Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время отмечается выраженная тенденция к росту числа распространенных деструктивных форм туберкулезной инфекции, характеризующихся тяжелым течением, склонностью к формированию множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) микобактерий туберкулеза к основным противотуберкулезным препаратам (ПТП) и высоким процентом летальных исходов [Филинюк О. В., 2011; Jeon D. S. et al., 2011; Wells C. D., 2010].
Развитие и прогрессирующее течение туберкулеза во многом связывают с дефектом антигенспецифического иммунного Th1-ответа [Orme I. M., 2011; Jacobsen M. et al., 2010; Гу]. В последние годы существенную роль в иммунопатогенезе туберкулеза легких (ТБЛ) отводят нарушению функциональной активности популяции антигенпрезентирующих клеток (АПК), основными представителями которой являются макрофаги и дендритные клетки (ДК). По современным представлениям, функция АПК заключается в распознавании и презентации антигена, а также поляризации специфического иммунного ответа и поддержании толерантности к аутоантигенам [Кетлинский С. А., Симбирцев А. С., 2008; Steiman R. M., Banchereau J., 2007; Scott K. et al., 2005]. Изменение функциональных свойств макрофагов и ДК при туберкулёзной инфекции обусловлено прямым влиянием антигенов микобактерий и нарушениями цитокинового баланса в результате гиперпродукции Th2-ассоциированных и иммуносупрессорных цитокинов (IL-10, трансформирующего фактора роста (TGF) ) [Сахно Л. В., Черных Е. Р., 2012; Remoli M. E. et al., 2011; Горлова Е. Е., 2010; Щебляков Д. В. и соавт., 2010; Tourret M. et al., 2010; Кетлинский С. А., Симбирцев А. С., 2008]. Следствием этого становится запуск каскада реакций, направленных на угнетение активности клеточного звена иммунного ответа, что приводит к формированию вторичной иммунологической недостаточности (ВИН) [He X. Y. et al., 2010; Darrasse-Jze G. et al., 2009; Verreck F. A. et al., 2004]. Признаки ВИН при ТБЛ выявляются как на ранних этапах развития заболевания, так и на фоне применения ПТП, что, несомненно, диктует необходимость включения мероприятий по иммунокоррекции в стандартную программу лечения больных ТБЛ [Васильева О. А. и соавт., 2010; Кононова Т. Е. и соавт., 2010; Пальцев М. А., 2004; Казимирский А. Н., 2003]. Однако практикуемое во фтизиатрии индивидуально необоснованное назначение иммуномодулирующих препаратов может оказывать не только позитивный иммуностимулирующий эффект, но и в ряде случаев прямо противоположное негативное действие. В связи с этим все чаще речь идет о назначении иммунотропных препаратов с учетом индивидуальной иммунореактивности пациента и курса ПТП, или, иными словами, – внедрении персонифицированных подходов к лечению [Новицкий В. В. и соавт., 2009; Vogiatzi P. et al., 2006].
Наиболее перспективным вариантом персонифицированного лечения ряда заболеваний (в том числе инфекционных) являются методы адоптивной терапии, которые основываются на стимуляции функциональных свойств иммунокомпетентных клеток путем устранения дефекта антигенпрезентирующей функции АПК и дефицита иммунорегуляторных цитокинов. Принцип этого вида иммуномодулирующей терапии заключается в переносе клеточно-опосредованного иммунного ответа на антиген при помощи живых иммунокомпетентных клеток или их субпопуляций, активированных in vitro [Guan H. et al., 2012; Mesiano G. et al., 2012; Alenzi F. G. et al., 2011; Shin J. H. et al., 2011; Banchereau A. K. et al, 2005; Розенберг С. А., 2002]. Данный подход оказался перспективным для индукции противоопухолевого иммунного ответа [RU №2392946; RU №2309753; RU №2262941; US №2348418; US №2634625].
Показано, что разрешенная к применению в клинической практике на территории Российской Федерации [разрешение ФС №2011/346 от 28.10.2011 г.; патент RU №2372936] медицинская технология «Аутогемотерапия на основе антиген-активированных дендритных клеток в лечении больных туберкулезом легких», основанная на реинфузии собственных (аутологичных) изолированных из крови мононуклеарных лейкоцитов после их «обучения» в присутствии антиген-активированных ДК и активации рекомбинантным IL-2 in vitro, оптимизирует лечение больных ТБЛ. Однако закономерно возникает вопрос о том, каковы же конкретные механизмы иммуномодулирующего действия клеточной аутотерапии при ТБЛ.
Цель исследования: выявить особенности и патогенетические факторы иммуномодулирующего эффекта реинфузии индуцированных in vitro аутологичных мононуклеарных лейкоцитов крови у больных туберкулезом легких.
Задачи исследования:
Оценить CD-субпопуляционный состав, активность пролиферации и апоптоза лимфоцитов периферической крови и секреции цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-, IFN-) in vitro у больных с впервые выявленным инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких до и на фоне лечения.
Выявить общие закономерности и особенности изменений CD-субпопуляционного состава, показателей пролиферации и апоптоза лимфоцитов крови и цитокиновой секреции in vitro у больных туберкулезом легких через 1,5 месяца после базовой химиотерапии и комплексного лечения с использованием клеточной аутотерапии.
Охарактеризовать патогенетические факторы иммуномодулирующего эффекта курсовой реинфузии индуцированных in vitro аутологичных мононуклеарных лейкоцитов у больных туберкулезом легких.
Научная новизна исследования. Впервые у больных с различными клиническими формами (инфильтративный, диссеминированный) туберкулеза легких (ТБЛ) в зависимости от лекарственной чувствительности M. tuberculosis проведена оценка CD-субпопуляционного состава (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+/CD56+, CD19+), пролиферации и апоптоза лимфоцитов периферической крови и секреции цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-, IFN-) через 1,5 месяца лечения противотуберкулезными препаратами (ПТП) в комплексе с клеточной терапией изолированными из крови аутологичными мононуклеарными лейкоцитами после их «обучения» в присутствии антиген-активированных дендритных клеток (ДК) и активации рекомбинантным IL-2 in vitro.
Показано, что изменения CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови при диссеминированном и лекарственно-устойчивом ТБЛ сочетаются с активацией их апоптоза и проявляются дефицитом CD3+, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов и CD16+/CD56+ NK-клеток. Вместе с этим, при лекарственно-чувствительном ТБЛ дефицит CD8+ Т- и NK-клеток в крови формируется при сохранении равновесия апоптоза и пролиферации лимфоцитов. Выявлено, что дисбаланс секреции цитокинов in vitro у больных ТБЛ определяется спонтанной и индуцированной гиперпродукцией IL-6, IL-10, TNF- в условиях дефицита индуцированной секреции Th1-ассоциированных цитокинов – IL-2 и IFN-. На фоне базовой терапии, как без, так и в сочетании с клеточной аутотерапией, динамика показателей апоптоза лимфоцитов крови, секреции IL-6 и TNF- in vitro у больных ТБЛ носит сходный (отрицательный) характер. Между тем, снижение показателей апоптоза лимфоцитов крови у больных ТБЛ на фоне базовой химиотерапии сопряжено с уменьшением, а на фоне комплексной терапии – с увеличением абсолютного количества клеток в состоянии пролиферации. Кроме того, применение в течение 1,5 месяцев только базовой терапии ПТП при всех вариантах течения заболевания усугубляет дефицит индуцированной секреции in vitro IFN- при повышении спонтанной продукции противовоспалительных цитокинов с Th1-супрессорной активностью (IL-4 и IL-10). Применение же клеточной аутотерапии в комплексе с базовыми ПТП сопровождается восстановлением субпопуляционного состава Т-лимфоцитов крови (у больных диссеминированным и лекарственно-чувствительным ТБЛ) и показателей секреции in vitro IL-2, IL-10, IFN-, TNF- и IL-6. При этом у больных инфильтративным и лекарственно-устойчивым ТБЛ отмечается снижение (относительно нормальных значений) числа CD16+/CD56+ NK-клеток и (при инфильтративной и диссеминированной формах заболевания) CD19+ В-лимфоцитов.
В целом полученные данные свидетельствуют о том, что иммуномодулирующий эффект курсовой реинфузии аутологичных мононуклеарных лейкоцитов, индуцированных in vitro антиген-активированными ДК и рекомбинантным IL-2, у больных ТБЛ связан с восстановлением баланса секреции про- и противовоспалительных цитокинов, подавлением апоптоза и активацией пролиферации лимфоцитов крови, а также перераспределением их популяционного состава в направлении увеличения числа основных CD-субпопуляций Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+).
Практическое и теоретическое значение работы. В ходе исследования получены новые данные об особенностях и патогенетических факторах иммуномодулирующего действия реинфузий изолированных из крови больных ТБЛ аутологичных мононуклеарных лейкоцитов после их активации in vitro. Разработана схема комплексного лечения больных ТБЛ базовыми ПТП в сочетании с клеточной аутотерапией мононуклеарными лейкоцитами, индуцированными in vitro антиген-активированными ДК и рекомбинантным IL-2. Получен патент Российской Федерации на изобретение «Способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза» (№2372936 от 20 ноября 2009 г.). Результаты оценки CD-популяционного состава, пролиферации и апоптоза лимфоцитов периферической крови и секреции про- и противовоспалительных цитокинов in vitro обосновывают иммуностимулирующий эффект клеточной аутотерапии на клеточное звено иммунного ответа у больных с различными клиническими формами ТБЛ (инфильтративный и диссеминированный) с лекарственной чувствительностью и устойчивостью возбудителя к ПТП и возможность ее использования в комплексе со специфической химиотерапией для оптимизации лечения больных ТБЛ.
Положения, выносимые на защиту:
У больных туберкулезом легких (ТБЛ) гиперпродукция TNF-, IL-6, IL-10 и индуцированная гипосекреция IL-2 и IFN- мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro сочетаются с дефицитом Т-лимфоцитов (при диссеминированном и лекарственно-чувствительном ТБЛ) и NK-клеток в крови и увеличением числа лимфоцитов в состоянии апоптоза (при диссеминированном и лекарственно-резистентном ТБЛ). После 1,5 месяцев базовой химиотерапии без и в комплексе с клеточной аутотерапией у больных ТБЛ активность апоптоза лимфоцитов и секреции провоспалительного цитокина IL-6 in vitro снижается относительно исходного уровня, при этом в большей степени – при комплексном лечении.
Применение на фоне стандартного лечения клеточной аутотерапии у больных ТБЛ обеспечивает восстановление секреции IL-2, IL-6, IL-10, TNF-, IFN-, субпопуляционного состава Т-клеток крови и повышение активности пролиферации лимфоцитов. Напротив, через 1,5 месяца только базовой химиотерапии у больных ТБЛ вне зависимости от клинической формы и лекарственной чувствительности возбудителя дефицит индуцированной секреции IFN- мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro усугубляется, подавляется спонтанная продукция TNF- при повышении базальной секреции цитокинов с Th1-супрессорной активностью (IL-4, IL-10) и уменьшении абсолютного количества лимфоцитов в состоянии пролиферации.
В основе иммуномодулирующего эффекта реинфузии индуцированных in vitro аутологичных мононуклеарных лейкоцитов у больных ТБЛ лежит восстановление баланса секреции про- и противовоспалительных цитокинов с нормализацией продукции основных Th1-регуляторов – IL-2 и IFN-, подавление апоптоза и активация пролиферации лимфоцитов крови с перераспределением их популяционного состава в направлении увеличения численности Т-лимфоцитов.
Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на конференциях молодых учёных «Актуальные вопросы инфекционной патологии – 2009» (Санкт-Петербург, 2009) и «II Архангельская международная медицинская научная конференция студентов и молодых учёных – 2009» (Архангельск, 2009), Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010), Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине – 2009» (Курск, 2009).
Исследования проведены при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 – 2013 годы» (ГК №16.512.11.2046 «Разработка комплекса молекулярно-генетических маркеров дизрегуляции иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis для оптимизации диагностики и коррекции вторичной иммунологической недостаточности при туберкулезе легких», руководитель – профессор О.И. Уразова) и РФФИ (11-04-98057-р «Разработка комплекса иммунодиагностических биомаркеров для оптимизации лечения больных туберкулезом легких», руководитель – профессор О.И. Уразова).
Внедрение. Результаты работы применяются в учебном процессе кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии, иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России для студентов лечебного, педиатрического и медико-биологического факультетов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 1 патент.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 8 таблицами. Библиографический указатель включает 267 источников, из которых 128 отечественных и 139 зарубежных авторов.
Личное участие автора. Автор принимал непосредственное участие в разработке идеи, дизайна и планировании исследования. Результаты достигнуты, проанализированы и обобщены в выводах и положениях лично автором.
Общая характеристика клинического материала
В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 65 больных с впервые выявленным туберкулезом легких (ТБЛ) (54 мужчин и 11 женщин в возрасте от 18 до 55 лет, средний возраст – 42 года). Пациенты находились на стационарном лечении в Томской областной клинической туберкулёзной больнице (гл. врач – канд. мед. наук Г. В. Янова) во фтизиотерапевтических отделениях №1 (зав. отд. – О. И. Новосельцева), №2 (зав. отд. – Т. З. Малиновская).
Диагноз ТБЛ устанавливали на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты.
Инфильтративный туберкулез легких (ИТБЛ) был диагностирован у 53 (81,54%) пациентов и характеризовался на рентгенограмме наличием одной или нескольких неоднородных теней туберкулезного инфильтрата диаметром не более 4 см. Диссеминированный туберкулез (ДТБЛ) был выявлен у 12 (18,46%) больных, рентгенологическим признаком которого являлось наличие в легких мелких и среднеочаговых изменений неоднородной структуры ограниченной протяженности в пределах двух верхних долей легких.
Возбудитель туберкулеза выявлялся методом прямой световой микроскопии мазка мокроты, окрашенного по Цилю-Нильсену, а также методом люминесцентной микроскопии с использованием флуорохромов (аурамина). Бактериовыделение у больных ТБЛ регистрировалось в 100% случаев. Для определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным химиопрепаратам (методом абсолютных концентраций) производили посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2. Исследования проводились в бактериологических лабораториях Томской областной туберкулезной клинической больницы (гл. врач – канд. мед. наук Г.В. Янова) и Томского областного противотуберкулезного диспансера (гл. врач – С. П. Мишустин).
Лекарственно-устойчивый ТБЛ был диагностирован у 20 (30,77%) пациентов, лекарственно-чувствительный – у 45 (69,23%).
Критериями исключения пациентов из исследования являлись: возраст менее 18 или более 55 лет; выраженный интоксикационный синдром; дефицит массы тела пациента более 30%; выраженная хроническая декомпенсированная сердечно-сосудистая, дыхательная, печеночная, почечная недостаточности; терминальное состояние больного; декомпенсированный сахарный диабет; злокачественные новообразования и заболевания крови; анемический синдром; психические расстройства; беременность; системные аутоиммунные заболевания; индивидуальная непереносимость компонентов клеточной аутогемотерапии, выявленная в процессе её проведения; отсутствие информированного согласия пациента и его отказ от участия в исследовании.
Согласно целям исследования все пациенты с ТБЛ были разделены на две группы (табл. 1).
Группы сравнивали между собой с учетом клинической формы ТБЛ и варианта чувствительности возбудителя к препаратам базовой терапии. Достоверных внутригрупповых различий исследуемых параметров у пациентов мужского и женского пола выявлено не было. Кроме того, сравнение проводили с группой здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту, не имеющих в анамнезе хронических инфекционных заболеваний, аллергических реакций, с частотой заболеваемости острыми респираторными вирусными и бактериальными инфекциями не чаще 2-3 раз в год.
Все пациенты с ТБЛ были обследованы до назначения терапии при поступлении на стационарное лечение, а также через 1,5 месяца с момента начала противотуберкулезной терапии, что соответствовало 2 неделям с момента окончания курса клеточной аутотерапии.
В течение 1,5 месяцев все пациенты получали стандартный курс терапии ПТП, заключающийся в однократном ежедневном приеме изониозида (300 мг/сутки), рифампицина (600 мг/сутки), пиразинамида (2000 мг/сутки), этамбурола (1200 мг/сутки) и стрептомицина (1000 мг/сутки).
Таблица 1
Распределение больных туберкулезом легких по группам исследования
Через 1,5 месяца с момента начала лечения ПТП (группа сравнения) и сочетанного применения ПТП и клеточной аутотерапии (группа исследования) у всех обследованных пациентов с ТБЛ отмечалось уменьшение клинических проявлений болезни, более выраженное в случае комплексной терапии. Кашель сохранялся у 10 из 65 пациентов (15,38%) (у 7 в группе сравнения (24,14%) и у 3 в группе исследования (8,33%)), у 2 больных (3,08%) отмечалось выделение мокроты слизистого характера (у 1 в группе сравнения (3,44%) и у 1 в группе исследования (2,77%)). У всех пациентов наблюдалось купирование симптомов интоксикации, что проявлялось нормализацией температуры тела в 59 случаях (90,77%) (у 23 (79,31%) пациентов в группе сравнения и у 36 (100%) в группе исследования). Негативация мокроты (абациллирование) выявлялась у 25 из 65 человек (38,46%) (9 в группе сравнения (31,03%) и 16 в группе исследования (44,44%)). Умеренное бактериовыделение отмечалось в 32 случаях (49,23%) (15 в группе сравнения (51,72%) и 17 в группе исследования (47,22%)), обильное сохранялось у 8 больных (12,31%) (5 в группе сравнения (17,24%) и 3 в группе исследования (8,33%)). Данные рентгенологического обследования показали полное или почти полное закрытие полостей распада в 13 случаях (20,00%) (5 в группе сравнения (17,24%) и 8 в группе исследования (22,22%)), значительное уменьшение размеров полостных образований у 7 пациентов (10,77%) (1 в группе сравнения (3,45%) и 6 в группе исследования (16,67%)).
К осложнениям комплексной терапии можно отнести выявленное в ходе исследования повышение до фебрильных значений температуры тела в день реинфузии у 2 из 36 больных (5,56%). Прочих нежелательных эффектов на введение клеточной суспензии, которые могли бы повлечь за собой прекращение клинических испытаний, не было выявлено.
Исследования проведены в рамках договора о совместной деятельности №28 от 05.07.2008 г. между ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (на базе кафедр патофизиологии, пульмунологии и фтизиатрии и Центральной научно-исследовательской лаборатории), ЗАО «Томские клеточные технологии» и ОГУЗ «Областная туберкулезная клиническая больница» г. Томска, согласно протоколу клинического исследования (дата утверждения – 15.04.2008 г.) и рекомендациям по проведению курса клеточной аутотерапии, изложенным в медицинской технологии «Аутогемотерапия на основе антиген-активированных дендритных клеток в лечении больных туберкулезом легких», разрешенной к практическому применению (ФС №2011/346 от 28.10.2011 г.). На проведение исследований получено положительное заключение локального комитета по этике №768 от 18.02.2008 г.
Материал исследования
Материалом исследования была периферическая венозная кровь и супернатанты культуральных суспензий мононуклеарных лейкоцитов крови.
Забор крови для получения аутологичных мононуклеарных лейкоцитов крови, «обученных» и стимулированных в присутствии антиген-активированных дендритных клеток и рекомбинантного IL-2, а также для получения супернатантов культуры мононуклеарных лейкоцитов проводили в присутствии врача анестизиолога-реаниматолога до начала курса специфической противотуберкулезной терапии, утром натощак из локтевой вены в количестве 50 мл. Кровь стабилизировали гепарином 25 ЕД/мл. Для оценки субпопуляционного состава, пролиферации и апоптоза лимфоцитов, кровь забирали из локтевой вены в количестве 5 мл утром натощак и стабилизировали К2ЭДТА (1,5 мг/мл).
Методы исследования
Культивирование мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с туберкулином и рекомбинантным IL-2 [RU № 2372936].
Выделение мононуклеарных лейкоцитов из цельной гепаринизированной венозной крови методом градиентного центрифугирования [Натвиг Дж. и соавт., 1980].
Подсчет и оценка жизнеспособности клеток [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992].
Криоконсервация и хранение индуцированных аутологичных мононуклеарных лейкоцитов периферической крови [RU №2372936].
Протокол получения и хранения суспензии мононуклеарных лейкоцитов для проведения курса клеточной аутотерапии у больных ТБЛ является результатом совместной работы ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН (ГУ НИИКИ СО РАМН) г. Новосибирска и ЗАО «Томские клеточные технологии» на основании договора на создание научно-технической продукции №45 от 22.11.2007 г. (протокол утвержден на заседании ученого совета ГУ НИИКИ СО РАМН 25.12.2007 г.).
Подготовка и обратное введение аутологичных мононуклеарных лейкоцитов [RU №2372936].
Исследование количественного и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови:
Определение общего количества лейкоцитов и подсчет лейкоцитарной формулы.
Определение количества CD3+, CD4+, CD8+, CD16+/CD56+, CD19+-лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии с использованием набора меченых моноклональных антител TriTEST («Becton Dickinson (BD)», США).
Исследование цитокинсекреторной активности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro:
Культивирование мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro для получения супернатантов [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992; Хаитов Р. М. и соавт., 1995]. Для стимуляции клеток в пробы вносили туберкулин в дозе 500 ТЕ и фитогемагглютинин (ФГА, PHA) в дозе 30 мкг/мл (ООО ПанЭко, Москва).
Определение концентрации цитокинов в культуральных супернатантах методом проточной цитометрии с использованием системы CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit (BD Biosciense, США).
Определение количества апоптотических и пролиферирующих лимфоцитов крови методом проточной цитометрии с использованием набора APO-BRDU Flow Kit (BD Biosciense, США).
Измерения производили на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), оборудованном аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Анализ полученных данных осуществляли при помощи программого приложения BD, CellQuest , Excel CBA 6- Beats Facs Array (BD Biosciense).
Оценку полученных результатов проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез. При анализе имеющихся выборок данных проверяли гипотезу о нормальности распределения (критерий Шапиро- Уилкса). Поскольку распределение выборочных данных отличалось от нормального, рассчитывали медиану М, первый и третий квартили Q1 и Q3. С целью попарного сравнения показателей в исследуемых группах применяли критерий Манна-Уитни для независимых групп. W-критерий Вилкоксона применяли для сравнения попарно связанных групп данных (например, для оценки разницы показателей одной и той же выборки в динамике). Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05 [Harris M., Taylor G., 2004; Боровиков В. П., 2003; Лакин Г. Ф., 1990].