Исследование крыс OXYS как модели болезни Альцгеймера. Патогенетические механизмы развития Стефанова Наталья Анатольевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 14

1.1. Болезнь альцгеймера (БА) 14

1.1.1. Наследственная и спорадическая формы развития Б А 15

1.1.2. Генетические факторы риска Б А 17

1.1.3. Патогенез Б А 21

1.1.3.1. Нарушение процессинга белка предшественника амилоида бета (АР) и накопление Ар как центральное событие в патогенезе БА 21

1.1.3.2. Токсическое накопление Ар как инициирующий фактор развития БА: аргументы за и против 25

1.1.4. Окислительный стресс и дисфункция митохондрий в патогенезе БА 35

1.2. Потенциал антиоксидантов в профилактике и лечении БА 44

1.2.1. Адресованные в митохондрии антиоксидант - новый класс биологически активных молекул 49

1.3. Биологические модели БА

1.3.1. Геномодифицированные модели БА 52

1.3.2. «Естественные» модели БА 54

1.4. Крысы линии oxys как модель преждевременного старения и связанных с ним заболеваний 57

Заключение к Главе 1 62

Глава 2. Материалы и методы 65

2.1. Материалы, использованные в работе 65

2.2. Животные и препараты 66

2.3. Исследование поведения животных

2.3.1. Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» 67

2.3.2. Тест «открытое поле» 67

2.3.3. Тест «восьмирукавный радиальный лабиринт» 68

2.3.4. Тест «водный лабиринт Морриса»

2.4. Забор и хранение образцов 69

2.5. Выделение белка

2.5.1. Выделение общего белка 70

2.5.2. Выделение саркозил-растворимой и нерастворимой фракций белка 70

2.5.3. Выделение митохондриальной фракции белка 70

2.6. Морфологический и морфометрический анализ методами световой и электронной микроскопии 71

2.6.1. Забор образцов и приготовление препаратов 71

2.6.2. Анализ и обработка изображений 72

2.7. Иммуногистохимический анализ 72

2.7.1. Приготовление препаратов

2.7.2. Анализ и обработка изображений 73

2.8. Вестерн блот и Дот блот анализы 74

2.9. Иммуноферментный анализ ELISA

2.10. Активность фермента цитохром с оксидазы 75

2.11. Массовое параллельное секвенирование (RNA-seq)

2.11.1. Секвенирование на платформе Illumina 75

2.11.2. Картирование и анализ дифференциальной экспрессии 76

2.12. Статистический анализ 77

Глава 3. Развитие ключевых признаков ба у крыс OXYS 78

3.1. Нарушения поведения и памяти у крыс OXYS 78

3.1.1. Сниженная моторно-исследовательская активность и повышенная тревожность 78

3.1.2. Нарушение способности к обучению и памяти 81

3.2. Синаптическая недостаточность и неиродегенеративные изменения в мозге крыс oxys при развитии признаков ба 84

3.2.1. Изменение с возрастом популяции нейронов гиппокампа крыс OXYS и Вистар 84

3.2.2. Деструктивные изменения пирамидных нейронов гиппокампа и префронтальной коры головного мозга крыс OXYS при развитии признаков БА 86

3.2.3. Возрастные структурно-функциональные изменения синапсов в гиппокампе и префронтальной коре головного мозга крыс OXYS и Вистар 92

3.3. Накопление ав пептида с возрастом и его локализация в мозге крыс OXYS 98

3.4. Гиперфосфорилирование тау-белка в гиппокампе и префронтальной коре головного мозга крыс OXYS 104

3.5. Дисфункция митохондрий в мозге крыс oxys при развитии признаков БА

3.5.1. Ультраструктурные изменения митохондрий гиппокампа крыс OXYS и Вистар разного возраста 109

3.5.2. Возрастные изменения активности фермента цитохрома с оксидазы комплекса IV дыхательной цепи митохондрий в мозге крыс OXYS и Вистар 110

Заключение к Главе 3. 112

Глава 4. Анализ возрастных изменений транскриптома префронтальной коры крыс OXYS и вистар 114

4.1. Анализ данных секвенирования транскриптома (RNA-seq) 114

4.2. Функциональная аннотация дифференциально экспрессирующихся генов 120 Заключение к Главе 4. 131

Глава 5. Влияние на манифестацию и прогрессию признаков ба митохондриального антиоксиданта SkQl

5.1. Влияние SKQ1 на развитие признаков ба у крыс OXYS 132

5.1.1. Влияние приема SkQl на моторно-исследовательскую активность, тревожность, способность к обучению и память крыс OXYS и Вистар 132

5.1.2. Влияние приема SkQl на развитие деструктивных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS 139

5.1.3. Влияние приема SkQl на содержание соматотропного гормона и инсулиноподобного фактора роста-І в крови крыс Вистар и OXYS 142

5.1.4. Влияние приема SkQl на содержание АрРР и Ар 1-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар 144

5.1.5. Влияние приема SkQl на содержание тау-белка и его фосфорилированной формы в гиппокампе и префронтальной коре

крыс OXYS и Вистар 146

5.2. Исследование влияния SKQ1 на прогрессию признаков ба у крыс OXYS 148

5.2.1. Влияние приема SkQl на поведение, способность к обучению и память крыс OXYS и Вистар 148

5.2.2. Влияние приема SkQl на деструктивные изменения нейронов и плотность синапсов в гиппокампе крыс OXYS при прогрессии признаков Б А 153 5.2.3 Влияние приема SkQl на содержание АРыо и АРі-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар 164

Заключение к Главе 5 166

Глава 6. Обсуждение результатов 167

6.1. Анализ связи механизмов ускоренного старения мозга крыс OXYS с патогенезом БА 168

6.2. Анализ связи нейропротекторных эффектов митохондриального антиоксиданта SkQ 1 со способностью влиять на развитие и прогрессию

ключевых признаков БА у крыс OXYS 186

Заключение 194

Выводы по диссертационной работе 196

Список литературы

• Нарушение процессинга белка предшественника амилоида бета (АР) и накопление Ар как центральное событие в патогенезе БА
• Тест «приподнятый крестообразный лабиринт»
• Сниженная моторно-исследовательская активность и повышенная тревожность
• Влияние приема SkQl на развитие деструктивных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS

Введение к работе

Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) - самое распространенное нейродегенеративное заболевание, которое становится причиной деменции на фоне атрофических изменений мозга и, в конечном счете, смерти в течение 3-9 лет после установления диагноза (Querfurth, LaFerla, 2010). Эффективных способов профилактики и лечения БА нет, заболеваемость растет по мере увеличения продолжительности жизни и постарения населения развитых и развивающихся стран. По данным ВОЗ, в мире более 35 миллионов человек страдают БА, а к 2050 году, по прогнозам, таких больных будет >115 миллионов (Morley et al., 2012). В этой связи исследования фундаментальных механизмов БА и разработка основанных на их знании способов профилактики и лечения заболевания приобрели особую актуальность.

Согласно доминирующей гипотезе «амилоидного каскада» центральным событием в патогенезе БА становится накопление нейротоксических форм пептида амилоида-Р (АР), приводящее к образованию амилоидных бляшек, гиперфосфорилированию тау-белка и формированию нейрофибриллярных клубков, синаптической недостаточности, гибели нейронов, воспалению, митохондриальной дисфункции и окислительному стрессу (Morley et al., 2012). Однако в последние годы растет количество аргументов в пользу того, что в патогенезе наиболее распространенной спорадической формы БА (-95% всех случаев заболевания) гиперпродукция Ар не выступает в роли инициирующего фактора (Krstic, Knuesel, 2013). Более того, приводятся убедительные доказательства того, что механизмы патогенеза ранней - наследственной формы - и поздней - спорадической формы БА -могут быть различными (Shinohara et al., 2014). Так, если причиной токсического накопления Ар в мозге больных наследственной формой БА становится нарушение процессинга белка предшественника амилоида-Р (АРР), то у больных спорадической формой БА накопление Ар может быть опосредовано синаптическими процессами.

Механизмы старения и патогенез нейродегенеративных заболеваний, в том числе БА, тесно связаны с митохондриальной дисфункцией и окислительным стрессом -нарушением баланса в системах генерации и детоксикации активных форм кислорода (АФК). Более того, дисфункция митохондрий рассматривается как один из ключевых факторов, инициирующих развитие БА. Согласно гипотезе «митохондриального каскада» (Swerdlow, Kahn, 2004), снижение синтеза АТФ и окислительный стресс приводят к чрезмерной продукции Ар, который, в свою очередь, может напрямую оказывать токсическое действие на митохондрии, усугубляя нейродегенеративные процессы. Запуск «порочного круга» нейродегенерации приводит к гиперфосфорилированию тау-белка, дисфункции синапсов, воспалению, апоптозу и становится маркерным, финальным событием в патогенезе БА.

Снижение клеточных функций при старении и развитии БА сопряжено с изменением экспрессии многочисленных генов. Обнаружение мутаций генов АРР, PSEN1 и PSEN2 определило значительный успех в изучении патогенеза наследственной формы БА, на которую приходится около 5% всех случаев заболевания. Несмотря на выявленные ассоциации с полиморфизмами в ряде генов, конкретные молекулярно-генетические механизмы развития спорадической формы БА, перехода физиологических возрастных изменений мозга в патологический процесс, остаются не ясными. Такая ситуация обусловлена невозможностью исследовать эти вопросы на людях, тем более - ранние доклинические стадии развития БА, а также отсутствием адекватных биологических моделей заболевания. Лавинообразно нарастает количество генетических моделей БА, среди которых доминируют моногенные: это или трансгенные, или животные с нокаутом генов, или животные с определенными мутациями. Такой подход приближает к пониманию вклада конкретного гена в развитие наследственной формы БА, но не

воспроизводит все фенотипические проявления спорадической формы БА - комплексного заболевания полигенной природы.

Степень разработанности проблемы. Уникальной генетической моделью преждевременного старения и связанных с ним заболеваний является линия крыс OXYS, созданная в ИЦиГ СО РАН селекцией и инбридингом крыс Вистар, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы. В 5-ти первых поколениях развитие катаракты провоцировали нагрузкой галактозой, в дальнейшем отбор вели по ранней спонтанной катаракте, сцепленно с которой животные унаследовали комплекс признаков преждевременного старения, в том числе - ускоренное старение мозга (Kolosova et al., 2009; Колосова и др., 2014; Stefanova et al., 2010). На фенотипическом уровне оно проявляется формированием уже к возрасту 3 мес. пассивного типа поведения, повышенной тревожности, нарушением способности к обучению на фоне нейродегенеративных изменений, выявленных методами магниторезонансной томографии (Колосова и др., 2011). О снижении когнитивных функций у молодых крыс OXYS свидетельствует и нарушение формирования длительной посттетанической потенциации (Береговой и др., 2011). Механизмы ускоренного старения мозга крыс OXYS остаются неясными, но комплексное проявление признаков преждевременного старения и развитие возрастзависимых заболеваний уже в молодом возрасте предполагает общие молекулярно-генетические основы. Методом QTL-анализа были выявлены локусы, ассоциированные с развитием у крыс OXYS катаракты, ретинопатии и особенностей поведения (Korbolina et al., 2012). Функциональная аннотация локусов выявила «обогащение» района генами, связанными с нейродегенерацией, в том числе - с метаболическим путем БА. Это обстоятельство наряду с характерными для крыс OXYS фенотипическими проявлениями послужило основанием для изучения в настоящей работе механизмов ускоренного старения мозга этих животных и анализа возможной их связи с патогенезом БА. Их знание является необходимым условием доказательства соответствия линии критериям модели спорадической формы БА и перспективности ее использования для исследования патогенеза заболевания и поиска новых терапевтических мишеней для профилактики БА. Как перспективный нейропротектор, потенциально способный влиять на «горячие точки» патогенеза БА, нами был исследован антиоксидант пластохинонил-децил-трифенилфосфоний (SkQl, «ионы Скулачева»), эффективность которого доказана в профилактике и лечении целого ряда ассоциированных со старением заболеваний (Бакеева и др., 2008; Нероев и др., 2008; Vays et al., 2014).

Цель исследования - изучить механизмы ускоренного старения мозга крыс OXYS, их возможную связь с патогенезом болезни Альцгеймера и оценить эффекты антиоксиданта SkQl на некоторые функции мозга у этих животных.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Изучить связь манифестации фенотипических проявлений ускоренного старения мозга крыс OXYS (поведенческих, нарушения способности к обучению и памяти) с изменениями структурно-функциональных параметров пирамидных нейронов и синапсов гиппокампа и префронтальной коры головного мозга.

2. Определить уровень и локализацию маркеров болезни Альцгеймера в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар (контроль) разного возраста: Ар пептида, его предшественника белка АРР, тау-белка и его фосфорилированной формы.

3. Провести сравнительное ультраструктурное исследование гиппокампа крыс OXYS и Вистар разного возраста, определить активность цитохром с оксидазы как маркера активности IV комплекса дыхательной цепи для оценки вклада изменений структурно-функционального состояния митохондрий мозга в развитие нейродегенеративных изменений.

4. Исследовать методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq) изменения транскриптома префронтальной коры мозга крыс OXYS и Вистар с возрастом и определить межлинейные различия в экспрессии генов.

5. Провести функциональную аннотацию дифференциально экспрессирующихся генов и выявить вероятные метаболические пути, с изменениями которых ассоциировано ускоренное старение мозга крыс OXYS.

6. Исследовать влияние приема антиоксиданта SkQl на развитие и прогрессию нейродегенеративных процессов у крыс OXYS.

Научная новизна. Впервые установлено, что ускоренное старение мозга крыс OXYS ассоциировано с развитием ключевых патогенетических и «клинических» признаков спорадической формы БА. Показано, что формирование пассивного типа поведения, повышенной тревожности и снижение способности к обучению у крыс OXYS к возрасту 3-4 мес. по времени совпадает с развитием в гиппокампе и префронтальной коре деструктивных изменений нейронов, синаптической недостаточности, дисфункции митохондрий и гиперфосфорилирования тау-белка. Нарушения поведения и когнитивных способностей у крыс OXYS с возрастом усиливаются на фоне прогрессии деструктивных изменений нейронов и их гибели, снижения плотности синапсов и активных зон их контактов, дисфункции митохондрий, гиперфосфорилирования тау-белка, повышения к возрасту 12 мес. уровня Ар 1-42 в гиппокампе и префронтальной коре и образования амилоидных бляшек в мозге. При этом усиленное накопление Ар в мозге с возрастом становится вторичным событием при развитии у крыс OXYS признаков БА.

Впервые методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq) исследован профиль экспрессии генов в префронтальной коре крыс OXYS. На основании сравнения транскриптома коры мозга крыс Вистар и OXYS разного возраста определены гены, экспрессия которых изменяется с возрастом и при развитии признаков Б А у крыс OXYS. Установлено, что развитие признаков БА у крыс OXYS происходит на фоне изменения уровня мРНК более 900 генов, их прогрессия - более 2000 генов, основная часть которых связана с нейрональной пластичностью, фосфорилированием белка, Са²⁺ гомеостазом, гипоксией, иммунными процессами и апоптозом. С возрастом в префронтальной коре крыс Вистар изменяется экспрессия 499 генов, в то время как у крыс OXYS - более чем 5500 генов, включая 333 гена, общих для крыс OXYS и Вистар. Функциональная аннотация изменения экспрессии генов в префронтальной коре крыс OXYS с возрастом выявила их «обогащение» 85 генами из метаболического пути Б А, связанными с процессингом АРР, агрегацией и деградацией Ар, регуляцией тау-белка, функциями митохондрий, синаптическими процессами.

Впервые установлено, что способность антиоксиданта SkQl не только предупреждать и замедлять формирование фенотипических проявлений ускоренного старения мозга (нарушения поведения и снижение когнитивных функций), но и снижать их выраженность на стадии активной прогрессии у крыс OXYS связана с его влиянием на ключевые признаки Б А. Показано, что SkQl предупреждает и/или замедляет деструктивные изменения нейронов, снижение плотности синапсов, гиперфосфорилирование тау-белка и усиленное накопление Ар в мозге крыс OXYS, существенно улучшая структурно-функциональные параметры митохондрий.

Теоретическая и практическая значимость работы определяется доказательством соответствия линии крыс OXYS критериям модели спорадической формы болезни Альцгеймера, возможности её использования для исследования этиологии и патогенеза связанных с заболеванием нейродегенеративных процессов, в том числе на ранних доклинических стадиях их развития, а также для корректной оценки эффективности терапевтических воздействий, направленных на лечение и профилактику возрастных нарушений функций мозга и развития Б А. Выявленные в работе эффекты SkQl на крысах OXYS и Вистар демонстрируют высокий нейропротекторный потенциал антиоксиданта,

перспективность его использования в профилактике старения мозга и развития характерных для болезни Альцгеймера нейродегенеративных процессов. Положения, выносимые на защиту:

1. Линия крыс OXYS соответствует основным критериям модели спорадической формы болезни Альцгеймера и может быть рекомендована для исследований этиологии и патогенеза этого заболевания, а также для изучения эффективности терапевтических воздействий, направленных на его лечение и профилактику.

2. Развитие патогенетических признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS происходит на фоне изменения уровня мРНК более 900 генов, их прогрессия - более чем 2000 генов, основная часть которых связана с нейрональной пластичностью, фосфорилированием белка, Са²⁺ гомеостазом, гипоксией, иммунными процессами и апоптозом. Как и у людей с болезни Альцгеймера, развитие признаков заболевания у крыс OXYS ассоциировано с изменением в префронтальной коре мозга активности метаболического пути болезни Альцгеймера - экспрессии 85 вовлеченных в него генов.

3. Антиоксидант SkQl способен замедлять развитие и снижать выраженность ключевых признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS, существенно снижая выраженность деструктивных изменений митохондрий мозга.

Апробация результатов. Результаты, полученные при выполнении диссертационного исследования, представлены и обсуждены на: 2-ой Международной конференции «Homo sapiens liberatus» (Москва, 2015), 9th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/System Biology (BGRS\SB-2014: Новосибирск, 2014), Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2014), 11th International Conference AD/PD (Флоренция, Италия, 2013), FENS Featured Regional Meeting (Прага, Чехия, 2013), FEBS Congress (Санкт-Петербург, 2013), «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2012, 2013), 2nd international conference «Genetics of Aging and Longevity» (Москва, 2012), 7-м Сибирском физиологическом съезде (Красноярск, 2012), III съезде геронтологов и гериатров России (Новосибирск, 2012), III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Postgenome-2012: Казань, 2012), 8th FENS Forum of Neuroscience (Барселона, Испания, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для публикации результатов диссертационных исследований.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащей 534 источника (из них 29 отечественных и 505 иностранных). Работа изложена на 262 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 59 рисунков и 2 приложения.

Нарушение процессинга белка предшественника амилоида бета (АР) и накопление Ар как центральное событие в патогенезе БА

В 1907 г. Алоис Альцгеймер - немецкий невропатолог и психиатр - выступил со знаменитой лекцией о «необычном заболевании коры головного мозга» 51-летней женщины, развитие которого сопровождалось потерей памяти, дезориентацией, галлюцинациями и, в конечном счете, привело к смерти в возрасте 55 лет (Віск, 1999). В последующих работах А. Альцгеймер описал характерные морфологические особенности, обнаруженные при постмортальном исследовании мозга этой пациентки -наличие «особенной субстанции» в виде бляшек и нейрофибриллярных клубков. В 1910 г. авторитетный психиатр Э. Крэпелин в своей книге назвал эту пресешшъиую деменцию «Болезнь Альцгеймера» (Schwab et al., 2004). Несмотря на то, что церебральные бляшки были обнаружены пятнадцатью годами ранее, а нейрофибриллярные клубки - в 1907 г., название заболевания, данное в честь А. Альцгеймера, сохранилось (Duff and Suleman, 2004).

В течение 70 лет диагноз БА ставили больным только с пресенилыюй деменцией (возраст до 65 лет, чаще до 40-50 лет), случаи заболеваемости, которой были крайне редки. Больных сенильной деменцией (возраст старше 65 лет) было существенно больше. Из-за сходности клинических и нейропатологических проявлений в 1976 г. Р. Катзманом было предложено объединить яресенильную и сенильную деменции и диагностировать их как БА (Katzman, 1976).

О накоплении «особенной субстанции» в мозге, в частности, на стенках церебральных сосудов больных деменцией было известно с конца 20-х гг. XX века (Divry, 1927), однако вплоть до 80-х гг. неизвестному пептиду отводили роль лишь как вторичного продукта при нарушениях функций иммуноглобулинов (Glenner, 1975). Только в 1984 г. было обнаружено, что основными в составе «особенной субстанции» становятся маленькие пептиды массой 4.2-кДт, длиной, преимущественно, 40 или 42 аминокислоты (Glenner and Wong, 1984). Ученые предположили, что пептид, названный амилоид-Р (АР), является продуктом большого белка предшественника (Glenner and Wong, 1984), который вскоре был идентифицирован (amyloid precursor protein, АРР) (Kang et al. 1987). Было обнаружено, что уровень и молекулярный состав Ар пептидов в мозге больных БА и когнитивно здоровых людей различен. На основании этого было выдвинуто предположение, что изменение содержания Ар в мозге может быть ассоциировано с БА (Glenner and Wong, 1984). Прорывом в понимании этиологии БА явилось использование генетических подходов. В 1991 г. было обнаружено, что раннее, наследственное развитие БА у пациентов из шести семей характеризуется наличием мутации гена на хромосоме 21 (Goate et al., 1991; Chartier-Harlin et al., 1991). Было выявлено, что этот ген кодирует белок АРР, маленькие белки которого (Ар40, А042) составляют основу сенильных бляшек. Не менее значительным событием в начале 90-х годов стало обнаружение также у больных с ранним началом, аутосомно-доминантного характера наследования -наследственной формы Б А (НФБА) - мутаций на хромосоме 14 или на хромосоме 1 (St George-Hyslop et al., 1992; Sherrington et al., 1995). Эти мутации вызывали нарушение структуры фермента комплекса у-секретазы, участвующей в синтезе АРР. Более 180 мутаций обнаружено в генах, получивших название гены-пресенелины, PSENs, которые становятся причиной увеличения продукции Ар42 и развития НФБА (Rogaev et al., 1997; Hardy and Selkoe, 2002; Areza-Fegyveres et al., 2007).

На основании выявленных генетических факторов БА для раскрытия молекулярно-генетических механизмов заболевания в течение 90-х годов начали интенсивно создаваться линии трансгенных мышей - моделей НФБА - с мутациями человеческого АРР и/или PSENs (Hsiao et al., 1996). У этих животных развивались амилоидные бляшки в мозге, нарастающие с возрастом нарушения поведения и снижение нейрональной и синаптической популяции в гиппокампе (West et al., 2009).

В связи с обнаруженными амилоид-зависимыми генетическими мутациями в случаях НФБА, было предположено, что Ар может являться причиной и позднего развития заболевания - спорадической формы БА (СПБА). В поддержку амилоидной концепции свидетельствовали результаты клинических исследований с использованием амилоид-связывающих радиоизотопных лигандов: в мозге больных Б А было обнаружено повышенное содержание Ар пептида (Klunk et al., 2004; Fleisher et al., 2011). В этой связи масштабные экспериментальные и клинические испытания фармакологических препаратов были направлены, в первую очередь, на поиск способных вызывать снижение уровня Ар и содержания амилоидных бляшек в мозге. Однако, несмотря на то, что испытания ряда препаратов в экспериментальных условиях продемонстрировали способность не только снижать уровень Ар в мозге, но и замедлять нарушения когнитивных функций при прогрессии заболевания, количество препаратов, успешно прошедших клинические испытания, крайне ограничено. Можно полагать, обусловлено это в значительной мере тем, что оценка эффективности препаратов была выполнена на биологических моделях Б А, среди которых доминируют моно генные: это или трансгенные, или животные с нокаутом генов, или животные с определенными мутациями. Использование таких моделей приближает к пониманию вклада конкретных генов в развитие НФБА, случаи заболеваемости, которой составляют около 5%. Адекватных «естественных» биологических моделей такого комплексного мультифакторного заболевания полигенной природы как СФБА, на которую приходится около 95% случаев заболевания БА, практически нет. Сочетанное развитие БА с другими возраст-зависимыми заболеваниями, в том числе диабетом, сердечнососудистыми заболеваниями, артритом, остеопорозом, а также ассоциация её развития с травмами головы, курением, депрессией осложняют поиск молекулярных мишеней и генов, вовлеченных в этиологию и патогенез заболевания.

Тест «приподнятый крестообразный лабиринт»

Проявлениями преждевременного старения крыс OXYS становятся патологические состояния, патогенез которых традиционно связывают с окислительным стрессом - нарушением баланса в системах генерации и детоксикации АФК. Однако повышенный уровень окислительных повреждений липидов, белков и ДНК регистрируется в тканях крыс OXYS позже, чем происходит манифестация признаков преждевременного старения (Kolosova et al., 2006). Принципиально важно также, что исследование энергетического метаболизма методами РЗ 1ЯМР-спектроскопии не выявило признаков дефицита высокоэнергетических фосфатов в мозге молодых крыс OXYS (Sergeeva et al., 2006). При этом в ранний постнатальный период в мозге крыс OXYS присутствуют изменения, типичные для адаптации к гипоксии: усилены накопление фосфокреатина и его расход на синтез АТФ (Sergeeva et al., 2006). Проявлением истощения адаптивных резервов становятся характерные для хронической ишемии изменения церебрального кровотока и реактивности сосудов в мозге годовалых крыс OXYS, зарегистрированные методами МРТ (Колосова и др., 2011; Stefanova et al., 2014b). Признаки тканевой гипоксии и ишемии выявлены также в сосудистой оболочке глаз животных, в миокарде, функциональные изменения которого (нарушения ЭКГ) регистрируются уже в 3 месяца и к 12 месяцам нарастают на фоне склеротических изменений коронарных сосудов.

Анализ изменений транскриптома, предшествующих и сопутствующих фенотипическим проявлениям старения и развитию связанных с ним заболеваний, в том числе БА, - на сегодня общепринятый подход к поиску молекулярных мишеней - генов, вовлеченных в их этиологию и патогенез. С его помощью можно выявлять группы дифференциально экспрессирующихся (ДЭ) генов, соответствующие определенным клиническим стадиям заболевания. Выявление ДЭ генов и метаболических путей способствует лучшему пониманию механизмов развития заболевания, а также созданию новых методов его диагностики, профилактики и лечения. Так, выясняя механизмы развития у крыс OXYS ретинопатии, аналогичной возрастной макуклярной дегенерации у людей, О.С.Кожевникова и соавт. исследовали транскриптом сетчатки крыс Вистар и крыс OXYS на разных стадиях заболевания (в возрасте 3 и 18 месяцев) методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq на платформе Illumina). Анализ результатов показал (Kozhevnikova et al., 2013), что с возрастом у крыс обеих линий изменяется экспрессия более 100 генов. Большинство из них связано с организацией внеклеточного матрикса, клеточной адгезией и иммунной системой. Несмотря на то, что эти гены принадлежат к одним и тем же категориям генных онтологии и представляют общие метаболические пути, только 24 из них оказались общими для крыс Вистар и OXYS. Важно, что у крыс Вистар в 18 месяцев уровень мРНК многих генов становился таким, как у крыс OXYS в 3 месяца, что указывает на ускоренное старение последних.

Развитие ретинопатии у крыс OXYS ассоциировано с изменением уровней мРНК более 600 генов. Подавляющее большинство этих генов имели у крыс OXYS сниженный уровень мРНК. Их основная часть связана с иммунным ответом, воспалением, ответом на окислительный стресс, Са2+-гомеостазом, апоптозом, клеточной адгезией и метаболизмом ретиноевой кислоты. Уровень мРНК генов из функциональных категорий «дыхательная цепь митохондрий» и «митохондрия» в сетчатке крыс OXYS и Вистар в возрасте 3 месяцев не различался, а в возрасте 18 месяцев эти категории были представлены небольшим количеством дифференциально экспрессирующихся генов. Только в возрасте 18 месяцев у крыс OXYS выявлен сниженный уровень мРНК генов, регулирующих окислительно-восстановительный гомеостаз и защищающих клетки от окислительного стресса: ферментов, катализирующих реакции с глутатионом (Gpx2 и Gstm4), и оксиредуктаз тиоредоксинового семейства (Glrxl и Txnl). Такие результаты укладываются в современные представления о том, что окислительный стресс в большей степени не причина, а следствие старения. Изменения активности АФК-зависимых сигнальных путей вносят более существенный вклад в снижение функциональных возможностей организма и развитие патологических процессов, чем накопление окислительных повреждений макромолекул. Как и другие признаки преждевременного старения, ретинопатия развивается в период, когда завершается половое созревание и начинается инволюция тимуса, у крыс OXYS - ускоренная. Это обстоятельство в комплексе с результатами анализа транскриптома позволяет рассматривать ускоренное иммуностарение как одну из вероятных причин преждевременного старения крыс OXYS.

Для определения характера наследования признаков преждевременного старения были проведены гибридологические скрещивания. Анализ популяции гибридов от скрещиваний крыс OXYS с крысами инбредной линии WAG показал, что ретинопатия и катаракта развивается лишь у части гибридов F1 (у самок в большей степени, чем у самцов). Картина заболеваемости в поколении гибридов F2 не соответствовала расщеплению по схемам моногенного аутосомно-доминантного и рецессивного наследования (Korbolina et al., 2012), что закономерно для заболеваний полигенной и мультифакторной природы. Последующий QTL-анализ (quantitative trait loci - локусы количественного признака) показал, что локусы, соответствующие интервалам между микросателлитными маркерами DlRatSO и DlRat219 (100,6-188,0 Mb) и DlRat219 и DlRat81 (188,0-250,4 Mb) 1-й хромосомы, ассоциированы с развитием катаракты, ретинопатии и одновременно - признаков ускоренного старения мозга у крыс OXYS. Для доказательства существования в найденных локусах гена (генов), влияющих на развитие фенотипических признаков крыс OXYS, выявленные локусы, маркированные микросателлитами крыс OXYS, были перенесены возвратными скрещиваниями в геном крыс WAG (Korbolina et al., 2012). У крыс каждой из полученных конгенных линий WAG/OXYS-1.1 и WAG/OXYS-1.2 развиваются и катаракта, и ретинопатия, что свидетельствует в пользу влияния генов-кандидатов из установленных QTL на развитие этих признаков у крыс родительской линии OXYS. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) первой хромосомы конгенных животных и крыс родительских линий OXYS и WAG (выполнен методом RNA-Seq) подтвердил, что животные обеих конгенных линий действительно несут локусы, перенесенные от крыс OXYS. Однако катаракта и ретинопатия проявляются у них с более низкой пенетрантностью и менее выраженной прогрессией с возрастом, чем у крыс OXYS, линии-донора QTL (Korbolina et al., 2012), при этом у крыс WAG/OXYS-1.2 заболеваемость выше, чем у WAG/OXYS-1.1. Так, в возрасте 1,5-2 месяцев признаки 1 стадии ретинопатии были выявлены в 11% глаз крыс конгенной линии WAG/OXYS-1.1, к 3 месяцам заболеваемость достигала 55%, что вдвое ниже, чем у крыс OXYS. У крыс WAG/OXYS-1.2 в возрасте 1,5-2 месяцев ретинопатия 1 стадии была выявлена в 41% глаз, к 3-4 месяцам ею были поражены 97% глаз. Для сравнения, у крыс OXYS к возрасту 3 месяцам заболеваемость достигает 100%, в 30-50% глаз регистрируются изменения сетчатки, соответствующие 2 стадии ВМД у людей. При этом клиническая картина изменений глазного дна, согласно офтальмоскопическим осмотрам, у животных конгенных линий отлична от таковой у крыс OXYS. Гистологическое исследование показало, что в отличие от крыс OXYS, у крыс WAG/OXYS-1.2 развитие ретинопатии начинается не с поражения клеток ретинального пигментного эпителия и сосудов хориоидеи, а с повреждения ганглионарного и внутреннего ядерного слоев, т.е. с нейродегенеративных изменений. Также поражаются интраретинальные сосуды: в которых выявлены признаки нарушения микроциркуляции. Дистрофические изменения сетчатки происходят на фоне массовой миграции во внутренний сетчатый и ганглионарный слои мононуклеарных фагоцитов, что свидетельствует о развитии воспалительного процесса. Это отличает крыс WAG/OXYS-1.2 от крыс OXYS, у которых признаки полноценного воспалительного ответа не наблюдаются. Тем не менее, проявление признаков ретинопатии у конгенных животных свидетельствует в пользу участия выявленных QTL в развитии заболевания. В целом, можно заключить, что нами получен уникальный инструмент для исследования механизмов участия представленных в перенесенных локусах генов в развитии дистрофии сетчатки в условиях отличного от материнской линии генетического окружения.

Функциональная аннотация локусов выявила обогащение района генами, связанными с нейродегенерацией, в том числе - с метаболическим путем БА. После анализа литературы были отобраны из этих локусов гены-кандидаты и разработан для них целевой олигонуклеотидный ДНК-микрочип. Исследование с его помощью уровня мРНК генов-кандидатов в сетчатке выявило различия между крысами Вистар и OXYS в уровнях мРНК генов Picalm и Apba2, продукты которых связаны с процессингом АРР (Kozhevnikova et al., 2013).

Сниженная моторно-исследовательская активность и повышенная тревожность

Однако у крыс OXYS и в возрасте 4 месяцев, и в 18 месяцев содержание синапсина I и PSD-95 в гиппокампе значительно ниже, чем у крыс Вистар (р 0.0001 для всех, рис. 3.15Б). В префронтальной коре плотность PSD-95 также снижена у 4 и 18-месячных крыс OXYS (р 0.0001 для обоих возрастов, рис. 3.15В). Плотность синапсина І в коре головного мозга крыс OXYS достоверно ниже только в возрасте 18 месяцев (р 0.0001). Таким образом, анализ структурно-функционального состояния нейронов и синапсов в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар разного возраста свидетельствует о развитии нейродегенеративных изменений и нарушении функциональной активности синапсов с возрастом у крыс обеих линий. Однако интенсивность таких изменений и скорость их прогрессии выше у крыс OXYS. На основании характерных для крыс OXYS поведенческих и когнитивных нарушений, обнаруженных деструктивных изменений нейронов и синаптической недостаточности, а также выявленных в сетчатке различий между крысами Вистар и OXYS в уровнях мРНК генов Picalm и Apba2 (Kozhevnikova et al., 2013), продукты которых связаны с процессингом АРР, мы предположили, что механизмы ускоренного старения мозга крыс OXYS могут быть связаны с нарушением процессинга АРР.

Повышенное содержание белка АРР в мозге крыс OXYS. Патологическое накопление Ар обусловлено нарушением баланса между его секрецией и клиренсом в результате изменения процессинга АРР (Mawuenyega et al., 2010). Поэтому на первом этапе исследования развития возможной амилоидной патологии у крыс OXYS нами была проведена оценка динамики возрастных изменений уровня АРР в гиппокампе и профронтальной коре 3-, 13- и 23-месячных крыс Вистар и OXYS методами вестерн-блота (рис. 3.16). Анализ результатов показал, что уровень АРР в коре и гиппокампе крыс Вистар и OXYS зависел от фактора «возраст» (Fi,46 = 33.1, р 0.001 и Fi,46 = 30.7, р 0.001, соответственно), фактора «генотип» (Fi,46 = 17.6, р 0.001 и Fi,46 = 17.5, р 0.001, соответственно) и взаимодействия этих факторов (Fі,46 = 4.6, р 0.014 и Fі,46 = 3.7, р 0.03, соответственно). Сравнение групповых средних показало, что в возрасте 3 месяцев уровень АРР в гиппокампе и коре головного мозга был на одном уровне у крыс Вистар и OXYS. С возрастом уровень АРР увеличивался у крыс обеих линий, но у крыс OXYS ускоренными темпами (рис. 3.16 А). В результате у 13-й 23-месячных крыс OXYS его уровень в гиппокампе и префронтальной коре был значительно выше, чем у крыс Вистар (р 0.05).

Повышенное содержание АРР в мозге крыс OXYS. (А) Уровень АРР в префронтальной коре и гиппокампе крыс Вистар (в) и крыс OXYS (о) в возрасте 3, 13 и 23 месяца согласно данным вестерн-блот анализа. (Б) Относительный уровень АРР в коре и гиппокампе крыс Вистар и OXYS согласно количественному анализу результатов вестерн-блота Данные представлены как mean±S.E.M. Различия достоверны: # - по сравнению с крысами Вистар одного возраста, - по сравнению с предыдущим возрастом одной линии.

Накопление растворимого АРі_42 в мозге крыс OXYS. В результате расщепления АРР Р- и у-секретазами образуются естественные продукты метаболизма АРР - Ар пептиды длиной 36-43 аминокислоты (Querfurth and LaFerla, 2010). Среди них преобладают пептиды длиной 40 аминокислот (Ар о); доля наиболее токсичного Ар длиной 42 аминокислоты (Ар 1 2) составляет около 5-10% всей продукции Ар пептида. Считается, что повышенное отношение Ар42/Ар40 является объективным показателем при диагностике Б A (Wolfe, 2007). Основываясь на полученных результатах, свидетельствующих о гиперпродукции АРР, мы провели оценку возрастных изменений уровня Ар 1-40 и Ар 1-42 в мозге крыс Вистар и OXYS. Для этого с помощью наборов ELISA специфичных к человеку/крысе антителам АРі г и Ар о методами ИФА было определено содержание растворимой фракции Ар в гиппокампе и префронтальной коре крыс обеих линий в возрасте 3, 12 и 24 месяцев. Полученные данные представлены в Таблице 3.6. Согласно результатам ANOVA-анализа, уровень АРі г в префронтальной коре и гиппокампе зависел от возраста (F2,42 = 58.7, р = 0.001 и F2,42 = 48.6, р = 0.001, соответственно) и генотипа (Fi,42 = 36.5, р = 0.001 и Fi,42 = 45.5, р = 0.001, соответственно). Сравнение групповых средних показало, что, как и в случае с АРР, уровень АРі 2 в мозге 3-месячных крыс Вистар и OXYS не различался, но в возрасте 12 и 24 месяцев его уровень был значительно выше у крыс OXYS (р 0.05; Табл. 3.6).

Данные представлены как mean±SEM; п=6-8. Различия достоверны: - по сравнению с крысами Вистар одного возраста; # - между возрастом 3 и 12 мес. одной линии; л -между возрастом 12 и 24 мес. одной линии; + - между возрастом 3 и 24 мес. одной линии.

Уровень Ар l o в префронтальной коре и гиппокампе также зависел от возраста (F2,42 = 19.0, р = 0.001 и F2,42 = 85.1, р = 0.001, соответственно) и генотипа только в гиппокампе (Fi,42 = 4.5, р = 0.045). Действительно, как показало сравнение групповых средних уровень Ар l o в гиппокампе 3-й 12-месячных крыс OXYS был достоверно ниже, чем у крыс Вистар (р 0.05) и не обнаружено статистически значимых различий в его уровне в коре головного мозга крыс обеих линий (Табл. 3.6).

Кроме того, как видно из Таблицы 3.6 отношение АРі г/АРі о в гиппокампе и префронтальной коре достоверно увеличивалось с возрастом только у крыс OXYS (р 0.05) и было достоверно выше, чем у крыс Вистар, в возрасте 12 и 24 месяцев (р 0.05).

Агрегация Ар и его локализация в мозге крыс OXYS. Для определения локализации Ар пептида и характера его накопления с возрастом в мозге крыс OXYS мы провели иммуногистохимическое и гистохимическое окрашивание препаратов мозга крыс обеих линий несколькими специфичными антителами к Ар пептиду в возрасте 3, 7, 15-18 и месяцев. Результаты исследования показали, что в возрасте 3 месяцев интенсивность сигналов Ар в мозге крыс Вистар и OXYS была на одном уровне. С возрастом внутриклеточное содержание Ар в гиппокампе и коре головного мозга крыс обеих линий росло, но у крыс OXYS ускоренными темпами. Кроме того, в отличие от крыс OXYS, у крыс Вистар ни в одной из возрастных точек не обнаружена внеклеточная агрегация Ар пептида. Примечательно, что при окрашивании препаратов мозга крыс OXYS специфичными антителами к Ар (АРі г и МОАВ-2) и классическими гистологическими красками, детектирующими амилоид (Congo Red и Sirius Red), в редких случаях мы наблюдали внеклеточную агрегацию Ар в коре мозга животных уже в возрасте 3-7 месяцев. Значительная внеклеточная агрегация Ар в мозге крыс OXYS обнаружена в возрасте 15-18 и 24 месяцев. Амилоидные бляшки детектировались в коре, гиппокампе, таламусе, гипоталамусе и стволе головного мозга и не обнаружены в мозжечке. При этом максимальной агрегация внеклеточного Ар пептида была в коре головного мозга. Большинство агрегатов имело форму диффузных бляшек, которые были иммунореактивны с антителами к Ар (рис. 3.17А, Б, Е-3, К и М), Конго красным (рис. 3.17В), Сириусом красным (рис. 3.17Г). Существенно меньше было количество фибриллярных амилоидных бляшек, для окрашивания которых применяли Тиофлавин-С (рис. 3.17 И-Л). Кроме того, в возрасте 15-18 и 24 месяцев мы наблюдали накопление Ар на стенках сосудов головного мозга крыс OXYS (рис. 3.17Н). Таким образом, иммуногистохимическое исследование не только подтвердило результаты, полученные нами методами ИФА, но и определило появление в редких случаях внеклеточной агрегации Ар в мозге молодых крыс OXYS.

Влияние приема SkQl на развитие деструктивных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS

С возрастом изменяется уровень ряда гормонов, в том числе соматотропного гормона и его важнейшего эндокринного посредника инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), обеспечивающего практически все физиологические эффекты соматотропного гормона. Соматотропин оказывает модулирующее действие на некоторые функции ЦНС, являясь не только эндокринным гормоном, но и нейропептидом, принимающим участие в регуляции деятельности ЦНС. Изменения с возрастом функциональной активности медиаторных систем мозга способствуют снижению когнитивных функций и риску развития нейродегенеративных заболеваний. В этой связи, в рамках настоящей работы для оценки системных эффектов SkQl нами было проведено исследование влияния его приема с возраста 1,5 до 4 месяцев на содержание соматотропного гормона и IGF-1 в крови крыс OXYS и Вистар методами ИФА.

Как показал ANOVA-анализ, уровень соматотропного гормона в сыворотке крови крыс OXYS в возрасте 4 месяцев был достоверно ниже, чем у крыс Вистар (F139 = 27.4, р 0.001; Таблица 5.2). Прием SkQl повлиял на содержание соматотропного гормона (F139 = 10.3, р 0.0002), повысив его уровень и у крыс Вистар (р 0.03), и у крыс OXYS (р 0.008). Уровень IGF-1 не зависел от генотипа животных (F139 = 3.2, р = 0.08), однако сравнение групповых средних показало, что у крыс OXYS в возрасте 4 месяцев содержание IGF-1 было достоверно ниже, чем у крыс Вистар (р 0.048; Таблица 5.2). Прием SkQl достоверно не повлиял на уровень IGF-1 в крови крыс Вистар и OXYS, можно лишь отметить, что у принимавших антиоксидант крыс OXYS, его уровень был несколько выше, чем у крыс контрольной группы.

Базовый уровень соматотропного гормона максимален в ранний постнатальный период, амплитуда пиков секреции максимальна в пубертатный период и прогрессивно снижается с возрастом. В этой связи мы провели дополнительное исследование изменения с возрастом содержания соматотропного гормона и IGF-1 в сыворотке крови 1-, 3- 19- и 23-месячных крыс Вистар и OXYS. Кроме того, для оценки эффектов SkQl при лечебном приеме мы провели исследование его влияния на уровень соматотропного гормона и IGF-1 в сыворотке крови крыс Вистар и OXYS, принимавших антиоксидант с возраста 19 до 23 месяцев (250 нмоль/кг массы тела животного). Анализ результатов показал, что у крыс Вистар и OXYS уровень соматотропного гормона (рис. 5.6А) максимален в возрасте 3 месяцев, a IGF-1 - в возрасте 1 месяца (рис. 5.6Б), при этом в возрасте 1 месяца их уровень у крыс Вистар и OXYS не различался.

Содержание (А) соматотропного гормона роста (СТГ) и (Б) IGF-1 в крови интактных крыс OXYS и Вистар в возрасте 1, 3, 19 и 23 месяцев и принимавших SkQl с возраста 19 до 23 месяцев крыс OXYS и Вистар. Данные представлены как mean ± SEM. Различия достоверны: - между крысами Вистар и OXYS одного возраста, # -достоверный эффект препарата.

С возрастом уровень соматотропного гормона и IGF-1 закономерно снижался у крыс обеих линий, однако в возрасте 3, 19 и 23 месяцев их содержание у крыс OXYS было достоверно меньше, чем у крыс Вистар (р 0.05; рис.5.6). Прием SkQl с возраста 19 до 23 месяцев не только предупредил снижение с возрастом концентрации соматотропного гормона и IGF-1 в крови крыс Вистар и OXYS, но и повысил её до уровня более молодых животных (рис.5.6).

Таким образом, с возрастом уровень соматотропного гормона и IGF-1 в крови снижается у крыс обеих линий, но у крыс OXYS ускоренными темпами. Прием SkQ 1 с возраста 1,5 до 4 месяцев предупредил снижение с возрастом уровня соматотропного гормона у крыс OXYS и не влиял на уровень IGF-1. У крыс Вистар антиоксидант увеличил содержание соматотропного гормона. Прием SkQl с возраста 19 до 23 месяцев не только предупредил снижение с возрастом содержания соматотропного гормона и IGF-1 в крови крыс Вистар и OXYS, но и повысил его до уровня более молодых животных.

Влияние приема SkQl на содержание АрРР и АРі-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар Далее нами была проведена оценка способности SkQl при длительном приеме (с возраста 1,5 до 23 месяцев) замедлять усиленное накопление АрРР и Ар 1-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS при прогрессии у них признаков БА.

По данным вестерн-блот анализа уровень АрРР в гиппокампе и префронтальной коре 23-месячных крыс OXYS был значительно выше, чем у крыс Вистар (р 0.05; рис.5.7А, Б). Длительный прием SkQl замедлил увеличение с возрастом содержания АрРР в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS (р 0.05) до уровня контрольных крыс Вистар (рис.5.7А, Б) и статистически значимо не влиял на его уровень в мозге крыс Вистар.

С помощью набора ELISA, специфичными антителами к АРі г, методами ИФА было определено содержание растворимой фракции Ар 1-42 в мозге крыс OXYS и Вистар. Анализ результатов показал, что уровень Ар 1-42 в гиппокампе и префронтальной коре 23-месячных крыс OXYS был значительно выше, чем у крыс Вистар (F132 = 11.3, р 0.002 и Fi,32 = 7.6, р 0.01, соответственно; рис.5.7В, Г). Прием SkQl с возраста 1,5 до 23 месяцев значительно замедлил накопление с возрастом Ар 1-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс обеих линий (Fi,4o = 115, р 0.002 и Fi,4o = 13.7, р 0.001, соответственно). В результате уровень АРі-42 в гиппокампе и префронтальной коре принимавших SkQ 1 крыс OXYS был том же уровне, что и у контрольных крыс Вистар (рис.5.7В, Г).