Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы
1.1. Современные представления о механизмах формирования и растворения фибринового сгустка 9
1.2. Основные факторы, определяющие структуру и свойства фибринового сгустка 14
1.3. Клеточные микровезикулы, их роль в гемостазе 21
1.4. Структура и свойства фибрина, как детерминанты тромбогенности ... 29
Глава II Материалы и методы исследования 34 глава iii результаты собственных исследований
3.1. Контроль исследуемых проб плазмы 49
3.2 Изучение опосредованного тромбином влияния микровезикул на кинетику формирования, структуру и устойчивость сгустка фибрина .52
3.3 Изучение прямого влияния микровезикул на структуру сгустка фибрина .. 63
Глава IV Заключение 69
Практические рекомендации 80
Список сокращений 81
Список литературы
- Основные факторы, определяющие структуру и свойства фибринового сгустка
- Структура и свойства фибрина, как детерминанты тромбогенности
- Изучение опосредованного тромбином влияния микровезикул на кинетику формирования, структуру и устойчивость сгустка фибрина
- Изучение прямого влияния микровезикул на структуру сгустка фибрина
Основные факторы, определяющие структуру и свойства фибринового сгустка
Завершающим этапом процесса свертывания крови является образование фибринового сгустка, укрепляющего первичную тромбоцитарную пробку. Фибриноген – растворимый белок плазмы крови (плазменный гликопротеин) который под действием фермента тромбина превращается в нерастворимый полимерный фибрин, составляющий основу сгустка крови. Фибриноген – один из наиболее крупных белков плазмы крови, с молекулярной массой более 340-кДа. [2]. Трехмерная структура фибриногена изучена достаточно подробно. Фибриноген состоит из цепочек, связанных в димерной структуре 29 дисульфидными связями на 1 моль белка.
У всех млекопитающих фибриноген представлен в виде гексамера, содержащего три пары полипептидных цепей (A,B)2 и углеводной цепи, присоединяющейся к аспарагиновым остаткам уже после завершения трансляции. Аминокислотная последовательность определена полностью. Все 6 аминоконцевых аминокислотных остатков сгруппированы около друг друга. Из цепей формируются три узла, называемых доменами. Е-домен расположен в центре, он сформирован из NH2-концевых участков всех шести цепей. D-домены образованы. B и -цепями. Два симметричных домена D находятся по краям от домена Е. D-домены связаны с Е-доменом двойными витками -спирали. С-концы A-цепей шаровидные и расположены недалеко от Е-домена фибриногена [79]. По структуре белок крайне неоднороден, поскольку в молекуле имеется ряд мест, модифицирующихся во время или после биосинтеза [2]. В ходе пострансляционной модификации фибриноген подвергается гликозилированию, фосфорилированию, сульфатированию и гидроксилированию, что приводит к еще большему увеличению вариантов белка в организме [71].
Механизм круговорота фибриногена малоизучен. Ежедневно фибриноген синтезируется в количестве от 1,7-5г, при этом организм имеет резервную возможность увеличить скорость синтеза в 20 раз. Период полужизни фибриногена 3-5 дней. В ходе процесса свертывания и фибринолиза используется не более 2-3% общего количества фибриногена. После образования в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме печени, фибриноген секретируется в кровь, где, очевидно, происходит его окончательная сборка. Вновь синтезируемые B-цепи секретируются в кровь быстрее, в отличие от A-цепей и -цепей, накапливающихся во внутриклеточном пуле. Большую роль в образовании макромолекулы играют дисульфидные связи на концах витков спирали, сами витки и связи между двумя половинами молекулы. Понимание процесса синтеза фибриногена необходимо для правильного определения его патогенетической роли при патологических процессах [70].
В процессе образования фибрина выделяют три этапа: 1. протеолитическая или ферментативная стадия, результатом которой является отщепление пептидов А и В и образование фибрин-мономера; 2. полимеризационная или неферментативная стадия, в ходе которой мономеры соединяются друг с другом бок-в-бок и конец-в-конец, формируется сеть фибрина; 3. стабилизационная стадия, где фибриновая сеть стабилизируется ковалентными связями под действием XIIIa фактора [103]. В N—концевой области A и B цепей имеются участки связывания тромбина. Следует отметить, что фибриноген и фибрин связывают тромбин примерно с одинаковой афинностью, но на сгустке адсорбируется в 5 раз больше тромбина, чем на преформированном фибрине. Часть связанного с фибрином тромбина постепенно отделяется от него. Связанный тромбин сохраняет свою активность и не поддается ингибированию антитромбином. Во время перехода фибриногена в фибрин в первой стадии фибринопептиды A и B освобождаются по аргиниловым связям в N-концевом дисульфидном узле. Пептид А отщепляется в 40 раз быстрее, чем пептид В. В молекуле мономерного фибрина есть 4 пары связывающих участков, которые обозначаются как «выступы» A и B (они находятся в центральном узелке), а также «впадины» а и b (они находятся в периферических глобулах). Выступ A комплементарен впадине а, тогда как выступ B комплементарен впадине b, а их взаимодействие – A:a и B:b – приводит к спонтанной полимеризации, т.е. самосборке, фибрина [63]. После удаления фибринопептида А от NH2-конца A-цепи полимеризационный центр «А» взаимодействует с комплементарным центром «а» расположенным на С-конце другой молекулы фибрин-мономера.
Далее молекулы образуют линейные полимеры – протофибриллы, ковалентную стабилизацию которых обеспечивает на третьей стадии XIIIа фактор. Эти структуры растут в разных направлениях, формируя фибриновый гель. На первой стадии обнаружено образование комплексов фибриногена с молекулами фибрин-мономера, которые предотвращают чрезмерную полимеризацию фибрина, мешающую формированию полноценного сгустка [70]. Протеолитическое отщепление В-пептидов от B-цепи увеличивает реактивность молекул, заключающуюся в дополнительном связывании кальция и конформационных изменениях, что приводит к появлению других центров полимеризации. Для полноценной полимеризации фибрина и формирования протофибрилл необходимо комплементарное взаимодействие участков A-a [124]. Ранее предполагалось, что взаимодействие участков B-b не участвует в образовании протофибрилл, а имеет отношение к процессу их латеральной агрегации, которая определяет диаметр формирующихся волокон. До настоящего времени этот вопрос не прояснен.
Структура и свойства фибрина, как детерминанты тромбогенности
Применялся тест оценки генерации тромбина в упрощенной модификации оригинального метода [150] В дефибринированные рептилазой («Sekisui Diagnostics», США) пробы БТП, ОМП или ОМП-К (400 мкл) вносили хромогенный субстрат тромбина S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA 2HCl) («Chromogenix», Испания) в конечной концентрации 2 мМ (субстрат добавлялся в большом избытке, так что скорость его расщепления определялась исключительно активностью тромбина), свертывание инициировали добавлением 20 мкл 0,5 M CaCl2. Кинетика образования тромбина и его амидолитическая активность измерялась по увеличению оптической плотности при длине волны 405 нм. График, характеризующий динамику образования и общее количество тромбина (тромбинограмма), строился как первая производная кинетической кривой расщепления субстрата тромбином (рисунок 5).
Определялись следующие параметры тромбинограммы: 1) лаг-период, (LТ) т. е. время от добавления Ca2+ до первых оптических признаков гидролиза субстрата; 2) время достижения пика генерации тромбина (ТТР); 3) высота пика (PTG), т.е. максимальный уровень тромбина; 3) эндогенный тромбиновый потенциал (ETP), равный площади под кривой (рисунок 5). Рисунок 5 - Типичная исходная фотометрическая кривая (A), отражающая динамику расщепления хромогенного субстрата тромбина. (B) первая производная кинетической кривой (тромбинограмма). Определяемые параметры: лаг-период (LТ); время достижения пика (ТТР); высота пика (PTG); эндогенный тромбиновый потенциал (ETP)
Оптическая плотность расщепления хромогенного субстрата пересчитывалась в молярную концентрацию тромбина по калибровочной кривой, построенной с разведениями препарата очищенного человеческого тромбина. Известное количество тромбина («HYPHEN-BioMed», Франция) (0; 0,625; 1,25; 2,5; 5 единиц ЕД/мл) добавляли к 400 мкл дефибринированной плазме, содержащей S-2238 в конечной концентрации 2 мМ. Регистрировали поглощение при 405 нм. Единицы были преобразованы в молярную концентрацию -тромбина исходя из того, что молекулярная масса тромбина равна 37 кДа и том факте, что 4,35 мкг препарата тромбина обладают активностью в 10 единиц (рисунок 6).
Определение кинетики «внутреннего» фибринолиза методом динамической турбидиметрии.
Ферментативный гидролиз фибрина (фибринолиз) сопровождается просветлением (уменьшением оптической плотности) сгустка, поэтому скорость расщепления фибрина может быть изучена методом динамической турбидиметрии так же, как и скорость его формирования. К 400 мкл исследуемого образца плазмы (БТП или ОМП) одновременно с 20 мкл 0,5 М хлорида кальция добавляли 4 мкл тканевого активатора плазминогена (т-АП) («HYPHEN-BioMed», Франция) в конечной концентрации 50 нг/мл, т-АП вызывал превращение неактивного плазминогена в активный плазмин на волокнах фибрина в процессе и после их формирования, стимулируя их ферментативный плазминовый гидролиз. Турбидиметрическое исследование динамики фибринолиза проводили в течение 14 часов.
Определяли следующие параметры турбидиметрической кривой: общее время лизиса (TLT), т. е. время от добавления хлорида кальция и Т-АП до полного растворения сгустка; скорость лизиса фибрина (V) – снижение оптической плотности в единицу времени после достижения плато; время 50%-ного лизиса (t1/2) – время от добавления хлорида кальция и Т-АП до снижения оптической плотности до половины максимальной; время лизиса сгустка (CLT) – время между моментом возрастания оптической плотности до половины максимальной (фаза формирования сгустка) и моментом снижения оптической плотности до половины максимальной (фаза лизиса сгустка) (рисунок 7). Обработку и графическое представление результатов турбидиметрии проводили с использованием программы OriginLab 8 («OriginLab№, США).
Типичная турбидиметрическая кривая, отражающая формирование и лизис сгустка. Рассчитывались параметры: общее время лизиса (TLT); скорость лизиса фибрина (V); время 50%-ного лизиса (t1/2); время лизиса сгустка (CLT) 9. Определение кинетики «внешнего» фибринолиза. «Внешний» фибринолиз моделировался как аналог воздействия на фибриновый сгусток экзогенных тромболитиков. Лизис сгустка регистрировался оптической системой и определялись его параметры с помощью специально созданной оригинальной программы.
Предварительно из 90 мкл рекальцинированной плазмы (БТП и ОМП) в прозрачной камере были сформированы сгустки. Лизис инициировали 10мкл т-АП (1 мкг/мкл) нанесенным на верхнюю поверхность сгустка размером около 12 х 7 х 1 мм. Процесс лизиса начинали регистрировать сразу после нанесения активатора плазминогена (нулевой момент времени). Оптическая система позволила регистрировать процесс деградации сгустка в режиме реального времени (10кадров в минуту).
Полученные данные были обработаны при помощи специально созданной оригинальной компьютерной программы. При анализе кинетической кривой, отражающей распространение фронта лизиса извлекались параметры внешнего фибринолиза: 1) время задержки (Lag), время в минутах от начала анализа до первых признаков фибринолиза (снижения оптической плотности); параметр отражает время, необходимое для формирования комплексов т PA/плазминоген/фибрин для образования плазмина; 2) степень лизиса, отражающая разницу начального и конечного размеров сгустка после 90 минут наблюдения (в %); 3) наклон кривой (V) или средняя скорость лизиса, определявшаяся как разница в % между начальным и конечным размерами сгустка (рисунок 8). Рисунок 8 - Типичная кинетическая кривая, отражающая распространение фронта лизиса сгустка. Рассчитывались параметры: время задержки (Lag); степень лизиса; средняя скорость лизиса (V)
Фибриновые сгустки, полученные путем рекальцификации БТП, ОМП и ОМП-К, а также фильтры, использованные для удаления микровезикул из плазмы, отмывали 0,05 M раствором какодилата натрия, содержащим 0,1 M NaCl (pH 7,4), фиксировали в 2% глутаровом альдегиде, обезвоживали в этаноле от 30% до 100%, фиксировали гексаметилдисилазаном (HMDS, Sigma-Aldrich, США) и напыляли слой золота с палладием (Polaron, e5100 sputter coater, Quorum Technologies, Великобритания) [104]. Образцы исследовали в микроскопе FEI Quanta 250 microscope (FEI, США). Толщину индивидуальных волокон фибрина измеряли в рандомизированных участках (200 волокон в сгустке, в трех сгустках для каждого эксперимента) с использованием программы Adobe Photoshop cs6 (рисунок 9). Рисунок 9 - Пример измерения толщины индивидуальных волокон фибрина с использованием сканирующей электронной микроскопии
Изучение опосредованного тромбином влияния микровезикул на кинетику формирования, структуру и устойчивость сгустка фибрина
Выявленные эффекты МВ соответствовали их участию в генерации тромбина на анионных фосфолипидах. Косвенное кинетическое влияние MВ на полимеризацию и свойства фибрина подтверждается тем, что обогащение ОМП взвесью фосфолипидов восстанавливало коагуляционный дефект, созданный при удалении МВ путем фильтрации плазмы, а именно: кинетику фибринообразования и оптические свойства сгустка как в модели активации свертывания тканевым фактором, так и при рекальцификации плазмы. Для полной расшифровки механизма мы изучили кинетику и уровень генерации тромбина в БТП, ОМП и ОМП-К.
При исследовании амидолитической активности тромбина по гидролизу хромогенного субстрата S-2238 в БТП, ОМП и ОМП-К были выявлены следующие различия. Кинетические параметры: лаг-период и время достижения пика генерации тромбина были достоверно выше в присутствии МВ (БТП) и фосфолипидов (ОМП-К) (p 0,05; n=6). В то же время высота пика тромбина и эндогенный тромбиновый потенциал достоверно не различались в исследованных образцах (p 0,05; n=6). Иными словами, в присутствии как эндогенных МВ, так и экзогенных фосфолипидов происходило ускорение тромбинообразования, но не менялось общее количество активного фермента (таблица 5, рисунок 14).
Таким образом, изучение кинетики и уровня генерации тромбина в БТП, ОМП и ОМП-К, показало влияние МВ и экзогенных фосфолипидов на скорость образования активного фермента. При этом конечный уровень тромбина не зависел от присутствия или отсутствия МВ. Наши результаты согласуются с данными [45], которые свидетельствуют о том, что МВ, содержащие тканевой фактор, оказывают влияние на лаг период, но не уровень генерации тромбина.
Далее было необходимо найти объяснение наблюдавшимся изменениям оптической плотности сгустков в присутствие МВ. Известно, что при более медленном образовании мономеров фибрина и растворимых олигомеров их латеральная агрегации преобладает над элонгацией [163], что приводит к формированию более толстых волокон фибрина. Такая структура обладает большей способностью к светорассеянию, что могло бы объяснить повышение плотности сгустков после удаления МВ наблюдавшееся нами как в модели активации свертывания тканевым фактором, так и при рекальцификации. Исходя из этого, мы предприняли исследование сгустков методом сканирующей электронной микроскопии.
Ультраструктура сгустков, исследованных методом сканирующей электронной микроскопии существенно различалась (рисунок 15). Сгустки, сформированные в присутствие МВ (БТП) или экзогенных фосфолипидов (ОМП-К), состояли из более тонких волокон и имели компактную структуру, тогда как сгустки, сформированные в отсутствие МВ (ОМП), состояли из более толстых волокон и имели пористую структуру. При измерении толщины индивидуальных волокон фибрина в рандомизированных участках (200 волокон, в трех сгустках для каждого эксперимента) параметр для волокон в сгустках, приготовленных из БТП составил 170 ± 38 нм, ОМП – 214 ± 43 нм, ОМП-К – 141 ± 34 нм (p 0,05; n=200). Кроме того, обращало на себя внимание присутствие гранулярных структур, расположенных на поверхности фибриновых волокон в БТП- и ОМП-К-сгустках, в то время как волокна фибрина в ОМП-сгустках были гладкими.
Особенности структуры фибринового сгустка являются одной из детерминант скорости и полноты фибринолиза. Мы изучили влияние МВ на лизис сгустка, индуцированного т-АП в двух вариантах: модели «внутреннего» и «внешнего» фибринолиза. Внутренний фибринолиз индуцировался добавления т-АП одновременно с инициацией свертывания путем рекальцификации плазмы. Формирование сгустка и его последующее растворение регистрировались турбидиметрически, соответственно, по возрастанию оптической плотности до достижения плато и последующему снижению оптической плотности до исходных значений.
При изучении динамики внутреннего фибринолиза было выявлено, что удаление МВ из плазмы (ОМП) сопровождается снижением всех параметров, характеризующих время лизиса сгустка, а именно: общее время лизиса (TLT), время 50%-ного лизиса (t1/2) и время лизиса сгустка (CLT) (p 0,01; n=4), то есть ускорением процесса фибринолиза. Скорость лизиса фибрина (V) в ОМП была также достоверно выше, чем в БТП (p 0,01; n=4). Это свидетельствовало о том, что сгустки, образующиеся в присутствии МВ, обладают большей устойчивостью к расщеплению плазмином (таблица 6, рисунок 16).
Процесс внешнего фибринолиза, являющийся аналогом тромболитической терапии, исследовался путем нанесения т-АП на поверхность преформированных сгустков БТП и ОМП. Мы наблюдали продвижение фронта лизиса от поверхности с нанесенным т-АП вглубь сгустка в виде практически ровной линии (рисунок 17А). Анализ кинетических кривых внешнего фибринолиза с помощью специально разработанной программы выявил, что удаление МВ из плазмы (ОМП) сопровождается укорочением лаг-периода (p 0,05; n=4), снижением степени лизиса за фиксированное время (90 минут) (p 0,05; n=4) и повышением скорости лизиса сгустка (p 0,05; n=4), т. е. ускорением фибринолиза. Следовательно, сгустки, формирующиеся в присутствии МВ, обладают большей устойчивостью к протеолизу плазмином извне (таблица 7, рисунок 17).
Изучение прямого влияния микровезикул на структуру сгустка фибрина
Целью каскада реакций коагуляции (коагуляционного гемостаза) является образование фибрина, составляющего основу гемостатического сгустка или тромба. Полноценность сформированной фибриновой сети с одной стороны обеспечивает эффективное предотвращение или уменьшение потери крови, а с другой стороны – восстановление кровотока за счет своевременного лизиса сгустка.
Очевидно, что существуют значительные индивидуальные вариации структуры фибринового сгустка, так как и генетические и экзогенные факторы определяют баланс между стабильностью и подверженностью сгустка фибринолизу [73]. Отдельные агенты, такие как рН, кальций, восстановители, температура, прямо воздействуют на фибриноген, другие оказывают влияние на формирование фибриновой сети, вмешиваясь в процесс полимеризации, в том числе опосредованно через активацию клеток [139].
Структура и свойства фибринового сгустка являются детерминантами тромботического потенциала. Измененная структура фибрина характерна как для артериального, так и венозного тромбоза [13]. В частности, архитектура фибриновой сети меняется при заболеваниях, связанных с атеротромбозом, включая инфаркт миокарда: после перенесенного ИМ сгусток имеет меньшую проницаемость и сниженное соотношение масса/длина волокон [127]. Существует независимая ассоциация между проницаемостью сгустка, распространенностью, тяжестью стеноза артерии и фибринолитической активностью. Пациенты с более тяжелыми формами коронарной болезни имеют более жесткую структуру сгустка и повышенное соотношение масса/длина волокон [129]. Причем отмеченные особенности наблюдаются независимо от получения пациентами аспирина, который, потенциально повышает проницаемость сгустка и чувствительность к фибринолизу [22]. Более того, мужчины первой степени родства с пациентами, имеющими ранние проявления коронарной болезни, также склонны к образованию ex vivo фибриновых сгустков аномальной структуры. В них полимеризация начинается быстрее, они менее пористы, содержат более толстые волокна, причем, наблюдаемые различия не обусловлены классическими факторами риска или известными полиморфизмами [22]. Аномальная структура сгустка обнаруживается и при диабете, прогрессирование которого сопровождается ростом риска тромбоза. У пациентов формируются менее проницаемые, состоящие из слившихся между собой толстых пучков, плотные сети фибрина [16]. Структурные особенности фибрина являются важнейшей детерминантой чувствительности тромбов к лизису при соответствующей терапии, то есть выявление факторов, обуславливающих резистентость тромбов к растворению, представляет собой актуальную клиническую задачу.
Важную роль в формировании фибрина играет активность тромбина: при его низких концентрациях образуются порозные фибриновые сгустки, состоящие из толстых волокон, в то время как при высоких концентрациях сгустки формируются из тонких, плотно упакованных волокон [164]. Образование активного тромбина, в свою очередь, зависит от различных факторов, в том числе от циркулирующих в крови микровезикул – фосфолипидно-белковых частиц размером 0,1-1 мкм, поступающих в кровь при активации и/или апоптозе клеток крови и эндотелиоцитов. Прокоагулянтные свойства МВ обеспечиваются присутствием анионных фосфолипидов, тканевого фактора и других белков [132]. Кроме участия в инициации и распространении образования активного тромбина, воздействие МВ на полимеризацию фибрина, структуру и свойства сгустка, может быть обусловлено прямым взаимодействием белковых (прежде всего рецепторов) или липидных компонентов этих субклеточных образований с фибриногеном/фибрином. Исходя из этих предпосылок в настоящей работе был исследован малоизученный вопрос о гемостатической роли МВ, а именно, возможность изменения клеточными МВ гемокоагуляции на ее конечном этапе – формировании фибринового сгустка. Характер влияния отдельных фракций МВ на инициацию и кинетику образования фибрина систематично описан лишь в работе [11], при этом авторы изучали воздействие тромбоцитарных и моноцитарных МВ, полученных путем активации клеток in vitro. В то же время известно, что состав, а, следовательно и свойства МВ заметно изменяются в зависимости от условий их образования. То есть, искусственно полученные МВ отличаются от МВ, образующихся естественным путем.
Мы оценивали влияние всей популяции МВ, присутствующей в крови в ее естественных пропорциях, т.е. образованной без дополнительной активации клеток. Для выявления их эффектов мы удаляли МВ путем фильтрации бестромбоцитарной плазмы (БТП) через фильтры с размерами пор 0,1мкм, соответствующими нижней границе конвенциональных размеров МВ [137]. Сходная методика применялась для исследования структуры и функций экзосом и МВ другими авторами [8]. В ходе контрольных подсчетов методом проточной цитометрии было обнаружено, что циркулирующие в крови МВ размером 0,1 мкм преобладают в популяции этих субклеточных образований, составляя 90%. До 97% МВ размером 0,1 мкм, удалявшиеся в ходе фильтрации, имели тромбоцитарное происхождение. То есть, применяемая нами методика позволила получить обедненную микровезикулами плазму (ОМП), которая и использовалась для функциональных анализов. Следует подчеркнуть, что обнаруженные в дальнейшем особенности кинетики формирования и свойств сгустка не обусловлены изменением уровня фибриногена и его производных, поскольку фильтрация плазмы не сопровождалась достоверными изменениями содержания коагулируемого фибриногена. Известно также, что фильтрация через нанофильтры с размером пор 0,075мкм не приводит к изменением таких характеристик плазмы, как белковый профиль в целом, уровень факторов свертывающей системы в частности, а также липидный профиль, включающий уровни триглицеридов, холестерина, липопротеинов [105].