», «структура-противоопухолевая активность» в ряду разных классов органических соединений с использованием компьютерной системы SARD-21 проводили в соответствии с вышеописанными процедурами. Характеристики обучающих выборок и соответствующих им SAR- моделей представлены в таблице 2.1. Формирование обучающих и экзаменационных массивов проводили на основе экспериментальных данных о биологической активности моделируемых соединений, представленных в базе данных ChEMBL [369].
Построение QSAR-моделей прогноза параметра 1С5о для ингибиторов 5-липоксигеназы
Однако, как видно из данных в таблице 3.2, численные значения ІС50, предсказанные по моделям М24 и М26 для модификантов ДВ НПВП «Индометацин», лежат в довольно широком интервале. Аналогичные расхождения в прогнозе активности структур хитов наблюдаются при виртуальном скрининге с применением практически всех регрессионных зависимостей, найденных с использованием классического подхода 3D-QSAR, реализованного в программе МОЕ. Этот факт объясняется тем, что каждое из этих уравнений базируется на достаточно узком наборе дескрипторов, что не позволяет учесть особенности строения и электронных эффектов всех заместителей в тестируемых соединениях. При этом каждое из уравнений используется при прогнозе независимо друг от друга. Для более объективного учета всех структурных особенностей и электронных эффектов в молекулах необходимо использовать консенсусный подход, объединяющий однотипные частные закономерности, устанавливаемые на основе каждого из отдельно взятых регрессионных уравнений. Такая идеология консенсусного подхода к прогнозу активности реализована в отечественной компьютерной программе GUSAR. В связи с этим именно она нами была выбрана для дальнейших исследований, связанных с QSAR-моделированием ферментативной активности разных классов органических соединений..
Для более объективного учета всех структурных особенностей и электронных эффектов в молекулах необходимо использовать консенсусный подход, объединяющий однотипные частные закономерности, устанавливаемые на основе каждого из отдельно взятых регрессионных уравнений. Такая идеология реализована в отечественной компьютерной программе GUSAR. В связи с этим именно она была выбрана для дальнейших исследований. Программа GUSAR, реализует идеологию SAR и QSAR-методов. Она позволяет не только строить регрессионные уравнения, но и оценивать влияние структурных фрагментов на моделируемую активность. При этом каждая из QSAR- моделей, построенная с использованием программы GUSAR, представляет собой консенсус 360 частных моделей, что повышает надежность и достоверность получаемых с ее помощью результатов. Однако регрессионные уравнения в этой программе в явном виде не отображаются.
Моделирование количественной взаимосвязи «структура-свойство» для ингибиторов биосинтеза простагландинов, лейкотриенов и предшественников биосинтеза нуклеиновых кислот 3.4.2.1. Выбор метода расчета QSAR-моделей
Программа GUSAR позволяет строить консенсус модели как на одном (либо QNA-, либо MNA-дескрипторах), так и на двух типах дескрипторов, сочетая их в комбинированных моделях. Для выбора оптимального метода построения QSAR-моделей предварительно нами выполнены тестовые расчеты с использованием трех разных методов расчета независимых переменных: 1) на основе QNA-дескрипторов; 2) на основе MNA-дескрипторов; 3) в результате комбинации QNA- и MNA-дескрипторов. В качестве моделируемого свойства выбран параметр 1С so для ингибиторов ЦОГ-2 человека. В результате сравнительных исследований получено три QSAR-модели прогноза ICso для 1,5-дифенилзамещенных производных имидазола, отличающиеся друг от друга типом дескрипторов. Прогностическая способность моделей оценена по результатам достоверного прогноза параметра IC50 как для структур обучающих выборок. при скользящем контроле с исключением 20% соединений. Дополнительно, выполнена независимая проверка прогностической способности большинства моделей путем тестирования по ним структур, содержащихся в тестовых выборках. Результаты этих сравнительных исследований представлены в таблице 3.19.
Результаты таблицы 3.19, показывают, что алгоритмы построения регрессионных уравнений, а также дескрипторное описание структур химических соединений, лежащие в основе работы GUSAR, позволяют моделировать ингибирующую активность в отношении фермента ЦОГ-2 с приемлемыми статистическими показателями, то есть с R 0.6, Q 0.5. Небольшая разница между значениями R и Q для QSAR-моделей, построенных на одних и тех же обучающих выборках, но с использованием разных типов дескрипторов, свидетельствует об устойчивости создания данных моделей.
Консенсус модели МЗО, МЗЗ, М36, построенные на основе QNA-дескрипторов, характеризуются более низким качеством прогноза соединений обучающих выборок по сравнению с моделями, построенными на основе MNA-дескрипторов. Вместе с тем, они демонстрируют низкую предсказательную способность на структурах тестовых выборок, таблица 3.19.
QSAR-модели М31, М34, М36, построенные на основе MNA-дескрипторов, также характеризуются достаточной высокой точностью прогноза параметра IC50 для структур обучающих выборок и низкой предсказательной способностью на структурах тестовых выборок.
Применение комбинированного подхода к построению QSAR-мод елей, основанного на сочетании MNA- и QNA-дескрипторов, позволило получить модели М32, М35, М38, характеризующиеся высокими статистическими показателями и приемлемой точностью прогноза ICso для структур тестовых выборок, таблица 3.19. Эти данные подтверждают выводы других исследователей, согласно которым использование комбинированного подхода к построению консенсус моделей позволяет снизить вариабельность результатов предсказания отдельных моделей и, следовательно, получить более точный и достоверный результат. Кроме того, этот подход позволяет получить более объективную информацию о влиянии различных атомов в целевое свойство. В этой связи в дальнейшем построение QSAR-моделей проводили с использованием комбинированного подхода, основанного на сочетании обоих типов дескрипторов.
Изучение количественной взаимосвязи «структура-активность» для ингибиторов каталитической активности изоформ ЦОГ, ЛОГ, FLAP, ЛТА4Н, ТС и гена hERG С использованием комбинированного подхода к построению регрессионных уравнений, основанного на консенсус сочетании QNA- и MNA-дескрипторов, проведено моделирование количественной взаимосвязи между строением и эффективностью ингибирования каталитической активности ЦОГ-2, ЦОГ-1, 5-ЛОГ, 15-ЛОГ, белка FLAP, ЛТА4Н, ТС, гена hERG, блокаторов рецепторов БЛТі/БЛТг и CysLT-R1/R2 человека и мышей разными классами органических соединений, содержащихся в обучающих и тестовых выборках ОВ23 - ОВ183. При этом каждая из обучающих выборок включает в себя от 22 до 304 структур БАВ с разной степенью целевой активности. В итоге получено 103 QSAR-модели прогноза значений ICso и К; для ингибиторов биосинтеза простагландинов и лейкотриенов, а также блокаторов чувствительных к ним рецепторов, включая 38 QSAR-модели прогноза значений ICso для ингибиторов изоформ ЦОГ (ЦОГ-1/ЦОГ-2) человека, мышей и крыс; 2 QSAR-модели прогноза индекса селективности в отношении ЦОГ-2; 35 QSAR-модели прогноза значений ICso для ингибиторов 5-ЛОГ крыс и человека; 6 QSAR- моделей прогноза значений ICso для ингибиторов FLAP человека; 6 QSAR- моделей прогноза значений IC50 для ингибиторов ЛТА4-гидролазы человека; 14 QSAR- моделей прогноза значений IC50 и К; для блокаторов рецепторов, чувствительных к цистеиниллейкотриенам и лейкотриенам ЛТБ4; 2 QSAR-модели прогноза значений ICso для ингибиторов 15-ЛОГ диких кроликов. Дополнительно для предсказания кардиотоксических свойств и противоопухолевой активности модификантов было построено 8 QSAR-моделей прогноза эффективных ингибиторов гена hERG и 33 QSAR- моделей прогноза значений ICso для ингибиторов тимидилат синтазы мышей. Их статистические параметры представлены в таблицах 3.20-3.26. Все построенные модели являются статистически значимыми и обладают следующими характеристиками R2OB 0.6, R2TB 0.5, Q2 0.5, SD 0.5.
Молекулярный дизайн ингибиторов биосинтеза простагландинов, лейкотриенов и соединений с потенциальной противоопухолевой активностью
В результате сопоставительного изучения биологической активности производных 3-(3-(трет-бутилтио)-Ш-индол-2-ил1)-2,2-диметилпропановой кислоты с геометрическими характеристиками комплексов «макромолекула-лиганд», рассчитанных с использованием программы PLATINUM, на их основе, нами были получены уравнения (3.64)-(3.69), которые представлены в таблице 3.64.
Как видно из уравнения (3.64), повышению ингибирующей активности гетероциклических соединений с общей формулой 90 (llr-llu) и 95 (34-37) будет способствовать уменьшение их общей площади поверхности. Для соединений llj, 111, llo-llq с различными заместителями в положении 5 пиримидинового цикла (рисунок 2.22) установлено, что увеличение их общей площади контактирующей поверхности и площади гидрофильных контактов должно приводить к снижению ингибирующей активности этих соединений в отношении FLAP человека и крыс. Однако, явной корреляционной зависимости в последнем случае не выявлено. Как видно из уравнения (9), к аналогичному эффекту приведет увеличение их доли поверхности у структур с общей формулой 91, описанной параметром Match2. Повышению эффективности связывания соединений с общей структурной формулой 91 будет способствовать увеличение доли их контактирующей поверхности, описанной параметром Match . Для соединений с общей структурной формулой 94 (7, 14-17), которые отличаются от структур с общей структурной формулой 91 более разветвленным строением, наблюдается обратная закономерность. Для структур с общими формулами 93, 96-97 [408] подобных зависимостей не выявлено. Вместе с тем, соединений с общей формулой 97 наблюдается следующая тенденция: увеличение общей площади поверхности молекул будет способствовать снижению эффективности их ингибирующего действия в отношении белка FLAP.
Таблица 3.64. Уравнения, описывающие зависимость величины pICso, полученных методом связывания, для некоторых производных 3-(3-(трет-бутилтио) Ш-индол-2-ил1)-2,2-диметилпропановой кислоты с общими формулами 90-91,94-95 от геометрических параметров связывания их с активным центром FLAP Уравнение Stock_44_PMN № N R S.D. F P
В рамках аналогичного подхода изучено влияние природы циклических заместителей третичного атома азота у производных бензоксазола, бензтиазола и бензимидазола с общими формулами 98-104 [410] (рисунок 2.23) на эффективность их связывания с активным центром ЛТА4Н. Кроме того исследована эффективность связывания производных пиперидина, пиперазина, ариламидов глутаминовой кислоты, феноксифенила, 4-фениламинофенила и ]ЧГ-(4-(4-((Ш-пиррол-1-ил) фенокси)фенила с общими формулами 105-106 с активным центром этого же фермента [411-414]. В таблицах 3.65-3.67 представлены численные значения свободных энергий связывания и константы ингибирования для этих веществ, найденные методом молекулярного докинга.
Активный центр ЛТА4Н представляет собой достаточно протяженный и узкий пул, состоящий из полярной и гидрофобной областей. Такое строение связующего кармана затрудняет отнесение лигандов к разным кластерам докинг-решений. Гидрофобная часть активного центра образована преимущественно неполярными и малополярными аминокислотными остатками Ala 137 , Tip 311, Phe 314, Tip 315, Leu 365, Val 367, Leu 369, Pro 374, Ala 377, Tyr 378, Val 381, Pro 382. Полярная область образована ионом цинка координационно связанным с Glu 318, His 295, His 299 и молекулой воды W824. Ингибиторы ЛТА4Н в зависимости от природы входящих в их состав фрагментов образую два близко расположенных кластера, отличающихся друг от друга дальностью позиционирования от иона цинка,и, следовательно, способом взаимодействия с полярной областью центра.
В гидрофобном кармане позиционируются соединение-хит с кодом 798 (в PDB) и малополярные лиганды с общими формулами 98-104 (3-5, 10a-10g, lla-llg, 11k-11m, 13a-13d, 27b, 27e, 27j, 271, 33b, 33e, 33h, 33j, 331, 33n, таблица 3.65); некоторые структуры с общей формулой 105 (13R, S, 24 R, S, 29S-32S, 34 R, S, таблица 3.66); а также с общей формулой 106 (8j-81, 9b, 9f, 10, lla-llc, 12d, таблица 3.67), входящие в первый кластер. Они находятся от иона цинка на расстоянии 5-6 А и не способны вытеснить молекулу воды W824 из коорднацонной сферы иона цинка. Эффективность их связывания с ЛТАфН обеспечивается преимущественно за счет липофильных контактов с алифатическими и циклическими фрагментами аминокислот гидрофобного кармана. Дополнительно стабилизируют положение этих лигандов в активном центре водородные связи с Gin 134, Gin 136, Ala 377, Glu 271, а также Т-стэкинговые и тг—тг-взаимодействия с TYR 267, Phe 314, рисунок 3.25.
Соединение-лидер с кодом 25Р (из PDB), а также ингибиторы ЛТАфН с общими формулами 98-105 (llh, llj, 27h, 27n, 27o, ЗЗо, ЗЗр, 33r (таблица 3.65); 8h, 8i, 9a, 9c-9e, 9g, lid, lie, 12a-12c, 12e-12h (таблица 3.67)), которые содержат карбоксильную, амидную, ацетамидную группы и другие полярные циклические и алицикличекие концевые фрагменты, входят во второй кластер. Они позиционируются в более полярной области активного центра на расстоянии 2.1-3.0 Аот иона цинка и способны вытеснить координационно связанную воду W824, что обеспечивает наиболее эффективное их связывание с активным центром обсуждаемого фермента. Как следствие, лиганды подобного строения отличаются от малополярных аналогов более эффективным высокими значениями оценочных функций. Их положение в активном центре ЛТА4Н стабилизируют водородные связи с Gin 134, Gin 136, His 299, , Glu 296, Trp 311, а также Т-стэкинговые и 7г-7г-взаимодействия с Туг 383, Phe 314, рисунок 3.25. Не исключены липофильные контакты с аминокислотами гидрофобного кармана.
Следует отметить, что позы ингибиторов ЛТА4Н и аминокислотные остатки, участвующие в образовании Н-связей с молекулами лигандов, найденные и идентифицированные нами с помощью программы AutoDock, хорошо согласуются с данными других авторов, полученными для этих же лигандов с использованием других программ молекулярного докинга [410, 412, 414]. Этот факт позволяет нам сделать вывод о достоверности полученных результатов. В) производные пиперидина и Г) производные пиррола, толуола, пиперазина с общей формулой 105 феноксифенилацетамида и феноксифенила с общией формулой 106
Уравнения, описывающие зависимость величины pICso для серии производных бензоксазола, бензтиазола и бензимидазола, пиперидина и пиперазина с общими структурными формулами 98-99, 105 от геометрических параметров связывания их с активным центром ЛТА4Н, рассчитанные с использованием программы PLATINUM, представлены в таблице 3.68
Таблица 3.68. Уравнения, описывающие зависимость величины pICso для серии производных бензоксазола, бензтиазола, бензимидазола, пиперидина и пиперазина с общими структурными формулами 98-99, 105 от геометрических параметров связывания их с активным центром ЛТА4-гидролазы