Введение к работе
Актуальность проблемы. Множественная миелома (ММ) является злокачественным лимфопролиферативным заболеванием, которое сопровождается экспансией клона трансформированных плазматических клеток в костный мозг, что приводит к остеолитическому поражению костей и другим органным нарушениям [Palumbo, Anderson, 2011]. Несмотря на существенный прогресс в лечении ММ и применение современных иммуномодулирующих препаратов, данное заболевание является неизлечимым. Поэтому актуальность поиска новых лекарственных средств для увеличения продолжительности и улучшения качества жизни больных ММ не вызывает сомнений, а изучение факторов, лежащих в основе патогенеза данного заболевания, необходимо для выявления новых подходов к его лечению.
Стимуляция активности естественных киллерных (ЕК) клеток, играющих важную роль в противоопухолевой защите организма, является одним из перспективных направлений для лечения онкологических заболеваний. К одному из компонентов патогенеза ММ относят снижение функциональной активности ЕК клеток [Godfrey, Benson, 2012]. Изучение изменений фенотипических и функциональных свойств ЕК клеток при ММ важно как для понимания роли их дисфункций в патогенезе этого заболевания, так и для выбора путей разработки противоопухолевых препаратов, действие которых направлено на коррекцию нарушений функционирования ЕК клеток.
В последнее время в клинической практике широкое применение находят моноклональные антитела к различным молекулам на внешней поверхности опухолевых клеток. Эти антитела осуществляют свое действие за счет блокирования процессов, необходимых для жизнедеятельности малигнизированных клеток, и активации сигнальных путей апоптоза. Кроме того, в результате взаимодействия моноклональных антител с клетками-мишенями повышается эффективность процесса распознавания неопластических клеток клетками иммунной системы, а именно ЕК клетками [Weiner et al., 2010]. Хотя препараты на основе моноклональных антител к опухолевым антигенам уже успешно используются в противоопухолевой терапии, механизм их действия на ЕК клетки до конца не изучен и его выяснение представляет актуальную задачу для совершенствования связанных с иммунотерапией подходов к лечению онкологических заболеваний.
Мишенью действия моноклональных антител на клетки ММ может служить рецептор SLAMF7 (Signaling Lymphocyte Activating-Molecule Receptor Family 7), который присутствует на поверхности клеток ММ и в значительно меньших количествах на других иммунных клетках, в частности ЕК [Hsi et al., 2008]. Использование антител к данному рецептору рассматривается, как перспективный путь иммунотерапии ММ, что обусловливает необходимость детального исследования механизмов действия моноклональных антител к SLAMF7 на функциональную активность ЕК клеток, которое ранее не проводилось. Работы по изучению противоопухолевой активности ЕК клеток больных ММ и выявление причин нарушения их функций позволят определить оптимальные пути их коррекции, а также обосновать целесообразность применения моноклональных антител, в частности антител к рецептору SLAMF7 для лечения ММ.
Другим перспективным направлением в лечении опухолевых
заболеваний может стать использование природных антимикробных пептидов
(АМП) врожденного иммунитета или их аналогов. Установлено, что реализация
защитных функций системы врожденного иммунитета основана на тесном
взаимодействии его компонентов. АМП содержатся в нейтрофильных гранулоцитах,
клетках барьерных эпителиев и ряде других типов клеток, и принимают участие в
инактивации патогенных микроорганизмов [Boman, 2003]. Однако, наряду с
антимикробным действием, у ряда пептидов была обнаружена
иммуномодулирующая и противоопухолевая активность [Wang., 2014; Кокряков, 2006, Шамова и др., 2007]. К настоящему времени цитотоксическое действие пептидов на клетки ММ изучено не было, также как малоизученной остается и возможность модулирования пептидами функциональной активности ЕК клеток. Циркулирующие в кровяном русле или присутствующие в различных тканях нейтрофилы, в лизосомоподобных гранулах которых содержатся АМП (-дефенсины, кателицидины и др.), при определенных стимулах секретируют эти молекулы, которые при взаимодействии с ЕК клетками, возможно, влияют на их активность. Учитывая, что патологический процесс, связанный с развитием ММ, протекает, главным образом, в костном мозге, можно предположить, что АМП нейтрофилов (-дефенсины, кателицидин), созревающих в костном мозге, или АМП клеток костной ткани (например, -дефенсин-3, продуцируемый остеобластами), могут оказывать, как прямое действие на миеломные клетки, так и модулировать функциональную активность ЕК клеток в отношении клеток ММ. Роль нейтрофилов в канцерогенезе неоднозначна [Данилова, Балдуева, 2016]. Проведение данных исследований поможет понять роль АМП врожденного иммунитета в противоопухолевой защите организма, в частности при развитии ММ, а также выяснить возможность создания на основе этих пептидов лекарственных препаратов для коррекции этой патологии.
Целью работы является характеристика дисфункций ЕК клеток при ММ на разных стадиях заболевания, а также изучение возможных путей коррекции функциональной активности ЕК клеток.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
-
Оценить относительное содержание различных популяций лимфоцитов в периферической крови и аспиратах костного мозга (КМ) больных ММ, характеризующих активность иммунной системы, при впервые выявленной миеломе и у больных с рефрактерной миеломой на стадии рецидива.
-
Исследовать изменения, происходящие в ЕК клетках периферической крови и аспиратах костного мозга больных ММ на разных стадиях заболевания: оценить экспрессию активирующих рецепторов, маркеров активации и созревания ЕК клеток.
-
Оценить экспрессию SLAMF7 на мембранах клеток: 1) ММ; 2) ЕК здоровых доноров и больных ММ; 3) различных популяций мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров.
-
Изучить влияние антител к SLAMF7 на активацию и дегрануляцию ЕК клеток больных ММ и здоровых доноров.
-
Изучить механизм активации и дегрануляции ЕК клеток в присутствии моноклонального антитела HuLuc63.
-
Изучить эффекты антимикробных пептидов системы врожденного иммунитета
5 (- и -дефенсинов человека, протегрина 1, бактенецина) на функциональную активность ЕК клеток здоровых доноров и их цитотоксическое действие на клетки ММ.
Научная новизна. Впервые проведен комплексный анализ нарушений функций основных звеньев противоопухолевой защиты организма при ММ, включающий сравнительную характеристику популяций лимфоцитов, оценку экспрессии активирующих рецепторов, маркеров активации и созревания ЕК клеток периферической крови и аспиратов костного мозга больных ММ на разных стадиях развития заболевания – у больных с впервые выявленной миеломой и пациентов с рефрактерной миеломой, на стадии рецидива. До настоящего времени описаны, в основном, лишь нарушения отдельных компонентов врожденного и приобретенного иммунитета, участвующих в патогенезе ММ.
Впервые выполнено количественное исследование экспрессии рецептора SLAMF7 на ЕК клетках больных ММ, а также изучено влияние различных моноклональных антител к SLAMF7 на активацию и дегрануляцию ЕК клеток здоровых доноров in vitro.
Впервые получены данные, позволяющие разработать модификацию антитела к SLAMF7 - HuLuc63, обладающую повышенной аффинностью к рецептору CD16 на ЕК клетках по сравнению с исходным антителом, а также оказывающие выраженное действие на дегрануляцию и активацию ЕК клеток.
Впервые охарактеризовано прямое цитотоксическое действие антимикробных
пептидов врожденного иммунитета (- и -дефенсинов, кателицидина человека,
протегрина 1, бактенецина 3.4) в отношении клеток ММ, а также установлено
свойство некоторых из них модулировать цитотоксическое действие ЕК клеток в
отношении клеток-мишеней (ММ и других) in vitro. Получена новая информация об
эффектах АМП на экспрессию маркера ранней активации лимфоцитов CD69.
Комплекс представленных данных об эффектах антимикробных пептидов,
содержащихся в нейтрофилах и клетках костной ткани, на клетки ММ, и на
функциональную активность ЕК клеток, способствует формированию
представлений о значимой роли АМП в противоопухолевой защите организма.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
У больных ММ изменяются соотношения клеточных популяций лимфоцитов (В, ЕК и Т клеток) в периферической крови и костном мозге, эти изменения наиболее выражены у больных с рефрактерной миеломой на стадии рецидива.
-
При прогрессировании ММ происходит изменение фенотипа ЕК клеток периферической крови – ЕК клетки больных с рефрактерной миеломой на стадии рецидива являются более активированными, менее зрелыми клетками, на мембране которых снижена экспрессия активирующих рецепторов, причем эти различия в большей степени проявляются у ЕК клеток костного мозга по сравнению с ЕК клетками периферической крови.
-
Моноклональные антитела к рецептору SLAMF7, который присутствует на мембранах клеток ММ, а также ЕК клеток и других лимфоцитов, повышают дегрануляцию и активацию ЕК клеток здоровых доноров, причем наиболее выраженным действием обладает HuLuc63.
-
Моноклональное антитело к SLAMF7 - HuLuc63 повышает дегрануляцию ЕК клеток, полученных из периферической крови и костного мозга больных ММ.
-
Увеличение уровня экспрессии SLAMF7 на клетках-мишенях сопровождается повышенной дегрануляцией ЕК клеток в присутствии HuLuc63, а действие HuLuc63 реализуется преимущественно по CD16-опосредованному пути.
-
АМП врожденного иммунитета обладают цитотоксическим действием в отношении клеток ММ, а также повышают эффективность ЕК клеток, повреждая мембраны клеток-мишеней и облегчая реализацию цитотоксической активности ЕК клеток.
Теоретическая и практическая значимость. Исследованы фенотипические и функциональные свойства ЕК клеток периферической крови и костного мозга больных ММ, а также механизм действия ряда новых соединений– моноклональных антител к SLAMF7 и АМП, модулирующих функции ЕК клеток. Выявленные изменения в относительном содержании различных популяций лимфоцитов, интенсивности экспрессии активирующих рецепторов ЕК клеток периферической крови и костного мозга больных ММ, невосприимчивых к лечению, и пациентов с ММ на стадии рецидива, раскрывает механизмы нарушения функций иммунной системы при прогрессировании ММ. Обнаруженные различия вносят вклад в понимание роли дисфункций ЕК клеток в патогенезе ММ, а также могут послужить основой для разработки новых препаратов для коррекции функциональной активности ЕК клеток.
Моноклональные антитела к SLAMF7 увеличивают активацию и дегрануляцию ЕК клеток здоровых доноров и больных ММ. Увеличение дегрануляции ЕК клеток в присутствии моноклонального антитела HuLuc63, Fc фрагмент которого обладает повышенной аффинностью к CD16, указывает на то, что механизм действия HuLuc63 осуществляется преимущественно по CD16-опосредованному пути и может послужить платформой для разработки нового поколения моноклональных антител с более высокой эффективностью для терапии раковых заболеваний.
Анализ эффектов действия АМП на ЕК клетки важен для понимания роли АМП в противоопухолевом иммунитете, и указывает на возможность создания новых лекарственных средств для лечения ММ.
Личный вклад автора заключается в постановке цели и задач исследования,
планировании и проведении экспериментальной работы, проведении
статистической обработки полученных данных, анализе результатов, анализе
отечественной и зарубежной литературы, формулировании выводов
диссертационной работы.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, 5 из которых - статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций, 22 тезисов докладов.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на: V
Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме
и патологии» (Санкт-Петербург, 2015), 2-ом и 3-ем ежегодных симпозиумах
университета Тэмпл, посвящённых проблемам трансляционной науки
(Филадельфия, США, 2013 и 2014), на 56-ой ежегодной конференции Американского общества по гематологии (Сан-Франциско, США, 2014), на 18-ой и
7 19-ой ежегодных конференциях молодых ученых Онкологического Центра Фокс Чейз (Филадельфия, США, 2013, 2014).
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований и выводов. Библиографический указатель содержит 271 источник литературы. Работа иллюстрирована 48 рисунками и 7 таблицами.