Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Нейротрофическое обеспечение головного мозга в онтогенезе 11
1.1.1. Общая характеристика семейства нейротрофинов и их рецепторов 11
1.1.2. Роль нейротрофических факторов и их рецепторов в становлении нервной системы 22
1.1.3. Изменения экспрессии нейротрофинов с возрастом и их вклад в патогенез нейродегенеративных заболеваний 26
1.2. Старение мозга и окислительный стресс 28
1.3. Антиоксиданты в профилактике и лечении нейродегенеративных расстройств
1.3.1. Мелатонин как эндогенный антиоксидант 33
1.3.2. Адресованные в митохондрии антиоксиданты – новый класс биологически активных молекул 40
1.4. Крысы OXYS как модель болезни Альцгеймера 46
Глава 2. Материалы и методы 50
2.1. Животные и препараты 50
2.2. Исследование поведения животных 51
2.3. Молекулярные исследования (Вестерн-блот анализ и иммуноферментный анализ) 54
2.4. Иммуногистохимический анализ 55
2.5. Массовое параллельное секвенирование (RNA-seq) 56
2.6. Статистический анализ 58
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Оценка вклада изменений уровня мелатонина с возрастом в развитие признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS 59
3.2. Оценка вклада изменений продукции нейротрофинов с возрастом в развитие признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS 61
3.2.1. Изменения с возрастом экспрессии генов сигнального пути нейротрофинов в префронтальной коре мозга крыс OXYS и Вистар 61
3.2.2. Изменение с возрастом содержания BDNF и его рецепторов TrkB и p75NTR
в гиппокампе и префронтальной коре мозга крыс OXYS и Вистар 69
3.3. Влияние профилактического приёма SkQ1 и мелатонина на развитие
нарушений нейротрофического обеспечения гиппокампа крыс OXYS 77
3.3.1. Влияние приёма SkQ1 и мелатонина на поведение, способность к обучению и память крыс OXYS и Вистар 77
3.3.2. Влияние приёма SkQ1 и мелатонина на содержание BDNF в гиппокампе крыс OXYS и Вистар 84
3.4. Влияние лечебного приёма SkQ1 и мелатонина на прогрессию нарушений
нейротрофического обеспечения в мозге крыс OXYS 86
3.4.1. Влияние приёма SkQ1 и мелатонина на поведение, способность к обучению и память крыс OXYS и Вистар 86
3.4.2. Влияние приёма SkQ1 и мелатонина на уровень BDNF и его рецепторов TrkB, p75NTR в гиппокампе и префронтальной коре мозга крыс OXYS и Вистар 93
Глава 4. Обсуждение результатов
4.1. Анализ вклада изменений уровня мелатонина с возрастом в развитие признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS 100
4.2. Анализ вклада изменений продукции нейротрофинов с возрастом в развитие признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS 101
4.3. Анализ способности SkQ1 и мелатонина замедлять развитие и прогрессию нарушений нейротрофического обеспечения мозга при профилактическом
и лечебном приёме 106
Выводы 111
Список литературы
- Изменения экспрессии нейротрофинов с возрастом и их вклад в патогенез нейродегенеративных заболеваний
- Молекулярные исследования (Вестерн-блот анализ и иммуноферментный анализ)
- Оценка вклада изменений продукции нейротрофинов с возрастом в развитие признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS
- Анализ вклада изменений продукции нейротрофинов с возрастом в развитие признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS
Введение к работе
Актуальность проблемы. Достижения медицины второй половины XX века определили увеличение продолжительности жизни людей, что привело к постарению населения развитых стран. В результате растёт число людей, страдающих болезнью Альцгеймера (БА) – наиболее распространённой формой сенильной деменции, характеризующейся накоплением нейротоксических форм пептида амилоида- (А), образованием амилоидных бляшек, гиперфосфорилированием тау-белка, гибелью нейронов, воспалением, митохондриальной дисфункцией и окислительным стрессом (Morley et al., 2012). Эффективных способов профилактики и лечения БА нет, что обусловлено неполнотой знаний патогенеза заболевания, механизмов перехода физиологических возрастных изменений мозга в патологический процесс.
Старение связано со снижением секреции и нарушением ритмов выработки основного гормона эпифиза – мелатонина, с которым связывают патогенез БА (Morley et al., 2012). Однако остаётся не ясным, является это снижение причиной или следствием БА и старения в целом, и каковы его механизмы (Bubenik, Konturek, 2011). Мелатонин участвует в метаболизме белка-предшественника А (АPP), предотвращая таким образом гиперпродукцию А, снижает гиперфосфорилирование тау-белка, обладает уникальной антиоксидантной активностью, модулирует воспаление, предотвращает повреждение митохондрий, снижает Ca2+-зависимую токсичность и, наконец, способен поддерживать целостность и функциональность клеточных мембран путем прямого взаимодействия с липидами, а при нарушении липидного баланса подавляет нейровоспалительные и проапоптотические сигналы (Rosales-Corral et al., 2012). В ряде работ показана способность мелатонина ослаблять проявления БА, но убедительных данных о его влиянии на нейродегенеративные изменения мозга нет (Bubenik, Konturek, 2011).
При старении и развитии БА нейродегенеративные процессы тесно связаны с
изменением содержания нейротрофических факторов, в том числе мозгового
нейротрофического фактора (BDNF). В онтогенезе зрелая форма белка (mBDNF),
взаимодействуя с TrkB-рецептором, регулирует деление клеток, их миграцию,
дифференцировку и установление межклеточных контактов. В то же время незрелая
форма BDNF (proBDNF), взаимодействуя с p75NTR-рецептором, регулирует запуск
апоптоза (Bothwell, 2014). Гибель нейронов на ранних этапах индивидуального
развития играет важную роль в процессах структурно-функционального созревания
мозга. Вместе с тем, большинство постмитотических нейронов по окончании периода
созревания существуют на протяжении всей жизни организма. При
нейродегенеративных процессах нейротрофины могут не только проявлять нейропротекторные свойства, но и способствовать утрате контроля над процессами дифференцировки и пролиферации в нейронах, что приводит к их гибели (Capsoni et al., 2010; Hempstead, 2014). Изменения нейротрофического обеспечения нервных клеток с возрастом и при БА могут быть обусловлены как нарушением метаболизма нейротрофинов, так и модификацией их доступности вследствие изменения состояния микроокружения нейронов, однако их механизмы изучены недостаточно. Исследовать эти процессы у людей проблематично, особенно на ранних доклинических стадиях БА, адекватных биологических моделей заболевания нет. Среди существующих моделей БА доминируют моногенные: это или трансгенные, или животные с нокаутом генов, или животные с определенными мутациями. Такой
подход приближает к пониманию вклада конкретного гена в развитие наследственной формы БА, но не воспроизводит все фенотипические проявления её спорадической формы – комплексного заболевания полигенной природы, на которое приходится около 95% всех случаев заболеваемости.
Степень разработанности темы исследования. Недавно доказано, что уникальной моделью спорадической формы БА является линия преждевременно стареющих крыс OXYS (Stefanova et al., 2014a), у которых развиваются все ключевые признаки заболевания: деструктивные изменения нейронов и их гибель, синаптическая недостаточность, дисфункция митохондрий, гиперфосфорилирование тау-белка, усиленное накопление A1-42 и образование амилоидных бляшек в мозге, нарушения поведения и снижение способности к обучению и памяти. Механизмы развития у крыс OXYS признаков БА остаются неясными, но развитие у них нейродегенеративных процессов (Stefanova et al., 2014b) и нарушение метаболизма серотонина (Щеглова и др., 2003) в критических для обучения и памяти структурах мозга уже в молодом возрасте предполагает изменения продукции нейротрофинов и секреции мелатонина. Один из подходов к исследованию патогенеза заболеваний – анализ механизмов действия факторов, способных влиять на их развитие. Как перспективные нейропротекторы, потенциально способные влиять на «горячие точки» патогенеза БА, мы исследовали митохондриальный антиоксидант пластохинонил-децил-трифенилфосфоний (SkQ1) и мелатонин, эффективность которых в профилактике и лечении целого ряда ассоциированных со старением заболеваний доказана (Бакеева и др., 2008; Нероев и др., 2008; Gutierrez-Cuesta et al., 2011; Rastmanesh, 2011; Vays et al., 2014).
Цель работы: исследование изменения содержания мелатонина и
нейротрофинов в развитии признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS.
Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:
1. Изучить возрастную динамику содержания мелатонина в крови крыс OXYS и
Вистар.
2. На основании анализа транскриптома (данных RNA-seq) префронтальной
коры мозга крыс OXYS и Вистар оценить различия в изменении с возрастом уровня
мРНК генов сигнального пути нейротрофинов, провести функциональную аннотацию
дифференциально экспрессирующихся генов.
3. Исследовать изменения с возрастом содержания BDNF и его рецепторов TrkB
и p75NTR
а) в гиппокампе крыс OXYS и Вистар;
б) в префронтальной коре мозга крыс OXYS и Вистар.
4. Исследовать влияние введения крысам OXYS и Вистар митохондриального
антиоксиданта SkQ1 и мелатонина с возраста 1,5 до 4 месяцев
а) на нейротрофическое обеспечение гиппокампа;
б) на моторно-исследовательскую активность и тревожность;
в) на способность к обучению и память.
5. Исследовать влияние введения крысам OXYS и Вистар митохондриального
антиоксиданта SkQ1 и мелатонина с возраста 12 до 18 месяцев
а) на нейротрофическое обеспечение гиппокампа;
б) на нейротрофическое обеспечение префронтальной коры мозга;
в) на моторно-исследовательскую активность и тревожность;
г) на способность к обучению и память.
Научная новизна. Впервые установлено, что у крыс OXYS, в отличие от крыс Вистар, нарушение суточного ритма продукции мелатонина – снижение его уровня в крови в ночные часы и повышение в дневные часы – развивается к возрасту 3 месяцев, в период формирования у них пассивного типа поведения, повышения уровня тревожности, снижения способности к обучению. С возрастом уровень мелатонина в крови в ночные часы снижается у крыс обеих линий, но у крыс OXYS – ускоренными темпами. Установлено, что в период прогрессии поведенческих нарушений, снижения способности к обучению и памяти (возраст 18 месяцев) уровень мелатонина в крови крыс OXYS существенно снижен.
Впервые установлено, что у крыс OXYS развитию поведенческих и когнитивных
нарушений предшествуют и сопутствуют изменения нейротрофического обеспечения
мозга: усиление процессов апоптоза в период окончания формирования мозга
(возраст 20 дней), на которое указывают повышение уровня мРНК
проапоптотических генов и увеличение содержания proBDNF; активация компенсаторно-восстановительных процессов (возраст 3-5 месяцев), о чём свидетельствует повышение уровня BDNF за счёт mBDNF и proBDNF и увеличение частоты их колокализации с TrkB- и p75NTR-рецепторами; значительное снижение активности системы нейротрофинов (возраст 18 месяцев), что выражается в снижении активации TrkB-рецептора, изменении баланса proBDNF/mBDNF в направлении незрелой формы белка и повышение частоты её колокализации с p75NTR-рецептором.
Впервые установлена способность SkQ1 и мелатонина не только замедлять нарушения нейротрофического обеспечения мозга, поведения, способности к обучению и памяти, но и снижать их выраженность на стадии активной прогрессии у крыс OXYS признаков болезни Альцгеймера.
Теоретическая и практическая значимость. Подтверждены соответствие
линии крыс OXYS критериям модели спорадической формы БА и перспективность её
использования для оценки эффективности терапевтических воздействий,
направленных на лечение и профилактику возрастных нарушений функций мозга и развития БА, для исследования этиологии и патогенеза связанных с заболеванием нейродегенеративных процессов, в том числе – на ранних доклинических стадиях их развития. Выявленные на крысах OXYS и Вистар эффекты SkQ1 и мелатонина демонстрируют высокий нейропротекторный потенциал препаратов, перспективность их использования в профилактике старения мозга и развития характерных для БА нейродегенеративных процессов.
Положения, выносимые на защиту:
-
Нарушения суточных ритмов концентрации мелатонина (снижение уровня гормона в ночное время и повышение – в дневное время) в крови крыс OXYS развиваются в период манифестации ряда признаков болезни Альцгеймера и усиливаются на фоне их прогрессии.
-
Проявлениям признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS предшествует изменение активности системы нейротрофинов, указывающее на усиление апоптоза нейрональных клеток. Манифестация признаков заболевания у крыс OXYS происходит на фоне активации компенсаторно-восстановительных процессов в системе нейротрофинов (повышение содержания зрелой и незрелой форм BDNF), которая сменяется подавлением активности системы нейротрофинов в период прогрессии признаков заболевания.
3. SkQ1 и мелатонин способны замедлять развитие и прогрессию поведенческих
и когнитивных нарушений, восстанавливая нейротрофическое обеспечение мозга, что
может свидетельствовать об участии обоих препаратов в регуляции механизмов развития болезни Альцгеймера.
Апробация работы. Полученные результаты были представлены и обсуждены
на 50-ой и 51-ой Международной студенческой конференции «Студент и научно-
технический прогресс» (Новосибирск, 2012, 2013); 7-ом Сибирском физиологическом
съезде (Красноярск, 2012); International Symposium “Human Genetics” ISHG-2014
(Новосибирск, 2014); 7-ой Всероссийской научно-практической конференции с
международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-
приспособительных процессов» (Новосибирск, 2015); conference «Molecular basis of aging & disease» (Сучжоу, Китай, 2015); 12-ом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2016), 10th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Новосибирск, 2016).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертации на соискание учёной степени кандидата наук.
Структура и объём диссертации. Диссертация включает введение, обзор
литературы, описание материалов и методов исследования, результатов
исследования, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы из 285 источников (17 отечественных и 268 – иностранных). Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 2 приложения.
Изменения экспрессии нейротрофинов с возрастом и их вклад в патогенез нейродегенеративных заболеваний
Нейротрофины составляют небольшое семейство секреторных димерных белков, которые оказывают существенное влияние на все биологические аспекты нейронов позвоночных животных. В онтогенезе нервной системы нейротрофины регулируют деление клеток, их миграцию, дифференцировку, установление и поддержание активности межклеточных контактов, а также регулируют запуск апоптоза. Известно четыре нейротрофина, присутствующих у млекопитающих: BDNF, фактор роста нервов (NGF), нейротрофин-3 (NT-3) и нейротрофин-4 (NT-4) (Bothwell, 2014).Структура нейротрофинов очень консервативна в ряду позвоночных животных, что свидетельствует о важности их роли в функционировании нервной системы (Timmusk et al., 1993). Впервые белок семейства нейротрофинов, NGF, был обнаружен нейробиологом Леви-Монтальчини и эмбриологом Гамбургером в 1953 году (Levi-Montalcini, Hamburger, 1953) и выделен биохимиком Коэном в 1956 году (Cohen, Levi-Montalcini, 1956).
Гены нейротрофинов имеют сложную структуру. У человека ген NGF расположен на 1-й хромосоме и содержит четыре 5 экзона, ассоциированных со специфичными промоторами, и один 3 экзон, кодирующий зрелую форму NGF (West et al., 2014). Ген BDNF расположен на 11-й хромосоме, его структура сходна со структурой гена NGF (Binder, Scharfman, 2004).
В регуляцию транскрипции нейротрофинов вовлечены не только различные транскрипционные факторы, но и эпигенетические механизмы – метилирование ДНК и гистонов, а также специфичные микроРНК (Carbone, Handa, 2013; Karpova, 2014). Белок хантингтин, вовлечённый в патогенез болезни Хантингтона, регулирует BDNF на уровне транскрипции (ген BDNF в промоторе II содержит сайт связывания с хантингтином), контролирует транспорт этого нейротрофина (Zucatto, Cattaneo, 2014).
Как и большинство трофических факторов, нейротрофины синтезируются в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме в виде белков-предшественников, препронейротрофинов, образующих прочно связанные дисульфидными мостиками
гомодимеры (Rafieva, Gasanov, 2016). Про-домены нейротрофинов необходимы для приобретения ими правильной конформации и эффективного внутриклеточного транспорта белков (Hempstead, 2014). Сортилин – трансмембранный рецептор, расположенный на мембране аппарата Гольджи и осуществляющий сортировку белков – связывается с про-доменами нейротрофинов и осуществляет их корректную сортировку в транспортные везикулы (Bronfman et al., 2014). Транспорт мРНК нейротрофинов, в частности, BDNF, зависит от сплайсингового варианта: мРНК с короткой 3 нетранслируемой областью транслируются в теле нейрона, поддерживая базальный уровень BDNF, а мРНК с длинной 3 -нетранслируемой областью транспортируются в дендриты, где происходит трансляция (Karpova, 2014). В регуляцию стабильности мРНК нейротрофинов вносят вклад внешние факторы. Так, стабильность мРНК NGF значительно увеличивает интерлейкин-1(West et al., 2014). Димерные пронейротрофины либо секретируются в виде белков-предшественников, либо подвергаются посттрансляционной обработке с отщеплением N-концевого про-домена и высвобождением зрелого димерного белка. Про-домены нейротрофинов подвергаются протеолитическому расщеплению, однако отщеплённый про-домен BDNF протеолизу не подвергается и секретируется вместе со зрелым нейротрофином (Bothwell, 2014; Hempstead, 2014). Протеолитическое расщепление пронейротрофинов играет решающую роль во взаимодействии нейротрофических факторов с рецепторами и их последующей биологической активности (Dechant, Barde, 2002).
В “не-нейрональных” тканях все нейротрофины секретируются конститутивно, для нейронов наряду с конститутивной секрецией характерна зависящая от нейрональной активности регулируемая секреция BDNF и NGF. При этом зрелая форма нейротрофинов секретируется конститутивно, а пронейротрофины – регулируемо (Cuello et al., 2007; Lu et al., 2014a). Незрелая форма BDNF секретируется в ответ на физиологические стимулы, такие, как вызванная долговременной депрессией низкочастотная стимуляция. Внеклеточный proBDNF подвергается гидролизу тканевым активатором плазминогена, в результате происходит отщепление про-домена и высвобождение зрелого нейротрофина, при этом тканевый активатор плазминогена секретируется в ответ на долговременную потенциацию. Внеклеточный гидролиз proBDNF с образованием mBDNF необходим для индукции долговременной потенциации, а внутриклеточный гидролиз proBDNF участвует в её поддержании. Регулируемая секреция BDNF также вовлекается в NMDA-зависимые формы синаптической пластичности (Bronfman et al., 2014; Lu et al., 2014a).
Специфическими рецепторами зрелых нейротрофинов являются белки семейства Trk – тирозинкиназы с одним трансмембранным доменом. NGF преимущественно связывается с TrkA, BDNF и NT4 – с TrkB, а NT3 связывается с TrkC и, с меньшей аффинностью, с TrkA (Dechant, Barde, 2002; Bothwell, 2014). В результате взаимодействия с нейротрофином Trk-рецептор димеризуется, аутофосфорилируется, запускает сигнальные каскады (рис. 1) и подвергается эндоцитозу. Эндоцитозные пузырьки либо встраиваются обратно в клеточную мембрану, обеспечивая рециркуляцию Trk-рецепторов, либо, как сигнальные эндосомы, ретроградно транспортируются к телу нейрона. Свойства сигнальной эндосомы меняются после интернализации и во время её транспорта по аксону (Ceni et al., 2014). Это становится причиной различия сигнальных каскадов, запускаемых активированными Trk рецепторами с поверхности клетки и из сигнальной эндосомы (Lu et al., 2014a). Динамическое равновесие встраивания в мембрану и ретроградного транспорта Trk рецепторов определяет силу и продолжительность клеточного ответа на нейротрофические факторы (Deinhardt, Chao, 2014). Помимо полноразмерной формы Trk-рецепторов (Full Length Trk, FLrk), в нейронах присутствуют образованные в результате альтернативного сплайсинга укороченные формы Trk-рецепторов, у которых отсутствует внутриклеточный тирозинкиназный домен (Menn et al., 2000). Укороченные формы Trk-рецепторов являются конкурентными ингибиторами FLrk-рецепторов, поскольку связываются с соответствующими нейротрофинами и снижают их доступность для FLrk-рецепторов, а также образуют нефункциональные гетеродимеры с полноразмерными рецепторами (Eide et al., 1996; Deinhardt, Chao, 2014).
Молекулярные исследования (Вестерн-блот анализ и иммуноферментный анализ)
Для оценки пространственной рабочей и референтной памяти крыс использовали установку «восьмирукавный радиальный лабиринт» (НПК Открытая Наука, Москва, Россия). В течение десяти последовательных дней обучали животных поиску пищи в лабиринте (Manahan-Vaughan, Schwegler, 2011). В качестве пищевого подкрепления использовались сухие зерновые шарики массой 0,5 г (ОАО Любятово, Россия). За три дня до обучения снижали количество корма в домашних клетках на 15% от суточной нормы потребности в корме и давали по одному зерновому шарику каждой крысе. За день до обучения проводили две сессии привыкания крыс к лабиринту: животным позволялось исследовать лабиринт в течение 10 минут, интервал между сессиями составлял 2 часа. Зерновые шарики во время привыкания были рассыпаны во всех рукавах лабиринта. Во время обучения пищевое подкрепление предъявляли в 4 из 8 рукавов лабиринта (рис. 4). Для этого в конце каждого из 4-х рукавов устанавливали кормушку с зерновым шариком. В конце каждого из 4-х рукаов без подкрепления устанавливали пустую кормушку. Каждая сессия обучения состояла из двух фаз: (1) крысу помещали в центр установки, при этом входы в рукава были закрыты перегородками (20 секунд); (2) убирали перегородки и наблюдали поведение животного (10 минут или пока крыса не войдёт во все подкрепляемые пищей рукава). В каждом сеансе обучения подсчитывали число ошибок референтной памяти (входы в неподкрепляемые рукава), число ошибок рабочей памяти (повторные входы в подкрепляемые рукава в течение одного сеанса), общее число входов в рукава (моторно-исследовательская активность). Для оценки референтной памяти данные считали по следующей формуле: RME (%) = RME / TN 100%, где RME (%) – процент ошибки референтной памяти, RME – число входов в неподкрепляемые рукава, TN – общее число входов в рукава. За исключением первого дня обучения, показатели рабочей и референтной памяти были объединены по три сессии (дня) для каждой крысы (Manahan-Vaughan, Schwegler, 2011).
Водный тест Морриса (Morris, 1984) используется для исследования способности к обучению и долговременной пространственной памяти. Лабиринт представляет собой круглый бассейн из нержавеющей стали (диаметр 2 м, высота стенок 0,8 м), расположенный на опорах на высоте 0,5 м над уровнем пола. Установка помещалась в комнате (размер 33 м), содержащей инвариантные пространственные стимулы (дверь, шкаф). Бассейн был условно поделен на четыре равных сектора при помощи четырех различных крупных меток, нанесенных на его стенки изнутри; сектора получили условную нумерацию (№ 1, 2, 3, 4 почасовой стрелке). В середине четвёртого сектора помещалась квадратная платформа из оргстекла с размером площадки 1313 см и высотой 40 см. Бассейн заполнялся водой с температурой 26±2С так, чтобы платформа была погружена на 3 см под воду. В воде растворялась навеска сухого молока для того, чтобы среда стала непрозрачной, и платформа оставалась невидимой для животного. При постоянном положении платформы животные научались её находить, используя ориентиры внелабиринтного расположения и/или ориентиры, нанесённые на края бассейна-лабиринта. Запись и оцифровка видеоизображения проводилась при помощи компьютера, снабжённого внутренней платой видеозахвата.
Ежедневно в течение пяти дней каждая крыса выполняла по четыре попытки нахождения платформы. Животное помещали в лабиринт у его стенки в центре сектора, соответствующего номеру попытки. Далее животному предоставлялось 70 секунд для того, чтобы отыскать погружённую под воду невидимую платформу, потраченное на это время фиксировалось при помощи секундомера (“латентный период нахождения платформы”). Отыскав платформу, крыса находилась на ней в течение 20 секунд, затем животное помещали на 12 минут в сухую обогреваемую клетку до следующей попытки. В ситуации, когда животное не находило платформу самостоятельно, по истечении отведённого на попытку времени крысу помещали на платформу, где она находилась в течение 20 секунд, в протоколе фиксировался латентный период 70 секунд. После выполнения четырёх попыток крысы помещались обратно в их домашние клетки до следующего дня обучения. Показателем способности к обучению и пространственной памяти животных в водном тесте Морриса являлся латентный период нахождения невидимой платформы. На шестой день (оценка референтной памяти) платформа убиралась, животных сажали в бассейн в центре первого сектора, предоставляя им по одной попытке длительностью 70 секунд. При этом регистрировали время, проведённое в секторе, где ранее находилась платформа (“целевой сектор”).
Оценка вклада изменений продукции нейротрофинов с возрастом в развитие признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS
Анализ результатов иммуногистохимического окрашивания препаратов мозга показал, что в возрасте 20 дней в гиппокампе крыс Вистар преобладающей является зрелая форма белка (mBDNF), тогда как у крыс OXYS – proBDNF (рис. 11Б, В). Аналогичная ситуация наблюдалась в префронтальной коре: у крыс OXYS интенсивность сигнала mBDNF была ниже, а proBDNF – выше, чем у крыс Вистар (рис.11Г). Полученные результаты могут свидетельствовать о задержке созревания головного мозга у крыс OXYS. На основании анализа результатов методами иммунногистохимии нами установлено, что увеличение к возрасту 3 месяцев совокупного уровня BDNF в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS происходит за счёт увеличения как зрелой, так и незрелой формы белка (рис. 11Б-Г). Можно полагать, повышенный уровень BDNF в гиппокампе крыс OXYS в этот возрастной период носит компенсаторный характер, направленный на замедление развития нейродегенеративных изменений на фоне увеличения популяции нейронов в гиппокампе (Stefanova et al., 2014a). Как было показано выше, с возрастом совокупный уровень BDNF в гиппокампе снижается у крыс OXYS ускоренными темпами. При этом, по данным анализа результатов иммуногистохимического окрашивания препаратов мозга, в гиппокампе 18-месячных крыс OXYS интенсивность сигнала активирующей апоптоз незрелой формы белка существенно выше, чем у запускающей нейропротекторные механизмы зрелой формы mBDNF.
Исследование уровня TrkB-рецептора и его фосфорилированной формы в мозге крыс OXYS и Вистар разного возраста. Исследование содержания TrkB и его фосфорилированной формы (фосфоTrkB(Y817)) в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар проведено в возрасте 20 дней, 3 и 18 месяцев (n = 6 в каждой группе). ANOVA-анализ показал, что уровень TrkB в гиппокампе зависел только от возраста (F2,30 = 6,8, p 0,004) и был минимальным у 20-дневных крыс обеих линий (рис. 12А). Сравнение групповых средних показало, что только у крыс OXYS уровень TrkB в гиппокампе в возрасте 18 месяцев был выше, чем в возрасте 20 дней (p 0,01). Уровень TrkB в префронтальной коре не зависел от генотипа и возраста (F1,30 = 0,7, p = 0,41 и F2,30 = 2,3, p = 0,11, соответственно; рис. 13А).
Как показал ANOVA-анализ, уровень фосфоTrkB(Y817) в гиппокампе не зависел от генотипа и возраста (F1,30 = 0,1, p = 0,72 и F2,30 = 0,6, p = 0, 59, соответственно; рис. 12Б). В префронтальной коре его уровень также не зависел от генотипа (F1,29 = 0,5, p = 0,49), однако снижался с возрастом (F2,29 = 6,3, p 0,005) (рис. 13Б). Сравнение групповых средних показало, что достоверным это снижение было только у крыс OXYS: в возрасте 18 месяцев уровень фосфоTrkB(Y817) в префронтальной коре был ниже, чем у 20-дневных животных (p 0,005).
Уровень TrkB-рецептора умеренно повышался с возраста 20 дней до 18 месяцев в гиппокампе крыс обеих линий. (Б) Уровень фосфоTrkB(Y817) значительно не изменялся с возрастом. (В) Соотношение фосфоTrkB(Y817)/TrkB было снижено в гиппокампе крыс OXYS в возрасте 18 месяцев (данные Вестерн-блот анализа). – возрастные различия; – межлинейные различия. (Г) Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга 20-дневных, 3- и 18-месячных крыс OXYS и Вистар специфичными антителами к TrkB-и фосфоTrkB(Y817)-рецептору (красный), ядра окрашены DAPI (синий). Масштаб: 10 мкм. Соотношение фосфоTrkB(Y817)/TrkB отражает степень активации TrkB-рецептора. В гиппокампе и префронтальной коре этот показатель не зависел от генотипа (F1,30 = 0,06, p = 0,80 и F1,29 = 0,001, p = 0,97, соответственно) и возраста (F2,30 = 1,2, p = 0,31 и F2,29 = 0,08, p = 0,92, соответственно) (рис. 12В, 13В). При этом сравнение групповых средних показало, что с возрастом у крыс OXYS степень активации TrkB-рецептора в гиппокампе снижается на уровне тенденции: в возрасте 18 месяцев соотношение фосфоTrkB(Y817)/TrkB было вдвое ниже, чем в возрасте 20 дней (p = 0,06), и в 1,6 раза ниже (p 0,04), чем у 18-месячных крыс Вистар (рис. 12В). Снижение этого показателя в гиппокампе 18-месячных крыс OXYS обусловлено происходящими с возрастом увеличением уровня TrkB-рецептора и умеренным снижением уровня фосфоTrkB(Y817)-рецептора. Подтверждением этих результатов стал анализ данных иммуногистохимического окрашивания препаратов мозга крыс OXYS и Вистар разного возраста (рис. 12Г, 13Г).
Изменения с возрастом уровня TrkB-рецептора, фосфоTrkB(Y817)-рецептора и их соотношения в префронтальной коре мозга крыс OXYS и Вистар. (A) УровеньTrkB-рецептора значительно не менялся с возрастом у крыс обеих линий. (Б) Уровень фосфоTrkB(Y817)-рецептора умеренно снижался с возрастом у крыс OXYS. (B) Соотношение фосфоTrkB(Y817)/TrkB не менялось с возрастом (данные Вестерн-блот анализа). – возрастные различия. (Г) Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга 20-дневных, 3- и 18-месячных крыс OXYS и Вистар специфичными антителами к TrkB- и фосфоTrkB(Y817)-рецептору (красный), ядра окрашены DAPI (синий). Масштаб: 10 мкм. Анализ изменений с возрастом содержания BDNF и его рецепторов TrkB и p75NTR в мозге крыс OXYS и Вистар. Для анализа содержания BDNF и его рецепторов TrkB и p75NTR в гиппокампе и префронтальной коре мозга 20-дневных, 3- и 18-месячных крыс OXYS и Вистар мы провели иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга специфическими антителами к mBDNF, proBDNF, TrkB и p75NTR. Анализ результатов не выявил межлинейных различий в интенсивности сигнала TrkB-рецептора и показал высокую частоту его колокализации с mBDNF в гиппокампе и префронтальной коре 20-дневных крыс обеих линий (рис. 14). Следует отметить, что поскольку содержание mBDNF в гиппокампе крыс OXYS в этом возрасте снижено по сравнению с одновозрастными крысами Вистар, мы наблюдали также сигналы свободного, не колокализованного с mBDNF, TrkB-рецептора. К возрасту 3 месяцев картина меняется: несмотря на отсутствие межлинейных различий в интенсивности сигнала TrkB-рецептора, крысы OXYS характеризуются более высокой частотой колокализации mBDNF с TrkB в гиппокампе и префронтальной коре, чем крысы Вистар (рис. 14). К возрасту 18 месяцев снижается содержание mBDNF в гиппокампе, но не коре мозга крыс обеих линий, что приводит к увеличению доли не колокализованного с mBDNF TrkB-рецептора (рис. 14А).
Анализ содержания proBDNF в гиппокампе и префронтальной коре показал, что у крыс OXYS в возрасте 20 дней интенсивность сигнала была выше, чем у крыс Вистар (рис. 15). Однако частота колокализации активирующего апоптоз proBDNF с высокоаффинным рецептором p75NTR в исследованных структурах мозга крыс обеих линий была низка. У крыс Вистар такая ситуация сохраняется и в возрасте 3 месяцев, тогда как у крыс OXYS наблюдается высокая частота колокализации proBDNF с p75NTR-рецептором. К возрасту 18 месяцев у крыс Вистар интенсивность сигнала p75NTR в гиппокампе увеличивается (рис. 15А), в префронтальной коре – уменьшается (рис. 15Б). При этом у них наблюдается высокая частота колокализации proBDNF и p75NTR-рецептора в обеих структурах мозга, а также наличие свободного p75NTR-рецептора в гиппокампе и proBDNF – в префронтальной коре. У 18-месячных крыс OXYS интенсивность сигналов proBDNF и p75NTR-рецептора в гиппокампе и префронтальной коре выше, чем у крыс Вистар, и наблюдается высокая частота их колокализации (рис. 15).
Анализ вклада изменений продукции нейротрофинов с возрастом в развитие признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS
Снижение функциональных возможностей мозга при развитии БА происходит постепенно. Одними из первых структур головного мозга, которые поражаются при БА, становятся фронтальная кора и гиппокамп (Mu, Gage, 2011). При этом наиболее уязвимым регионом гиппокампа, участвующего в механизмах обучения и консолидации памяти, становится поле СА1 (Wright et al., 2013). Выяснение механизмов, предшествующих и сопутствующих развитию нейродегенеративных изменений при БА, является актуальной фундаментальной проблемой. Ранее было показано, что развитие у крыс OXYS нейродегенеративных процессов происходит к возрасту 3-5 месяцев: деструктивные изменения нейронов и синапсов, нарушение длительной посттетанической потенциации, дисфункция митохондрий, появление очагов демиелинизации, гиперфосфорилирование тау-белка (Береговой и др., 2011; Stefanova et al., 2014a, 2015a). Закономерно, что эти процессы приводят к нарушению поведения животных: формированию пассивного типа поведения, повышению уровня тревожности, а также нарушению когнитивной функции – способности к обучению и памяти (Stefanova et al., 2014a). В настоящей работе нами установлено, что их развитию предшествуют и сопутствуют изменения нейротрофического обеспечения гиппокампа и префронтальной коры. На основании сравнения транскриптома коры мозга крыс Вистар и OXYS установлено, что у крыс OXYS в возрасте 20 дней, в период окончания формирования мозга, повышен уровень мРНК 4 из 126 генов сигнального пути нейротрофинов (Kegg pathway): Ngf, Mapk14, Bax и Nras, 3 из которых (Ngf, Bax и Nras) ассоциированы с апоптозом. Важно отметить, что белковые продукты генов Bax и Nras вовлечены в положительную регуляцию апоптоза. Кроме того, в коре мозга крыс OXYS в возрасте 20 дней повышена экспрессия генов других белков-активаторов апоптоза: Atm и Casp3, что может свидетельствовать об активации процессов апоптоза. Косвенным подтверждением этого может являться выявленный нами в настоящей работе сдвиг баланса proBDNF/mBDNF в направлении проформы белка в поле СА1 гиппокампа и коре мозга 20-дневных крыс OXYS. Активация апоптоза в структурах мозга крыс OXYS в этом возрасте может свидетельствовать как о задержке формирования мозга животных, так и о влиянии экзогенных индукторов апоптоза, таких как гипоксия. Действительно, Корболиной и соавторами (Korbolina et al., 2007) было показано, что у крыс OXYS в возрасте 21 дня нарушен метаболизм фосфокреатина (его усиленное накопление и вовлечение в биосинтез АТФ), что рассматривается как проявление адаптации мозга к гипоксии.
Несмотря на различия в процессах нейротрофического обеспечения в период завершения созревания мозга крыс OXYS и Вистар, период интенсивных изменений когнитивной деятельности (с возраста 20 дней до 5 месяцев) у них сопровождается сходными процессами – однонаправленным изменением экспрессии 45 генов сигнального пути нейротрофинов в префронтальной коре. Так, повышение экспрессии генов у крыс обеих линий в этот период ассоциировано с развитием и дифференцировкой нейронов, ростом отростков, а снижение – с отрицательной регуляцией нейрогенеза и аксоногенеза и активацией иммунного ответа. Таким образом, профиль экспрессии генов сигнального пути нейротрофинов, устанавливающийся в коре мозга крыс обеих линий к возрасту 5 месяцев, можно полагать, отражает состояние нейротрофического обеспечения зрелого мозга. В то же время, с возраста 20 дней до 5 месяцев для крыс OXYS было характерно изменение уровня мРНК 15 генов сигнального пути нейротрофинов, экспрессия которых не менялась в коре мозга крыс Вистар.
Как отмечалось выше, первые признаки нейродегенеративных процессов в мозге крыс OXYS проявляются уже в возрасте 3-5 месяцев (Береговой и др., 2011; Stefanova et al., 2014a, 2015a). В то же время, в силу пластичности биологических систем, параллельно с развитием нейродегенеративных изменений в мозге крыс OXYS запускаются компенсаторные процессы, направленные на предотвращение этих изменений. Так, в гиппокампе 5-месячных крыс OXYS увеличена численная плотность нейронов и синапсов за счёт повышения нейро- и синаптогенеза (Максимова и др., 2015). Как показали результаты настоящей работы, в коре мозга только крыс OXYS с возраста 20 дней до 5 месяцев происходит увеличение уровня мРНК генов, вовлечённых в положительную регуляцию сигнальной трансдукции, регуляцию биогенеза и организации клеточных компонентов, что также может свидетельствовать об активации у них синаптогенеза в возрасте 5 месяцев. Эта активация системы нейротрофинов в мозге крыс OXYS может являться одной из причин как увеличения численной плотности нейронов и синапсов, так и усиленной гибели нейронов в гиппокампе молодых крыс OXYS. Действительно, нами установлено, что в возрасте 3 месяцев в мозге крыс OXYS происходит функциональное напряжение системы нейротрофинов: повышение уровня BDNF за счёт как зрелой, так и незрелой формы белка, высокая частота колокализации mBDNF с TrkB-рецептором (активация нейропротекторных механизмов) и proBDNF с p75NTR-рецептором (активация механизмов ретракции аксонов, деструкции синапсов и апоптоза) по сравнению с одновозрастными крысами Вистар.
Нарушению сигнального пути нейротрофинов могут способствовать выявленные в гиппокампе и коре мозга 3-месячных крыс OXYS увеличение содержания тау-белка и его гиперфосфорилирование. Тау-белок ассоциирован с микротрубочками и обеспечивает их стабильность (Biernat et al., 1993), а также участвует в транспорте клеточных органелл и везикул (Probst et al., 2000). Однако гиперфосфорилирование тау-белка по аномальным сайтам приводит к образованию токсичных олигомеров и их агрегации (Abraha et al., 2000), структурному нарушению и дезорганизации микротрубочек (Lu, Wood, 1993). Следствием этого становится развитие транспортного коллапса и блокада транспортных путей в нейроне (Ebneth et al., 1998). Нарушение экзоцитоза и внутриклеточного транспорта рецепторов нейротрофинов является критичным событием для развития запускаемых нейротрофинами сигнальных каскадов. Таким образом, несмотря на отсутствие межлинейных различий в содержании TrkB-рецептора и степени его активации, повышенное содержание и гиперфосфорилирование тау-белка в гиппокампе и коре мозга 3-месячных крыс OXYS могут приводить к недостаточности нейротрофического обеспечения. В то же время, анализ данных транскриптома префронтальной коры показал, что с возраста 20 дней до 5 месяцев только у крыс OXYS повышалась экспрессия генов сигнального пути нейротрофинов, ассоциированных с процессами регуляции биогенеза и организации клеточных компонентов и положительной регуляции полимеризации актиновых филаментов, что может свидетельствовать об активации компенсаторных процессов, направленных на восстановление внутриклеточного транспорта и, как следствие, запускаемых нейротрофинами сигнальных каскадов.
Тем не менее, развивающиеся в возрасте 3-5 месяцев компенсаторные процессы оказываются неэффективными (новообразованные нейроны остаются незрелыми, синапсы – функционально неактивными) и неспособными остановить происходящие параллельно дегенеративные процессы. Следствием активного развития и манифестации нейродегенеративных процессов в мозге крыс OXYS становится гиперпродукция APP, накопление токсических форм А (А1-42) и образование амилоидных бляшек в гиппокампе и коре мозга в возрасте 12 месяцев. Токсические формы А, в свою очередь, могут способствовать дисфункции митохондрий в мозге крыс OXYS, усиливая порочный круг нейродегенеративных процессов (Stefanova et al., 2015a).