Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Клеточные и молекулярные механизмы ремоделирования костной ткани в норме и при патологии Дворниченко Марина Владимировна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Дворниченко Марина Владимировна. Клеточные и молекулярные механизмы ремоделирования костной ткани в норме и при патологии: диссертация ... доктора Медицинских наук: 14.03.03 / Дворниченко Марина Владимировна;[Место защиты: ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2018

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Негативная динамика заболеваемости опорно-двигательного аппарата среди взрослого населения РФ (по данным Федеральной службы статистики РФ, прирост за период с 2009 г. по 2013 г. на 5%) делает актуальным изучение механизмов их развития и разработку новых патогенетически обоснованных методов их диагностики, прогнозирования и профилактики. Важно подчеркнуть также, что по официальным данным, распространенность патологии опорно-двигательного аппарата у детей и подростков за этот период увеличилась на 42 % (Федеральная служба государственной статистики Российской Федерации (дата обращения 07.05.2016)), что диктует необходимость оценки возрастных аспектов морфо-функционального статуса костной ткани в норме и при патологии. Современные исследования патологических изменений костной ткани посвящены, в основном, клинико-инструментальному изучению снижения минеральной плотности костной ткани (остеопенический синдром). Установлено, что 24% населения России (34 миллиона человек) входят в группу повышенного риска развития остеопороза, 14 миллионов человек (10% населения страны) уже страдают этим заболеванием (Лесняк О.М., 2011). Именно остеопенические изменения связывают с высоким риском возникновения низкоэнергетических переломов, повышающих, в свою очередь, вероятность развития инвалидности (ВОЗ (WHO), 2007).

В основе регенерации костной ткани при заболеваниях и повреждениях опорно-двигательного аппарата лежат несколько фундаментальных процессов, обусловливающих их исход: 1) репаративное ремоделирование при травмах (Риггз Б. Л., Мелтон Л. Д., 2000; Brian J. et al., 2011; Li Shan et al., 2011; Bala Y., Farlay D., Boivin G., 2012; Nikodem A., cigaa K., 2012; Strm O. et al., 2012; Свешников А.А., 2013); 2) патологическое ремоделирование при нарушении клеточно-молекулярных механизмов, обеспечивающих морфофункциональный гомеостаз костной ткани (остеопороз, дисплазия соединительной ткани (несовершенный остеогенез) и т.д.) (Sfeir Ch. et al., 2005; Берченко Г.Н., 2011; Feng X., McDonald J.M.,2011; Marsell R.,Einhorn T.A., 2011; Kini U., Nandeesh B.N., 2012; Pobel Ye.A. et al., 2013).; 3) воспаление как типовой патологический процесс (Черешнев В.А., Гусев Е.Ю., 2012).

В большинстве клинических случаев снижение минеральной плотности костной ткани обусловлено превалированием активности процессов остеорезорбции над остеогенезом под влиянием предрасполагающих факторов, таких как образ жизни, диета, гормональный фон, внекостная хроническая патология. На их долю приходится около 60% всех случаев снижения минеральной плотности костной ткани, преимущественно среди взрослого населения (Swartz L. et al., 2013). В то же время доказано, что функциональная полноценность костной ткани взрослого человека связана с пиком минеральной плотности (peak bone mass), достигающим 90% уровня к 18-летнему возрасту (Berger C., 2010). В связи с этим не вызывает сомнений актуальность изучения

клеточных и молекулярных факторов, влияющих на накопление костной массы в период роста и в последующем участвующих в поддержании костной массы в зрелом возрасте, в том числе при травмах и хронической патологии. Данные о распространенности дисплазии соединительной ткани (ДСТ), связанной с наследственными или врожденными дефектами органической матрицы опорных тканей, отрывочны и противоречивы. Тем не менее, недифференцированные формы ДСТ диагностируются в 57-94 % случаев по нарушениям скелета (Нестеренко З.В., 2010; Goremykin I.V. et al., 2012; Goremykin I.V. et al., 2013; Volovar O.S., 2013), приводящим к тяжелой инвалидизации детей и взрослых.

С другой стороны, необходимость изучения процессов ремоделирования костной
ткани продиктована высоким уровнем травматизма, который на протяжении последних 5
лет характеризуется ростом от 1 % (для всего населения) до 10% (для возрастной группы
15-17 лет), увеличением тяжести повреждений опорно-двигательного аппарата с
преобладанием случаев многооскольчатых и фрагментарных переломов длинных костей
(Федеральная служба государственной статистики Российской Федерации

(дата обращения 07.05.2016); Халиман Е.А., Виноградов В.Г., 2008). Результаты хирургического восстановления дефектов костной ткани в большей степени зависят от протекания процесса репаративного остеогенеза, который, в свою очередь, имеет прямую зависимость не только от объема травмы, но и от исходного состояния системы ремоделирования костной ткани (Тихилов Р.М., Беленький И.Г., Кутянов Д.И., 2012). При этом в решении вопроса выбора имплантата в травматологии и ортопедии предпочтение отдается биосовместимым материалам с заданными и контролируемыми характеристиками, способными симулировать пространственную архитектонику и физиологическую активность костной ткани (Oryan A. et al., 2014). Однако исход лечения (остеоинтеграция или отторжение имплантата) до сих пор остается мало прогнозируемым, так как зависит от соотношения репаративных/патологических реакций на границе раздела имплантат/клетка (ткань) (Ratner B.D. et al., 2013).

Оценка функциональной активности костной ткани in vitro по показателям периферической крови является распространенным методологическим подходом, как в клинической практике, так и в научных исследованиях. Биохимические маркеры костеобразования и резорбции дают клинически полезную информацию, отражающую динамику физиологических и патологических процессов, связанных с деятельностью клеток костной ткани (Demers L.M. 1997; Seibel M.J., 2005). Однако вариабельность молекулярных маркеров периферической крови может быть связана с направленностью регенеративных процессов в кости (Дружинина Т.В., 2010) и отражать активность нейроэндокринной системы (Camozzi V. et al., 2007). Как следствие, актуальным становится поиск новых фундаментальных подходов, лежащих в основе диагностики, прогностики и коррекции повреждений и заболеваний костной ткани, вариантов реабилитации, ускорения процессов репарации и безопасности исходов регенерации.

Степень разработанности темы. В настоящее время считается доказанным наличие в периферической крови человека пула стромальных клеток-предшественниц (Chesney J. et al., 1997; 1998), количество которых увеличивается при иммуноселекции, хронических заболеваниях человека, а также при использовании методик, способствующих их выходу из костного мозга (Aerts F., Wagemaker G., 2006; Wang X., Li B., 2007; Moore K.L., Persaud T.V.N., Torchia M.G., 2011). В некотором отношении этот факт предполагает миграцию предшественников остеобластов к сайтам активного ремоделирования костной ткани (Enghbali-Fatourechi G.Z., et al., 2005) в том случае, если их природные “ниши” в системе кость/костный мозг разрушены патологическим процессом (остеопороз, несовершенный остеогенез и т.п.).

Тем не менее, изучение механизмов остеогенеза in vitro проводится, как правило, на культурах разобщенных клеток (в том числе, стволовых), лишенных своего естественного трехмерного микроокружения. Как показывают работы последних лет (Kolf C.M. et al., 2007; Ugarte F., Forsberga E.C., 2013; Calvi L.M., Daniel C., 2014; Pal B., Das B., 2017), в подобных условиях преобладают молекулярные процессы, связанные с пролиферацией клеток, а не c их дифференцировкой. Как следствие, полученные данные в существенной степени искажают реальную динамику регенераторных процессов, протекающих in vivo.

Регуляция процессов воспаления и регенерации со стороны системы крови, проявляющаяся в модулирующем влиянии ее клеточных и гуморальных компонентов на структурно-функциональный статус клеток костной ткани и ее межклеточного вещества, а также наличие циркулирующего пула предшественников остеогенных клеток в кровеносном русле позволяют провести in vitro оценку процессов, протекающих в многоклеточной системе мононуклеарных лейкоцитов крови здорового человека и травматолого-ортопедических больных при контакте с искусственными материалами (3D-матриксами), моделирующими свойства минерального вещества регенерирующей костной ткани.

Цель исследования: выявить новые закономерности физиологического и патологического ремоделирования костной ткани на основе лабораторного исследования клеточных и молекулярных реакций крови.

Задачи исследования:

  1. Изучить молекулярные маркеры ремоделирования костной ткани (остеокальцин, CrossLaps, изоферменты щелочной и кислой фосфатаз, кальций, фосфор) и воспаления (цитокины) в периферической крови в условиях физиологического, репаративного и патологического ремоделирования костной ткани.

  2. Исследовать в стандартной (двумерной) и трехмерной (в присутствии 3D-матриксов) культуре in vitro морфофункциональный и метаболический статус мононуклеарных лейкоцитов крови, участвующих в процессах физиологического и патологического ремоделирования костной ткани.

  1. Выявить молекулярно-клеточные реакции крови как патогенетические факторы и предикторы направленности ремоделирования костной ткани при клинически недифференцированных (у подростков-спортсменов, сколиоз) и дифференцированных (несовершенный остеогенез) формах дисплазии соединительной ткани.

  2. Разработать подходы к персонализированной оценке осложнений дисплазии соединительной ткани с использованием клеток крови и 3D-матриксов, имитирующих свойства минерального вещества регенерирующей костной ткани.

Научная новизна исследования. Впервые в сравнительном аспекте получены комплексные знания о механизмах клеточных и молекулярных реакций крови в условиях физиологического, репаративного и патологического ремоделирования костной ткани человека. Оригинальным представляется применение в качестве раздражителя морфофункциональной реакции клеток крови в условиях нормы и патологии костной ткани модельных имплантатов для остеосинтеза (3D-матриксов), имитирующих свойства минерального вещества регенерирующей костной ткани. Абсолютную новизну представляют данные о защитном (антимутагенном) влиянии 3D-матриксов в виде снижения выхода аберраций в культуре мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из крови пациентов с ДСТ и НО. Безусловный приоритет имеют результаты, свидетельствующие о присутствии в культуре мононуклеарных лейкоцитов крови при патологическом паттерне костного ремоделирования клеток с фибробластоподобным, остеобластоподобным или остеокластоподобным потенциалом. При этом добавление 3D-матриксов стимулирует in vitro морфофункциональную трансформацию лейкоцитов крови в остеобластоподобные (при минимальных признаках дисплазии (4-6 баллов по диагностической шкале), несовершенный остеогенез) и остеокластоподобные формы (при выраженной симптоматике дисплазии с суммой баллов 7 по диагностической шкале).

Установлено, что известные молекулярные показатели костного ремоделирования в периферической крови подростков 7-18 лет (остеокальцин, продукты деградации коллагена I типа (CrossLaps), изоферменты щелочной и кислой фосфатаз, кальций, фосфор), системно не занимающихся спортом, не являются надежными (с точки зрения дифференциальной диагностики) лабораторными маркерами физиологической (здоровые добровольцы), репаративной (посттравматический период) или патологической (сколиоз) регенерации костной ткани. Обосновано, что только при недифференцированной (у спортсменов-подростков 11-14 лет) и дифференцированной (несовершенный остеогенез, НО) формах дисплазии соединительной ткани (ДСТ) количественные изменения в крови продуктов деградации коллагена I типа (CrossLaps) имеют значение для анализа молекулярных механизмов нарушений ремоделирования костной ткани.

На основе изменений в крови концентраций CrossLaps и остеокальцина сформулирована гипотеза и обосновано принципиально новое ранжирование подростков-спортсменов 11-14 лет с фенотипическими проявлениями недифференцированной дисплазии соединительной ткани (НДСТ) на 2 группы: без выраженных проявлений

(сумма баллов анкетной клинической оценки менее 7) и с явными (сумма баллов 7) признаками НДСТ.

Теоретическая и практическая значимость. Выявленные закономерности клеточных и молекулярных реакций в периферической крови здоровых добровольцев и пациентов травматолого-ортопедического профиля позволяют обосновать новое прикладное направление в персонифицированной лабораторной диагностике патологии костной ткани с использованием трехмерных культур мононуклеарных лейкоцитов. Методологический подход на основе 3D-матриксов (модельных имплантатов для остеосинтеза), имитирующих свойства минерального вещества регенерирующей костной ткани, позволяет моделировать in vitro реакции остеогенеза/остеолиза, что имеет значение для оценки патогенетических основ клинической симптоматики при НДСТ, прогнозирования исходов патогенетически оправданного применения погружных конструкций при хирургическом лечении патологических переломов у пациентов с несовершенным остеогенезом.

По результатам исследования оформлены ноу-хау (секрет производства) “Способ
выявления в периферической крови клеток со стромальным фенотипом” (приказ №43 от
20.02.2014 по ГБОУ ВПО СибГМУ МЗ РФ; авторы - Хлусов И.А., Дворниченко М.В.,
Больбасов Е.Н., Саприна Т.В., Сизикова А.Е.), «Способ диагностики дисплазии

соединительной ткани у детей и подростков с учетом физической нагрузки» (приказ №40 от 15.08.2017 по ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России; авторы - Сизикова А.Е., Дворниченко М.В., Хлусов И.А., Саприна Т.В., Пашкова Е.Н.)

Методология и методы исследования. В структуре поэтапного исследования применялись подходы доказательной и персонифицированной медицины. Проведен скрининг периферической крови 355 человек с оценкой дистантных показателей метаболизма костной ткани (активность общей фракции щелочной фосфатазы (ОЩФ) и ее костного изофермента (КЩФ), общей фракции и тартрат-резистетной изоформы кислой фосфатазы (ОКФ и ТРКФ), концентрация остеокальцина и продуктов деградации коллагена 1 типа - CrossLaps), показатели кальций-фосфорного обмена (концентрация общего и ионизированного кальция (Ca), неорганического фосфора (P)), цитокинов (концентрация IL-1, 4, 6, 10, INF-, TNF).

Изучаемые показатели у обследуемыех детей и подростков 7-18 лет группировались по типу костного ремоделирования: физиологическому (здоровые дети и подростки), репаративному (дети и подростки в посттравматическом периоде через 1-1,5 года после перенесенной травмы длинных трубчатых костей), патологическому (дети и подростки с диагностированным сколиозом). Полученные данные были проанализированы с учетом возрастных и гендерных характеристик.

Фенотип (анкетный метод, клинический осмотр) подростков-учащихся спортивных школ (11-14 лет) и состояние крови (маркеры костного ремоделирования) изучали на предмет проявлений НДСТ в условиях постоянной физической нагрузки, у больных

несовершенным остеогенезом – как состояние клинически дифференцированной ДСТ с наличием костных осложнений в виде патологических переломов.

В экспериментальной части исследования, в том числе на лабораторных животных,
были протестированы 3D-матриксы, имитирующие свойства минерального вещества
регенерирующей костной ткани, как клеточные раздражители и, с другой стороны,
модельные имплантаты для остеосинтеза. Цитологические и гистологические
характеристики 3D-матриксов были исследованы in vivo и in vitro методом эктопического
костеобразования при их подкожной имплантации, методом краткосрочного

сокультивирования с мезенхимными стволовыми клетками человека (оценка остеогенных свойств), при помощи цитотоксического теста (изменение внутриклеточной концентрации активных форм кислорода и жизнеспособности миелокариоцитов лабораторных крыс; оценка жизнеспособности мононуклеарных лейкоцитов крови человека).

Краткосрочное культивирование мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых добровольцев, подростков-спортсменов с признаками НДСТ и больных с НО применяли в стандартном двумерном (2D) варианте (на пластиковой поверхности культуральной посуды) и в 3D-культуре в присутствии матриксов с разновидностями кальцийфосфатного покрытия. Сравнительный анализ изменений в 2D- и 3D-культурах проводили на основе персонализированной оценки морфофункционального состояния мононуклеарных лейкоцитов крови человека.

Морфофункциональную реакцию клеток крови определяли с использованием принципов компьютерной морфометрии (морфологические индексы прилипающих к пластику клеток), на основе биохимических (концентрация общего и ионизированного Ca, неорганического P, активности ОЩФ и ОКФ, содержание остеокальцина и CrossLaps, концентрации IL-1b, 2, 4, 6, TNF и IFN в межклеточной жидкости культуры), иммуноцитохимических (уровень экспрессии клеточными элементами CD34, CD44 и остеокальцина) и цитохимических исследований (щелочная и кислая фосфатазы, неспецифическая эстераза).

В условиях физиологического и патологического ремоделирования костной ткани исследовали частоту и спектр хромосомных аберраций в тесте спонтанного и индуцированного (в присутствии 3D-матриксов) мутагенеза, а также уровень экспрессии генов хемокинов (ССR5 и RANTES) мононуклеарными лейкоцитами.

Результаты проведенного исследования подвергали статистической обработке. Исследование проводилось на базах: ОГАУЗ Детская больница №1 (г. Томск), детское отделение Филиала ТНИИКиФ ФГБУ СибФНКЦ ФМБА России (г. Томск), Томский филиал ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздравсоцразвития России (г. Томск), ОГАУЗ Врачебно-физкультурный диспансер (г. Томск), кафедра морфологии и общей патологии (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России, г. Томск), НОЦ «Биосовместимые материалы и биоинженерия» (при ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России, ФГАОУ ВО НИ ТПУ, ФГБУН ИФПМ СО РАН, г. Томск).

Положения, выносимые на защиту:

  1. В периферической крови детей и подростков 7-18 лет, не занимавшихся спортом, отсутствуют выраженные различия молекулярных маркеров физиологического, репаративного и патологического ремоделирования костной ткани (концентрации остеокальцина, продуктов деградации коллагена I типа (CrossLaps), кальция, фосфора, активности изоферментов щелочной и кислой фосфатаз) и воспаления (концентрация цитокинов).

  2. Фенотипически выраженная недифференцированная форма дисплазии соединительной ткани (НДСТ) сопровождается снижением в крови подростков-спортсменов 11-14 лет концентраций ионизированного кальция, а также продуктов деградации коллагена I типа (CrossLaps), коррелирующим с уменьшением содержания остеокальцина, что предполагает уменьшение активности костного ремоделирования.

  3. При дифференцированной форме дисплазии соединительной ткани (несовершенный остеогенез) увеличение тяжести заболевания ассоциировано с линейным изменением в периферической крови показателей ремоделирования (повышением концентрации продуктов деградации коллагена I типа (CrossLaps) и напротив, снижением концентрации остеокальцина), что свидетельствует о выраженном функциональном дисбалансе клеточных механизмов ремоделирования костной ткани.

  4. 3D-матриксы, имитирующие свойства минерального вещества регенерирующей костной ткани, являются остеогенными раздражителями; стимулируют in vitro секрецию цитокинов и морфофункциональную трансформацию мононуклеарных лейкоцитов в клетки с остеобластоподобной (НДСТ, несовершенный остеогенез) и остеокластоподобной (выраженная НДСТ) активностью; снижают выход одиночных и парных разрывов хромосом, повышают экспрессию генов хемокинов в мононуклеарах крови при патологическом ремоделировании костной ткани.

  5. Оценка клеточно-молекулярных реакций остеогенеза/остеолиза, в том числе, в культуре мононуклеарных клеток крови на контакт с 3D-матриксами, перспективна для разработки персонифицированной оценки тяжести НДСТ, прогнозирования исходов применения имплантатов для остеосинтеза при хирургическом лечении пациентов с несовершенным остеогенезом.

Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности
полученных результатов подтверждается выполнением работы на достаточном
экспериментальном и клиническом материале (358 обследованных, 26

экспериментальных животных, 11762 проб) с использованием современных и высокотехнологичных молекулярно-биологических методов исследований. Полученные результаты статистически обработаны с помощью современных методов доказательной медицины. Результаты проведенного исследования докладывались и обсуждались на ХХІІth IFMBE Proceedings World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering (г. Мюнхен, Германия, 2009), Российском конгрессе ASAMI (г. Курган, 2009), IV

Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (г. Санкт-Петербург, 2010), IХth Baltic- Bulgarian Conference on Bionics and prosthetics Biomechanics and mechanics mechatronics and robotics (г. Рига, Латвия, 2013), Russian-German Workshop “Biocompatible Materials and Coatings: Fundamental Problems & Trends, Biomedical Applications” (г. Томск, 2013), X Международной научно-практической конференции «Наука и технологии: шаг в будущее - 2014» (г. Прага, Чехия, 2014), III Всероссийской научной интернет-конференции с международным участием «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (г. Казань, 2014), X Юбилейном Всероссийском съезде травматологов-ортопедов (г. Москва, 2014), конгрессе «Здравоохранение России. Технологии опережающего развития» (г. Томск, 2015), ХIII конгрессе Международной ассоциации морфологов (г. Петрозаводск, 2016), Международной научно-практической конференции «Илизаровские чтения» (г. Курган, 2017).

Исследование поддержано грантами в рамках проектов Федеральных целевых
программ: «Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых

исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем с участием
научных организаций Японии» (ГК № 02.512.11.2285 от 10.03.2009), «Разработка научно-
методических основ создания биокомпозитов «наноструктурный метал - наноструктурное
покрытие» на основе титана, циркония, ниобия и их сплавов, фосфатов кальция или
оксинитридов титана для медицинских имплантатов нового поколения в приложении к
регенеративной и сердечно-сосудистой хирургии» (Соглашение №8036 от 12.07.2012),
РФФИ 2009-2011 «Экспериментальное исследование и решение фундаментального
вопроса о существовании ниши для остеогенной дифференцировки стромальных
стволовых, ее количественных параметрах и топографии» (№ 09-04-00287а), Фонда
содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере («Разработка
персонализированной тест-системы патологии соединительной ткани (ПСТ-

диагностикум)» (договоры №5072ГУ1/2014 от 26.12.2014, №10490ГУ2/2015 от 26.08.16, «Разработка методов индивидуальной диагностики биосовместимости дентальных имплантантов» договор №11808ГУ/2017 от 03.06.2017).

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры морфологии и общей патологии (разделы «Гистология», «Патология минерального обмена»); в программе скрининга патологии соединительной ткани у детей и подростков, учащихся спортивных школ на базе ОГАУЗ Врачебно-физкультурного диспансера (г. Томск).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы, из них 21 статья – в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации, 3 – цитируемых в Web of Science, 4 – цитируемых в Scopus.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 285 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитируемой

литературы, включающего 585 источников – 99 отечественных и 486 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 54 таблицами.

Личный вклад автора. Автором проведены планирование и разработка дизайна
исследования, сформулированы его цель и задачи, выполнен анализ отечественной и
зарубежной литературы, отражающей современное состояние исследований по данной
проблеме, определен методологический подход, позволяющий наиболее полно решить
поставленные в исследовании задачи, самостоятельно выполнен весь комплекс
запланированных методов, проведена статистическая обработка данных,

интерпретированы и опубликованы основные результаты.