Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Общие закономерности канцерогенеза 16
1.2. Устойчивость к стимуляции программируемой клеточной гибели 20
1.2.1. Апоптоз 20
1.2.2. Гены, участвующие во внутреннем пути активации апоптоза 25
1.3. Метилирование ДНК и канцерогенез 28
1.3.1. Гиперметилирование CpG-островков в геноме опухолевой клетки 29
1.4. МикроРНК и канцерогенез 29
1.4.1. Структура и функции микроРНК 29
1.4.2. Биогенез микроРНК 30
1.4.3. МикроРНК и рак 31
1.4.4. МикроРНК – регулятор апоптоза 38
1.5. Рак молочной железы 38
1.6. Опухоли яичников 42
1.7. Заключение 43
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Сбор и клинико-морфологические характеристики парных (опухоль/норма) образцов больных раком молочной железы и яичников 46
2.2. Выделение ДНК и РНК из биологического материала 49
2.2.1. Выделение ДНК из ткани 49
2.2.2.Выделение РНК 51
2.3. Оценка экспрессии белок-кодирующих генов методом SYBR Green ПЦР в реальном времени 53
2.3.1. Реакция обратной транскрипции 53
2.3.2. SYBR Green ПЦР в реальном времени 53
2.4. Оценка экспрессии генов микроРНК методом TaqMan ПЦР в реальном времени 55
2.4.1. Реакция обратнойтранскрипции 55
2.4.2. ПЦР с детекцией в реальном времени 56
2.5. Бисульфитная конверсия ДНК в растворе 57
2.6. Метил-специфичная полимеразная цепная реакция в реальном времени(МС-ПЦР-РВ) 58
2.7. Программное обеспечение 62
2.8. Статистическая обработка результатов 62
2.8.1. Метод RОС-анализа 63
Глава 3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Роль метилирования и аномальной экспрессии белоккодирующих генов и микроРНК, связанных с апоптозом, в развитии и прогрессии рака яичников с учетом клинико-морфологических параметров 67
3.1.1. Ассоциация аберрантного метилирования белоккодирующих генов и микроРНК с развитием и прогрессией (стадией, степенью дифференцировки и метастазированием) рака яичников 67
3.1.2. Ассоциация аномальной экспрессии белоккодирующих генов и микроРНК с развитием и прогрессией рака яичников 76
3.1.3. Роль аберрантного метилирования в нарушении экспрессии белоккодирующих генов и микроРНК в злокачественных опухолях яичников 80
3.2. Роль метилирования и аномальной экспрессии белоккодирующих генов и микроРНК, связанных с апоптозом, в развитии и прогрессии рака молочной железы с учетом клинико-морфологических параметров 81
3.2.1. Ассоциация аберрантного метилирования белоккодирующих генов и микроРНК с развитием и прогрессией (стадией, степенью дифференцировки и метастазированием) рака молочной железы 81
3.2.2. Связь аномальной экспрессии белоккодирующих генов и микроРНК с развитием рака молочной железы и иммуногистохимическими показателями 89
3.2.3. Роль аберрантного метилирования белоккодирующих генов и микроРНК в нарушение их экспресии в злокачественных опухолях молочной железы 95
3.3. Поиск взаимодействий микроРНК – ген-мишень при раке яичников и раке молочной железы 96
3.4. Новые маркеры для диагностики и прогноза рака молочной железы и рака яичников 97
3.4.1. Высокоэффективные системы маркеров для диагностики и прогноза метастазирования рака яичников 98
3.4.2. Высокоэффективные системы маркеров для диагностики рака молочной железы, в том числе на ранних стадиях 101
3.5. Влияние аномального метилирования и экспрессии генов системы апоптоза и микроРНК на патогенез рака яичников и молочной железы и новые молекулярные маркеры 103
Выводы 112
Список литературы 114
- Общие закономерности канцерогенеза
- Рак молочной железы
- Ассоциация аберрантного метилирования белоккодирующих генов и микроРНК с развитием и прогрессией (стадией, степенью дифференцировки и метастазированием) рака яичников
- Влияние аномального метилирования и экспрессии генов системы апоптоза и микроРНК на патогенез рака яичников и молочной железы и новые молекулярные маркеры
Общие закономерности канцерогенеза
Канцерогенез – это многоступенчатый процесс накопления изменений в геноме клеток, сопровождающийся патофизиологическими изменениями в клетках. [87]. Накопление генетических и эпигенетических повреждений в клетках сопровождается селекцией клона, способного к неконтролируемой пролиферации, и в дальнейшем, к метастазированию. В последнее десятилетие достигнут значительный прогресс, как в идентификации генов, нарушение функции которых ведут к развитию новообразований, так и в выяснении роли белковых продуктов таких генов в физиологии клетки. Все это позволило выделить ряд важнейших свойств, приобретение которых предопределяет способность клетки к образованию злокачественной опухоли (рисунок 1.):
1) Сниженная потребность во внешних сигналах для поддержания клеточной пролиферации, так называемая, самодостаточность в пролиферативных сигналах [119].
2) Приобретенные аномалии в морфологии и движении клеток, которые выражаются в нарушении формирования фокальных контактов и в ослаблении связи клеток с внеклеточным матриксом [60].
3) Пониженная чувствительность к антипролиферативным сигналам. Опухолевые клетки значительно менее чувствительны к действию факторов специфического и неспецифического противоопухолевого иммунитета. Они могут продолжать пролиферацию при повреждении ДНК и при прочих неблагоприятных условиях – недостатке нуклеотидов, гипоксии и т.д. [1, 54].
4) Иммортализация – неограниченное деление клеток. В зрелых клетках человека число делений ограничено в пределах 50-70 делений. Между тем, в опухолевых клетках наблюдается нарушение работы такого "счетно ограничительного" механизма контроля репликации, и связано это с возобновлением работы теломеразы [55].
5) Устойчивость к стимуляции программируемой клеточной гибели, что резко повышает жизнеспособность опухолевой клетки, делает ее не чувствительной к факторам противоопухолевого иммунитета и терапевтическим воздействиям [90].
6) Неоангиогенез – формирование дополнительной капиллярной сети. Это необходимое условие для дальнейшего роста первичного опухолевого узла размером более 1-2 мм. В ином случае, клетки в центре опухоли, не получая кислород и питательные вещества, погибают [179].
7) Образование метастазов – это еще один признак канцерогенеза и основная причина смерти больных. Он начинается с местной инвазии, за счет прорастания в расположенную рядом ткань, затем проникновение раковых клеток в близлежащие кровеносные и лимфатические сосуды. Далее, транзит раковых клеток по лимфатической и кровеносной системам, с последующим выходом этих клеток из просвета сосудов в паренхиму отдаленной ткани с образование мелких узелков опухолевых клеток (микрометастазов), и, наконец, рост микрометастазов в полноценные вторичные опухоли [87].
Важным признаком неопластических клеток является их генетическая и эпигенетическая нестабильность [26, 104, 146]. Генетическая и эпигенетическая нестабильность приводит к накоплению в одной клетке большого числа нарушений в онкогенах, генах-супрессорах опухолевого роста и других генах, придающих клетке совокупность свойств необходимых для образования опухоли. Изменчивость популяции опухолевых клеток складывается, главным образом, из четырех типов нарушений:
а) уменьшения точности воспроизведения генетической информации, а именно понижения точности репликации ДНК и сегрегации хромосом во время митоза;
б) нарушений в системах репарации повреждений ДНК или ошибок, возникших при ее репликации;
в) ослабления функции «точек проверки» клеточного цикла, активируемых в ответ на повреждения структуры ДНК, в результате чего клетка (несмотря на разрывы ДНК или изменения числа хромосом) продолжает делиться и умножать число аномальных потомков;
г) ослабления индукции апоптоза, вследствие чего делящиеся клетки с нарушениями не погибают, а выживают.
Таким образом, возникновение и развитие новообразований является эволюционным процессом, в котором естественный отбор направлен на сохранение приобретенных признаков опухолевых клонов, предоставляя им селекционное преимущество. Совокупность перечисленных аномалий обеспечивает повышенную частоту возникновения различных генетических и эпигенетических нарушений и их закрепление в ряду клеточных поколений [87].
Рак молочной железы
РМЖ является наиболее частым видом рака у женщин и наиболее распространенной формой рака во всем мире [51]. По данным Международного агентства по изучению рака IARC (International Agency for Research on Cancer) в мире ежегодно регистрируется более 1,4 млн. случаев РМЖ и погибает около 470 тыс. женщин. Показатели заболеваемости РМЖ в мире за последние 30 лет увеличились, что связано с различными социально-экономическими причинами (абсолютный рост заболеваемости) и улучшением скрининговой диагностики (относительный рост заболеваемости). Данное заболевание часто встречается не только у пожилых женщин, но и у лиц трудоспособного возраста (от 30-50 лет). В Российской Федерации РМЖ является также частым заболеванием (23,7% от всех злокачественных опухолей) и ведущей причиной смертности у женщин (17,8% смертей от злокачественных опухолей) [34].
Процесс канцерогенеза РМЖ можно представить в разных вариантах. Крайними вариантами являются те случаи, когда:
1) раковые клетки возникают в результате одномоментной мутации в геноме нормальных клеток с последующим их размножением и инвазией;
2) образование злокачественных опухолей представляет собой длительный и поэтапный процесс, в результате которого возникновению раковых клеток предшествуют стадии предопухолевых превращений клеток и тканей со своей морфологической структурой.
Патогенетические аспекты, характеризующие развитие РМЖ, разнообразны и многофакторны. К ним относятся как внешние факторы, такие как влияние окружающей среды, так и внутренние, к которым относятся всевозможные молекулярно-генетические изменения [19]. Выделяют несколько событий, связанных с развитием РМЖ: амплификации генов, сопровождаемые увеличением их экспрессии (онкогены K-RAS, HER-2 и др.), увеличение экспрессии генов без их амплификации (Ki-67, VEGF-A и др.), делеции (1p31-35, 3p21.31 и др.), мутации (K-RAS и др.), метилирование промоторов, сопровождаемое снижением экспрессии супрессорных генов (RASSF1, DAPK1), изменения экспрессии миРНК (miR-129-5pи др.) [19, 20, 152].
Несмотря на успехи молекулярной биологии в поиске генетических нарушений, связанных с развитием опухолей молочной железы, в клинической онкологии основная градация на подтипы РМЖ основана на иммуногистохимическом определении рецепторов эстрогенов и прогестерона (ER и PR), сверхэкспрессии HER2 и уровне пролиферативного потенциала Ki-67 [121].
Выделяют следующие подтипы РМЖ:
1) Люминальный тип А –ER, PR+, HER-2/neu-негативный, Ki67 низкий, 16%);
2) Люминальный тип В:
– ER и/или PR+, HER-2/neu- негативный, Ki67 высокий, 16%; – ER и/или PR+, Ki 67 любой, HER-2/neu позитивный);
3) Erb-B2 – ER, PR отсутствуют, HER-2/neu позитивный);
4) Тройной негативный рак – ER, PR отсутствуют, HER-2/neu негативный [17].
Этот факт еще раз подчеркивает, что РМЖ представляет собой клинически и генетически высокогетерогенное заболевание, при котором клиническая симптоматика, результаты лечения и прогноз зависят от подтипа и подгруппы опухоли [33]. Следует отметить, что на практике онкологи сталкиваются с ситуациями, когда люминальные подтипы РМЖ, характеризующиеся благоприятным течением, ведут себя крайне агрессивно, при этом заболевание быстро прогрессирует и нередко заканчивается летальным исходом. И наоборот, наиболее агрессивный рак с тройным негативным фенотипом может протекать годами и не требовать серьёзных терапевтических методов лечения [6]. Всё это требует поиска дополнительных молекулярно-генетических маркеров, позволяющих повысить точность как цитологического, так и гистологического заключений и максимально индивидуализировать лечение больных РМЖ.
В последнее десятилетие профилирование экспрессии генов помогло описать молекулярную неоднородность РМЖ. РМЖ классифицируется на шесть подтипов на основе молекулярных особенностей. Были разработаны генетические тесты, которые основаны на молекулярном «портрете», характерном для каждого подтипа РМЖ. Потенциальное использование миРНК в качестве диагностического инструмента обусловлено тем, что миРНК являются тканеспецифичными, и соответственно связаны с типом опухоли, и они могут стабильно обнаруживаться в биологических жидкостях [8,10, 35].
Присутствие миРНК в биожидкостях обусловлено их пассивным высвобождением из опухолевых клеток, таким образом, внеклеточные миРНК поступают из апоптозных или некротических тканей. Также существует мнение, что миРНК активно секретируется опухолевыми клетками. К настоящему времени для РМЖ получен ряд данных о роли миРНК (онко- и супрессорных миРНК) в регуляции генов-мишеней и в развитии и прогрессии этого заболевания [213]. Одним из путей регуляции экспрессии генов миРНК является изменение метилирования CpG-островка, прилежащего или перекрывающего ген миРНК.
Онко-миРНК инактивируют гены-супрессоры и активируют онкогенные транскрипционные факторы [168]. MiR-10b взаимодействует с HOXD10, тем самым, способствуя миграции и инвазии клеток [168]. MiR-155 подавляет SOCS1 как in vivo, так и in vitro, и повышение ее активности приводит к пролиферации клеток клеточной линии РМЖ MCF7 [210].
Опухоль-супрессорные миРНК имеют более низкий уровень экспрессии в раковых клетках и подавляют экспрессию онкогена, тем самым контролируя клеточную дифференцировку [209]. MiR-205 регулирует ген HMGB3, и эктопическая экспрессия которого ингибирует клеточную пролиферацию и способствует апоптозу при РМЖ [70].
Действие определенных миРНК (дуал-миРНК) зависит от клеточного или экзогенного окружения и приводит как к подавлению, так и стимулированию опухоли [105]. Это может частично объяснить все возможные нестыковки в результатах в различных исследованиях, посвященных миРНК. MiR-29 стимулирует метастазирование и EMT, подавляя гомологи пероксидазина при клеточной адгезии, но также способна сдерживать прогрессию рака путем ингибирования онкогенов, подавлением метилирования ДНК генов-супрессоров опухоли и повышением хемочувствительности [103].
Ассоциация аберрантного метилирования белоккодирующих генов и микроРНК с развитием и прогрессией (стадией, степенью дифференцировки и метастазированием) рака яичников
Исследованы профили метилированиятрех апоптоз-ассоциированных БКГ, у которых были локализованы CpG-островки: BCL2, DAPK1 и BAX. Исследование выполнено на 42 парных образцах первичных опухолей (норма/опухоль), а также на 9 триплетах первичных опухолей с макро-метастазами (норма /опухоль /макрометастаз) методом количественной метилспецифичной ПЦР в реальном времени (рисунок 10А и 10Б). Результаты приведены в виде градиента от 0% (отсутсвие метилирования) до 100% (метилирование всех копий гена). При сравнении уровня метилирования в образцах опухоли и условно нормальной ткани для генов BCL2, DAPK1 и BAX при помощи теста Манна-Уитни выяснилось, что уровень метилирования в опухоли статистически значимо выше в сравнении с парной условной нормой для всех трех исследованных генов: DAPK1 (p=0.04, FDR=0.1), BAX (p 0.01, FDR=0.05) и BCL2 (p 0.01, FDR=0.05), (рисунок 11). Следует отметить, что для антиапоптозного гена BCL2 отмечено нехарактерное увеличение уровня метилирования в опухоли (медиана 30.0%, диапазон 11.8-63.9%) по сравнению с морфологически нормальной тканью яичника (медиана 12.7%, диапазон 6.0-33.7%), что может говорить о двоякой функции этого гена в развитии РЯ. При этом показано возрастание уровня метилирования гена BCL2 в образцах макрометастазов (медиана 19.6%, диапазон 4.8-68.1%) посравнению с первичной опухолью (медиана 9.7%, диапазон 6.4-49.8%), но различия были статистически не достоверны ввиду небольшого размера выборки.
Используя критерий Манна-Уитни для независимых выборок, нами был проведен анализ изменения уровня метилирования генов BCL2, DAPK1 и BAX в зависимости от клинико-морфологических параметров опухолей яичников: стадией, степенью дифференцировки, размером опухоли, наличием или отсутствием метастазов в лимфатических узлах или отдаленных органах. Для генов DAPK1 и BCL2 статистически значимых корреляций найдено не было ни для одного из параметров. В тоже время для гена BAX показано статистически значимое (p=0.001, FDR=0.01) увеличение уровня метилирования на III-IV стадии (медиана 19.6%, диапазон 1.0-33.0%) по сравнению с I-II стадией (медиана 0.7%, диапазон 0.0-1.4%) (рисунок 12А). Также статистически значимо высокий уровень метилирования гена BAX связан с увеличением размера опухоли (Т1/Т2 (медиана 0.7%, диапазон 0.1-1.4%) против Т3/Т4 (медиана 19.6%, диапазон 1.0-32.9%), р 0.01) и наличием метастазов (N0M0(медиана 1.1%, диапазон 0.1-16.0%) против NxMx (медиана 24.3%, диапазон 1.1-33.2%), р=0.02) (рисунок 12Б и В).
Таким образом, полученные данные позволяют говорить об участии генов BCL2, DAPK1 и BAX в патогенезе и прогрессии РЯ. Отмечено гиперметилирование анти-апоптозного гена BCL2, свойственно онко супрессорам. На двойственные черты гена BCL2 указывали и другие авторы [99]. Проведен анализ статуса метилирования 11 генов миРНК (MIR-124-1/2/3, MIR-125b-1, MIR-127, MIR-129-2, MIR-137, MIR-148а, MIR-193a, MIR-203a и MIR 70 375) на 76 парных образцах РЯ (рисунок 13) методом количественной МС-ПЦР-РВ.
Уровень метилирования был статистически значимо выше в образцах опухоли, чем в гистологически неизмененной ткани яичников у 9-ти генов миРНК: MIR-124-1, MIR-124-2, MIR-124-3, MIR-125b-1, MIR-127, MIR-129-2, MIR-137, MIR-193a и MIR-203a (p 0.05, FDR=0,05) (рисунок 14). Следует подчеркнуть, что гиперметилирование 6-ти генов миРНК (MIR-124-1, -124-2, -124-3, -127, -137 и -193а) при РЯ показано впервые. Эти результаты позволяют предположить связь метилирования данных 9-ти генов с патогенезом РЯ.
Далее данные о изменении уровня метилирования для 11-ти генов миРНК были сопоставлены с клинико-морфологическими характеристиками опухолей яичников (стадией, степенью дифференцировки, размером опухоли, наличием или отсутствием метастазов в лимфатических узлах или отдаленных органах). Используя критерий Манна-Уитни для независимых выборок, было показано статистически значимое увеличение уровня метилирования на III-IVстадии по сравнению с I-II стадией для 10-ти генов миРНК: MIR-124-1, MIR-124-2, MIR-124-3, MIR-125b-1, MIR-127, MIR-129-2, MIR-137, MIR-193a, MIR-203a и MIR-375 (p 0.05) (рисунок 15). Также статистически значимо высокий уровень метилирования 8-и генов миРНК (MIR-124-2, MIR-125b-1, MIR-127, MIR-129-2, MIR-137, MIR-193a, MIR-203a, MIR-375) связан с увеличением размера опухоли (Т1/Т2 против Т3/Т4, р 0.01, FDR = 0.05) и 9-ти генов (MIR-124-2, MIR-124-3, MIR-125b-1, MIR-127, MIR-129-2,MIR-137, MIR-193a,MIR-203a,MIR-375) – с наличием метастазов в лимфатических узлах (р 0.01, FDR = 0,05); (N0M0 против NxMx)) (рисунок 16 и 17).
Для гена MIR-148a статистически значимых отличий при сравнении со всеми клинико-морфологическими характеристиками опухолей найдено не было.
Таким образом, полученные нами данные показывают роль метилирования 10-ти исследованных генов миРНК (MIR-124-1/-2/-3, MIR-125b-1, MIR-127, MIR-129-2, MIR-137, MIR-193a, MIR-203a, MIR-375) в патогенезе и прогрессии РЯ.
Образование метастазов (вторичных очагов опухолевого роста) является основным критерием злокачественности опухоли. Чтобы подтвердить связь гиперметилирования 9-ти генов миРНК (MIR-124-2, MIR-124-3, MIR-125b-1, MIR 127, MIR-129-2, MIR-137, MIR-193a, MIR-203a, MIR-375) с метастазированием, был проведен дополнительный анализ метилирования этих генов в образцах с метастазами в брюшной полости (перитонеальными метастазами).
Дополнительный набор образцов включал: 1) 3 триплета, состоящих из гистологически нормальной ткани, первичных опухолей и соответствующих метастазов в брюшину (pM1-pM3), а также 2) десять первичных опухолей и парные метастазы в брюшину (pM4-pM13). Как видно из рисунка (рисунок 19), наблюдается метилирование ДНК почти всех 9-ти генов миРНК в первичных опухолях и соответствующих перитонеальных метастазах в триплетах и парах, но метилирование ДНК почти всех генов миРНК в образцах нормальной ткани, не выявляется.
Эти данные подтверждают участие метилирования группы генов миРНК в эпигенетической модификации ДНК в первичных опухолях во время метастазирования. При сравнении образцов метастазов с первичными опухолями, глобальных изменений в статусе метилирования 9-ти генов миРНК во вторичных опухолевых клетках обнаружено не было.
Влияние аномального метилирования и экспрессии генов системы апоптоза и микроРНК на патогенез рака яичников и молочной железы и новые молекулярные маркеры
Настоящая работа направлена на изучение молекулярных механизмов канцерогенеза при РМЖ и РЯ человека с целью выявления закономерностей образования и прогрессии данного вида опухолей. Изучены механизмы регуляции генов системы апоптоза: проапоптозных генов RASSF1, DAPK1, APAF1, BIM, BAX и антиапоптозного гена BCL2, а именно, вовлеченность миРНК и метилирования в регуляцию экспрессии этих генов. По результатам биоинформатического анализа баз данных отобраны миРНК, предположительно связанные с регуляцией экспрессии отобранных БКГ. Также исследован их собственный статус метилирования. Построены профили метилирования отобранных генов миРНК и БКГ в парных образцах РМЖ и РЯ. По результатам исследования, при РЯ было показано статистически значимое гиперметилирование генов BCL2, DAPK1 и BAX в образцах опухолей по сравнению с парной гистологически нормальной тканью яичников. При РМЖ наблюдали гиперметилирование 4 про-апоптозных генов (RASSF1, DAPK1, BIM, BAX) и, напротив, гипометилирование BCL2. Ранее имелись сообщения о гиперметилировании гена DAPK1 в некоторых видах опухолей, но данные о роли метилирования этого гена в прогрессии РМЖ представлены единичными сообщениями [197,125]. Результаты, полученные в нашей работе по уровню гиперметилирования DAPK1 в опухолях РМЖ, согласуются с данными литературы [175]. Статус метилирования гена RASSF1 был исследован при различных опухолях [62], в том числе и при РМЖ [197]. Связанная с метилированием инактивация гена RASSF1 наблюдалась также в клеточных линиях яичников и плоскоклеточного рака пищевода [78].
Однако, до проведения данного исследования вопрос о роли метилирования промоторных CpG-островков в регуляции генов BCL2, BIM и BAX в тканях РМЖ не был выяснен (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/, 2019). Так, при анализе литературы, представленной в базе PubMed, однозначные данные о роли метилирования в регуляции гена BCL2 при РМЖ не выявлены. Отмечено, что при многих онкологических заболеваниях наблюдается как деметилирование промоторного CpG-островка гена BCL2, приводящее к его гиперэкспрессии [25, 48], так и подавление экспрессии гена BCL2, посредством связывания миРНК с регуляторными областями этого гена [141].
В регуляции экспрессии генов миРНК, как и БКГ, принимает участие метилирование их промоторных CpG-островков [31, 38]. Следует отметить, что гены миРНК, регулируемые метилированием, встречаются в 5-6 раз чаще, чем БКГ [113]. Поэтому нами был оценен статус метилирования генов миРНК и его влияние на изменение профиля экспрессии миРНК. Важно подчеркнуть, что метилирование генов миРНК при РЯ рассматривалось ранее лишь в единичных работах в отличие от более активно исследуемых заболеваний, как колоректальный рак, рак легких и РМЖ (PubMed, 2019).
В работе показано гиперметилирование 9-ти генов миРНК (MIR-124-1, -124-2, -124-3, -125b-1, -127, -129-2, -137, -193a и -203a) при РЯ и было идентифицировано 7 новых генов миРНК, гиперметилированных при РЯ, за исключением MIR-129-2 и MIR125b-1, о метилировании которых сообщалось ранее [152]. Эти результаты позволяют предположить связь метилирования данных 9-ти генов с патогенезом РЯ. Кроме того, нами впервые показано гиперметилирование генов MIR-125b-1, MIR-127 и MIR-375 при РМЖ.
Использование общего подмножества 42 образцов РЯ и 41 образца РМЖ в исследовании экспрессии и метилирования позволило выявить высокую корреляцию между изменениями метилирования и уровнем экспрессии исследованных генов. Впервые, при РЯ для 7 генов миРНК (MIR-124-1, -124-3, -125b-1, -127, -129-2, -137, - 375), и при РМЖ для 4 генов миРНК (MIR-129-2, -148a, -125b-1, - 375) установлены значимые корреляции между изменениями уровня экспрессии и статуса метилирования, что указывает на функциональную роль метилирования в регуляции данных генов миРНК в патогенезе РЯ и РМЖ.
Кроме того, полученные результаты подтверждают данные литературы об опухоль-супрессорной функции 3-х миРНК (miR-129-5p, miR-125b-1, miR-137), включенных в исследования на клеточных культурах РЯ [84, 116, 128, 167,217]. Корреляция гиперметилирования MIR124-1, -124-3, -127 со снижением уровня экспрессии также указывает на супрессорную функцию этих миРНК, что показано ранее в экспериментах на клеточных линиях РЯ и РМЖ [50, 159, 216]. Гиперметилирование и снижение уровня экспрессии гена MIR-125b-1 согласуется с супрессорной miR-125b при РМЖ, что установлено ранее, главным образом, с применением клеточных культур [127]. В других работах также показано, что гиперметилирование промоторных областей гена MIR-125b-1 ингибирует его экспрессию при РЯ и РМЖ [215].
Сведения литературы по изменению уровня экспрессии и метилирования гена MIR-375 в опухолях отличаются неоднозначностью и, по-видимому, специфичны для разных видов рака. Гиперметилирование MIR-375 показано в опухолях разных локализаций и ассоциировано со снижением экспрессии этого гена [126]. Так, например, в одной из работ [130] было показано снижение уровня экспрессии miR-375 в клеточных линиях РМЖ MCF-7 / ADM и MCF-7 / PTX, которое является результатом метилирования промоторного СpG-островка гена MIR-375. Напротив, на ER-позитивных клеточных линиях опухолей молочной железы, отмечена высокая экспрессия miR-375, которая связана с локальным гипометилированием ДНК [64].
В работе Xu и соавт. [196] показано, что подавление экспрессии miR-148a при РМЖ связано с гиперметилированием промоторной области гена MIR-148a, что согласуется с полученными нами результатами. В работе Bandres и соавт. [45] показано, что применение деметилирующих агентов вызывало восстановление экспрессии miR-129-2 и торможение роста культуры клеток опухолей толстой кишки и молочной железы, что является прямым доказательством эпигенетической регуляции экспрессии этого гена.
Таким образом, полученные нами данные о системной роли метилирования в подавлении экспрессии группы генов предположительно регуляторных миРНК в опухолях РМЖ и РЯ находят подтверждение в данных зарубежной литературы и значительно расширяют круг генов миРНК, де-регулируемых метилированием в этих видах рака.
Кроме того, нами было показано, что метилирование промоторных CpG-островков БКГ RASSF1, DAPK1, BIM, BAX, APAF1, BCL2 и MIR-124-1, -127, -129-2 коррелирует с клинической стадией; генов RASSF1, DAPK1, BIM, BAX, APAF1, MIR-127 — с размером опухоли; генов RASSF1, BIM, BAX, MIR-124-1/3, -125b-1, 127 — с метастазированием при РМЖ. А метилирование БКГ BAX и MIR-124-1/-2/-3, -125b-1, -127, -129-2; -137, -193a, -203a, -375 значимо коррелирует с клинической стадией; генов BAX, MIR-124-2, -125b-1, -127, -129-2, -137, -193a, -203a, -375 — с размером опухоли; генов BAX, MIR-124-2/3, -125b-1, -127, -129-2; -137, -193a, -203a, -375 — с метастазированием при РЯ. Показано статистически значимое увеличение уровня метилирования генов миРНК MIR-124-2, MIR-129-2, MIR-127 и MIR-137 при снижении степени дифференцировки (G1/G2 против G3/G4) опухолевых клеток при РЯ. Выявлено увеличение уровня метилирования генов BIM и BAX в опухолях не чувствительных к гормонотерапии (при отсутствии экспрессии рецептора прогестерона, PR), а также при промежуточном и высоком уровне экспрессии антигена Ki67 при РМЖ.
Ассоциация гиперметилирования некоторых генов миРНК с метастазированием согласуется с литературными данными о функциональных особенностях этих миРНК в культурах клеток РЯ. Например, сообщалось, что miR-124, miR-125b, miR-137 ингибируют пролиферацию, инвазию опухоли и миграцию раковых клеток яичников, а miR-203а - клеток молочной железы [67,135, 201, 216]. В свою очередь, miR-375 в одних работах рассматривается как новый биологический маркер для раннего выявления метастазов [136], в других -как новый прогностический маркер течения РМЖ [135, 208], а miR-127 - как новый биологический маркер для раннего выявления метастазов [177], а также как новый прогностический маркер течения РМЖ [186].
Гиперэкспрессия miR-137 приводит к снижению пролиферации миграции клеточной линии MDA-MB-231 РМЖ, воздействуя на экспрессию эстрогенового рецептора (ERR) [220], а также подавляла миграцию и инвазию клеток РЯ путем блокирования сигнального пути EZH2-STAT3, тем самым увеличивая чувствительность опухолей яичника к цисплантину [164]. Функциональный анализ показал, что miR-137 подавляет пролиферацию клеток, вызывает остановку клеточного циклав G1 фазе и апоптоз, ингибирует миграцию и инвазию клеток, влияет на дифференцировку стволовых клеток [214].