Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций ХАЙБУЛЛИНА СВЕТЛАНА ФРАНЦЕВНА

Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций
<
Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

ХАЙБУЛЛИНА СВЕТЛАНА ФРАНЦЕВНА. Молекулярные и клеточные механизмы патогенеза хантавирусных инфекций: диссертация ... доктора медицинских наук: 14.03.03 / ХАЙБУЛЛИНА СВЕТЛАНА ФРАНЦЕВНА;[Место защиты: Казанский государственный медицинский университет].- Казань, 2016.- 225 с.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Введение 6

1.1 Актуальность исследования 6

ГЛАВА 2. Обзор литературы 13

2.2. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) и хантавирусный легочный

синдром (ХЛС) 24

2.2.1. Эпидемиология хантавирусов 24

2.2.2. Серологическая прослойка населения проживающего в эндемичных районах 30

2.2.3. Вирус и структура вириона 31

2.2.4. Хантавирусы и их естественные хозяева 35

2.2.5. Инфицирование человека 39

2.2.6. Рекомбинация геномов хантавирусов 40

2.2.7. Клинические проявления хантавирусной инфекции 41

2.2.8. Патогенез ГЛПС и ХЛС 44

2.2.9. Иммунный ответ к хантавирусным антигенам

2.2.10. Генетические маркеры патогенеза хантавирусной инфекции 55

2.2.11. Роль цитокиов в патогенезе хантавирусой инфекции 56

2.2.12. Лечение хантавирусной инфекции и вакцинация 60

ГЛАВА 3. Mатериалы и методы 63

3.1. Клеточные линии и реагенты 63

3.2. Сыворотки крови человека 64

3.3. Вирус 64

3.4. Метод непрямого бляшкообразования 65

3.5. Выделение общей РНК 65

3.6. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ) 65

3.7. Синтез кДНК 67

3.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 68

3.9. Анализ ДНК-чипов

3.11. Иммунофлуоресцентный анализ 68

3.12. Иммуногистохимический анализ 70

3.13. Получение клеточной линии, экспрессирующей р78 71

3.14. Твёрдофазный иммуноферментный анализ (ИФА) 71

3.15. Анализ изменения электрофоретической подвижности (EMSA) 72

3.16. Мультиплексный анализ 73

3.17. Микоплазменный тест 74

3.18. Иммуноблотинг 3.20. Mодифицированный анализа белка по Лоури 75

3.21. Получение поликлональных антител к гликопротеину G2. 76

3.22. Получение реассортантных вирусов in vitro 76

3.23. Клональная селекция хантавирусов 77

3.24. Скрининг вирусных реассортантов 77

3.25. Анализ TUNEL 77

3.26. Статистический анализ 78

ГЛАВА 4. Результаты исследований 79

4.1. Получение и исследование реассортантов хантавирусов 79

4.1.1 Выявление реассортации у вирусов ANDV и SNV 79

4.1.2. Иммуногистохимический анализ реассортанта V1 82

4.1.3 Эффективность репликации реассортантов в клетках Vero E6 83

4.2. Исследование патогенеза хантавирусной инфекции in vitro 84

4.2.1 Влияние ФНО- на накопление нуклеокапсидного белка SNV в культуре клеток Vero E6 84

4.2.3 Определение влияния ФНО- на проницаемость монослоя HUVEC 91

4.2.4 Инфицирование альвеолярных макрофагов человека вирусом SNV 92

4.2.5 Синтез ФНО- инфицированными SNV и обработанными ЛПС альвеолярными макрофагами человека 94

4.2.6 Эффект надосадочной жидкости, взятой от инфицированных SNV и обработанных ЛПС альвеолярных макрофагов, на проницаемость монослоя клеток HUEVEC 95

4.2.7 Регуляция экспрессии клеточных генов в эндотелиальных клетках вирусами SNV и PHV 98

4.2.8 Следующие группы генов изменялись под действием хантавирусной инфекции 105

4.2.9 Анализ TaqMan экспрессии отдельных генов

4.2.10 Влияние репликации вирусов на внутриклеточный уровень мРНК гена CCL5 110

4.2.11 Вирус AND стимулирует экспрессию индуцируемого интерфероном белка MxA в клетках эндотелия 112

4.2.12 Эффективность репликации хантавирусов в клетках Vero E6, A549 и HUVEC 112

4.2.13 Влияние хантавирусной инфекции на транскрипцию гена MxA 114

4.2.14 Влияние репликации вирусов на экспрессию гена р78 115

4.2.15 Влияние репликации ANDV на транслокацию IRF-3 в ядро клетки 118

4.2.16 Влияние хантавирусной инфекции на внутриклеточные уровни белка р78 118

4.2.17 Влияние экспрессии р78 на репликацию ANDV в клетках Vero E6 120

4.2.18 Внутриклеточная локализация белка р78 в ANDV инфицированных клетках HUVEC 122

4.2.19 Влияние хантавирусной инфекции на активацию факторов ядерной транскрипции PML, SP100 и ISG-20 в клетках HUVEC in vitro

4.2.21 Колокализация PML с SP100 и его частичная колокализация с DAXX в инфицированных хантавирусом клетках HUVEС 126

4.2.22 PML тесно связан с ISG-20 в инфицированных хантавирусом клетках HUVEC

4.2.24 Активация PML требует экспрессии хантавирусного белка 133

4.2.25 PML и SUMO имеют различную локализацию в инфицированных хантавирусом клетках HUVEC 135

4.2.26 Изучение цитокинового профиля сывороток больных ГЛПС 137

4.3.1. Анализ механизмов низкой эффективности препарата рибавирина при хантавирусной инфекции 142

4.3.1. Неэффективность рибавирина в ингибировании выделения ФНО-, вызванного активацией

RANTES и интерлейкина-6 в инфицированных вирусом АND эндотелиальных клетках

пупочного канатика человека 142

4.3.2 Препарат Рибавирин подавляет транскрипцию гена CCL5 в клетках HUVEC, инфицированных вирусом ANDV 144

4.3.3 Эффект различных концентраций препарата Рибавирин на накопление S-сегмента мРНК вируса ANDV и CCL5 в клетках HUVEC 146

4.3.4 Влияние ФНO- и препарата Рибавирин на активацию NF-B 152

ГЛАВА 5. Обсуждение 155

Заключение 175

Выводы 177

Список сокращений 179

Список литературы 182

Серологическая прослойка населения проживающего в эндемичных районах

Патогенез хантавирусных инфекций у человека остается в основном мало изученным. Это является основной причиной отсутствия эффективных препаратов для лечения и профилактики заболевания. Вирусы являются нецитопатичными, поэтому фармакологическое влияние на внутриклеточные процессы, активированные хантавирусной инфекцией, представляется наиболее логичным в подходе к лечению хантавирусной инфекции. Однако именно эта область знаний оставалась наименее изученной. Поэтому полученные данные о влиянии хантавирусной инфекции на внутриклеточные процессы является важным шагом в дальнейшей разработке препаратов для лечения и предупреждения инфекции. В этом разрезе, особенно интересными представляются полученные данные о чувствительности хантавирусной инфекции к активации интерферон индуцированных белков. Поэтому, данные об эффективности ингибирования хантавирусной инфекции путем активации внутриклеточных интерферон-индуцированных механизмов выявили новый подход к лечению хантавирусной инфекции. Также впервые показаны механизмы активации интерферон-индуцированных белков в клетках, инфицированных хантавирусом. Таким образом, был выявлен круг белков — потенциальных мишеней для терапевтического вмешательства. Далее, нужно отметить, что получены данные, подтверждающие гипотезу о роли активации цитокинов у больных ГЛПС. Показано, что тяжесть заболевания определяется активацией ИЛ-12 и ИФН. Более того, активация этих цитокинов приводит к развитию легкой формы болезни. Поэтому сделано заключение, что лекарственные вещества, способные активировать ИЛ-12 и ИФН в крови больных ГЛПС, могут обладать высокой терапевтической эффективностью при лечении этого заболевания. Таким образом, выявлены две потенциальные мишени для лечения хантавирусной инфекции, включающие интерферон-индуцируемые белки и цитокины ИЛ-12 и ИФН. Проведенные исследования впервые представили объяснение неэффективности препарата Рибавирин при лечении хантавирусной инфекции, что представляет важный вклад в разработку новых подходов к лечению ГЛПС. Важность полученных данных определяется и тем, что прежние представления о лечении хантавирусных инфекции противовирусными препаратами неприменимы к лечению хантавирусных инфекций. Показана важность купирования «цитокинового шторма», вызванного хантавирусной инфекцией, поскольку активация цитокинов определяет тяжесть заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Инфицирование эндотелиальных клеток человека вирусом Син Нобре (SNV) активирует транскрипционный фактор PML и приводит к образованию нуклеарных телец внутри клеточного ядра. 2. Активация интерферон зависимого белка MxA (р78) ингибирует хантавирусную репликацию и определяет эффективность репликации хантавирусов в культуре клеток. 3. Препарат Рибавирин подавляет хантавирусную репликацию, но не ингибирует активацию цитокинов, вызванную ФНО-. 4. Патогенные хантавирусы Андес (AND) и Син Нобре (SNV), циркулирующие в различных подвидах мелких грызунов, образуют реассортанты in vitro, способные к репликации в клетках Vero E6.

Связь работы с базовыми научными программами

Представленная работа была поддержана грантом Национального Института Здоровья (NIH) за номером AI36418, AI39808, AI45059и AI65359, а также офисом The Medical Service and Research Service of the Veteran Affairs Sierra Nevada Health Care System. Кроме того, исследования были финансированы Российским Министерством Науки и образования ФСП №14.А18.21.1930, ФСП №16.552.11.7083. Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров (5-ТОП-100).

Материалы диссертации представлены на ежегодных естественно-научных конференциях Университета Штата Невада (г. Рено, Лейк Тахо, США, 1998 г. и 2006 г.). Кроме того, результаты представлены на IV Международной конференции по геморрагической лихорадке с почечным синдромом и хантавирусному легочному синдрому (г. Атланта, США, 1998 г.), V Международной конференции по геморрагической лихорадке с почечным синдромом и хантавирусному легочному синдрому (г. Аннси, Франция, 2001 г.), VI Международной конференции по геморрагической лихорадке с почечным синдромом и хантавирусному легочному синдрому и хантавирусам (г. Сеул, Корея, 2004 г.), VII Международной конференции по ГЛПС, ХЛС и хантавирусам (г. Буэнос Аэрес, Аргентина, 2007 г.). Также результаты были представлены на 22-м ежегодном собрании Американского общества Вирусологов (г. Давис, США, 2003 г.), и на собрании Американского общества Микробиологов: Viral Immune Evasion (г. Акапулько, Мексика, 2005 г.). Кроме того, результаты исследований были доложены на VI Ежегодном Международном симпозиуме «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий» (г. Казань, Россия, 2013 г.), на IV Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (г. Казань, Россия, 2014 г.), на XII Межгосударственной научно-практической конференции «Вклад государств-участников Содружества Независимых Государств в обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения в современных условиях» (г. Саратов, Россия, 2014 г.); на V Международной конференции «New concepts on the mechanisms of inflammation, autoimmunity and tumorogenesis» (г. Казань, Россия, 2015 г.), на 19-й Международной конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (г. Пущино, Россия, 2015 г.).

Метод непрямого бляшкообразования

Хантавирусы принадлежат семейству Bunyaviridae, роду Хантавирусов. В природе хантавирусы циркулируют среди мелких грызунов. Хорошо известно, что географическое распределение и эпидемиология хантавирусов в целом отражают распределение и естественное развитие их первичных носителей-грызунов (таблица 1). У своих естественных хозяев-грызунов, хантавирусы вызывают бессимптомную инфекцию, тогда как инфекция у человека может вызывать острое тяжёлое заболевание. Считается, что человек заражается при вдыхании аэрозоля контаминированного вирусом. Общепринятым считается мнение, что человек может заразиться после прямого контакта с инфицированными грызунами или их выделениями, однако существует доказанный случай передачи ANDV от человека к человеку (P.J. Padula et al., 1998) (C. Martinez-Valdebenito et al., 2014). Несмотря на существование дополнительных сведений, указывающих на возможность передачи ANDV от человека к человеку, случай, указанный выше, является единственным подтверждённым горизонтального распространения хантавирусной инфекции у человека. В Старом Свете существует два основных региона, где регистрируется большая часть случаев хантавирусной инфекции: (1) Европа (включая европейскую часть России) и (2) Восточная Азия (Китай, Корея и дальневосточные регионы России). В Китае ежегодно регистрируется до 100 000 случаев ГЛПС (Y.Z. Zhang et al., 2010) и примерно 900 случаев регистрируется в Корее и на Дальнем Востоке России (2008. South Korean Centers for Disease Control and Prevention, Seoul, South Korea.; (Y.Z. Zhang, et al., 2010). В Европе, большая часть случаев ГЛПС диагностирована в России (3000 случаев), Финляндии (3000 случаев), Швеции (2000 случаев) и менее 100 лучаев приходится на другие европейские страны (G.E. Olsson et al., 2009; E.A. Tkachenko et al., 2013). В России, территория между Волгой и Уралом является наиболее напряженным зоонозным очагом ГЛПС. Самые высокие показатели заболеваемости зарегистрированы в республиках Татарстан, Башкортостан, Удмуртии, Самарской и Оренбургской областях (S.B. Garanina, et al., 2009). Другими очагами неблагоприятной эпидемиологической ситуации являются территории на Дальнем Востоке (Приморский, Хабаровский края, Амурская область) и Западной Сибири (Омская, Тюменская, Новосибирская области). Кроме того, последние годы выявлены новые природные очаги в Центральном Федеральном округе (Тульская, Рязанская, Воронежская, Липецкая, Тамбовская, Орловская, Курская области), что привело к росту общей заболеваемости ГЛПС в России в 3 раза. В течение последнего десятилетия наблюдается снижение числа регистрируемых случаев на Дальнем Востоке, Урале и Сибири. В то же время, недавно был обнаружен уникальный природный очаг ГЛПС в субтропической зоне Краснодарского края на территории Большого Сочи (T.K. Dzagurova, et al., 2008)

Большая часть больных ГЛПС — это лица в возрасте от 20 до 50 лет (E. Pal et al., 2005).; (S.H. Lee et al., 2013) (R.G. Nurgaleeva et al., 1999). Обычно регистрируется более высокая доля заболевших среди мужчин по сравнению с женщинами (B. Niklasson et al., 1993); (S.H. Lee, et al., 2013).;(R.G. Nurgaleeva, et al., 1999). Большинство случаев заболевания ГЛПС происходит в сельской местности (S.H. Lee, et al., 2013).; (R.G. Nurgaleeva, et al., 1999). По этой причине ГЛПС является профессиональным заболеванием фермеров, лесных рабочих, пастухов, лесорубов, военных и т.д. (R.G. Nurgaleeva, et al., 1999). Несмотря на то, что сезонные пики случаев ГЛПС варьируют в зависимости от штамма хантавируса, они всегда совпадают с повышенной сельскохозяйственной активностью весной и осенью (P. Makary et al., 2010; R.G. Nurgaleeva, et al., 1999). Например, большинство случаев, вызванных вирусом Хантаан (HTNV) и Пуумала (PUUV), возникают осенью, тогда как большая часть случаев ГЛПС, вызванной вирусом Добрава (DOBV), регистрируется поздней весной и летом (R.G. Nurgaleeva, et al., 1999); (F. Cui et al., 2013; I. Kuzman et al., 2003). Единичные случаи хантавирусной инфекции регистрируются ежегодно, однако крупные эпидемические вспышки, вызванные PUUV, выявляются каждые 3–4 года (D.H. Kruger et al., 2013; B. Niklasson, et al., 1993; O. Vapalahti et al., 2003). Эпидемические вспышки обычно связаны с увеличенным размером и изменениями в структуре популяций рыжих полёвок (Clethryonomis glariolus), основного резервуара PUUV среди грызунов (B. Niklasson, et al., 1993; O. Vapalahti, et al., 2003). Летальность ГЛПС варьирует от 0,1% до 10% в зависимости от вируса, вызвавшего заболевание (таблица 1).

Изменения в популяции грызунов способны влиять на масштаб эпидемических вспышек хантавирусной инфекции у людей. Например, продемонстрировано, что каждые 2–3 года рыжие полёвки дают два выводка за один сезон. Грызуны из первого выводка, родившиеся ранней весной или поздней зимой, претерпевают быстрое развитие и обретают способность к оплодотворению в тот же год (A.D. Bernshtein et al., 1999). Животные из второго выводка, родившиеся поздней весной или в середине лета, становятся способными к оплодотворению на следующий год. Было показано что, процент животных положительных на наличие вирусного антигена и антител к вирусным белкам выше среди первого выводка по сравнению со вторым (48% против 8%) (A.D. Bernshtein, et al., 1999). По этой причине был сделан вывод, что животные из первого поколения могут быть основным резервуаром хантавируса среди рыжих полёвок. Это поколение способно поддерживать персистирующую инфекциию и служит резервуаром вируса в промежутках от одного зоонозного цикла до следующего. Дополнительным подтверждением того, что года когда рыжие полёвки приносят два выводка за один сезон являются важными в поддержании хантавирусной персистенции и распространении вируса является то, что крупные эпидемические вспышки хантавирусной инфекции среди людей совпадают имено с этими годами (A.D. Bernshtein, et al., 1999; А.Н.С. Бернштейн А.Д., Копылова Л.Ф., 1987)

Вирус Сеул (SEOV) является единственным хантавирусом, циркулирующим среди домашних крыс (Rattus norvegicus и Rattus rattus) и вызывает заболевание у человека в городских условиях (H.W. Lee, et al., 1982); (K. Sugiyama et al., 1987). Большая часть вызванных SEOV случаев ГЛПС происходит весной и ранним летом, а летальность составляет 1–5% (K.H. Yoo et al., 1994).

В 1993 году, новый штамм хантавирусов был идентифицирован при изучении вспышки пневмонии неизвестной этиологии в США. Штамм вируса был в последствие назван Син Номбре (SNV), стал новым членом рода хантавирусов, вызывающих хантавирусный легочный синдром (ХЛС). Это открытие положило начало дальнейшим исследованиям, приведшим к идентификации множества других вирусов, вызывающих подобное заболевание, включая вирусы Мононгахела, Нью-Йорк, вирус Блэк Крик канала, вирус Байоу, вирус Aндес (ANDV), Оран, Лечигуанос, Hu39694 и множество других. Подсемейство грызунов Нового Света, Sigmodontinae, является естественным резервуаром для этих вирусов (A.M. Johnson, et al., 1997). Хотя ХЛС диагностируется на всей территории США, большинство случаев этого заболевания регистрируется в западных штатах и вызывается вирусом SNV. В настоящее время ХЛС также диагностируется в нескольких странах Южной Америки, включая Аргентину, Бразилию, Чили, Боливию, Парагвай и Уругвай. ХЛС характеризуется высокой летальностью (40–50%) (A.S. Khan et al., 1996; S. Levis et al., 1997)

Иммуногистохимический анализ реассортанта V1

Концентрация каждого аналита была рассчитана на основании стандартной кривой с помощью программного обеспечения Bio-Plex Manager software. На основании стандартных кривых бала подтверждена линейность тест-системы (валидация теста), после чего полученные экспериментальные значения были подставлены в стандартную кривую и получены абсолютные значения концентрации белков в исследуемых биологических образцах.

Клетки (104 - 105 клеток) собирали в лизирующий буфер и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 3 минут при 40С. Супернатант удаляли и осадок ресуспендировали в 50 мкл буфера для лизиса и инкубировали при 370С в течение 15 минут. Затем образцы нагревали до 950С в течение 10 мин для инактивации протеаз. После центрифугирования 3000 об/мин в течение 5 минут при 40С, супернатант собирали в новую пробирку. Супернатант содержал клеточную ДНК, которую использовали для ПЦР анализа на наличие микоплазменной ДНК.

ПЦР реакция проводилась с использованием реактивов, приложенных к набору. Для этого, вначале приготавливали реакционную смесь, содержащую универсальные праймеры, способные определять до 60 различных штаммов микоплазм, включая наиболее распространенные штаммы M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M.hyorhinis, M. orale, M. pirum, M. salivarium, and A. Laidlawii. К ПЦР смеси (20 мкл) добавляли 2,5 мкл универсальных праймеров, доводя общий объем реакционной смеси до 22,5 мкл. Набор также содержал положительные и отрицательные контроли. Каждая реакция проводилась в дубликатах. Начальная денатурация 940С в течение 1,5 мин; Параметры ПЦР: 20 циклов ПЦР включали денатурацию 940С, 30 сек, отжиг 60,50 30 сек и элонгацию 720 45 сек. В течении ПЦР, температура отжига постепенно снижалась на 0,50 С за цикл (например, 700С в течение 1 цикла, затем 69,50С в течение 2 цикла, и т.д., до 60,50С). Заключительный цикл включал элонгацию при 720С в течение 4 мин с последующим хранением при 40.

Один миллилитр модифицированного по Лоури реагента добавляли в каждую пробирку содержащую образец. Все хорошо перемешивалось и инкубировалось при комнатной температуре в течение 10 мин. В конце 10-минутной инкубации, в каждую пробирку добавлялась 100 мкл приготовленного 1х Folin-Ciocalteu реагента. Смесь перемешивалась и инкубировалась при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем оптическая плотность образцов определялась с помощью спектрофотометрии при длине волны 750 нм. За негативный контроль принимался раствор, в котором собирались образцы. Затем значения негативного контроля вычитались из значений оптической плотности испытуемого образца. Все эксперименты проводились 3 раза. Для определения белковой концентрации данные оптической плотности образца сравнивали со значениями стандартной кривой, предварительно построенной с использованием белка BSA в качестве стандарта.

Анти-пептидные антитела получали к пептидам, синтезированным на основе аминокислотных последовательностей гликопротеина G2 хантавирусов ANDV (штамм 23), вируса SNV (штамм CC107). Участок гликопротеина G2 SNV, расположенный на C-конце (aa 480-489; CPVRNRKNKAN), и участок гликопротеина G2 ANDV, расположенный на C-конце (aa 480-488; CPRRGHKKTV), синтезировали с помощью Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer. Очищенные с применением ВЭЖХ пептиды ковалентно сшивали с белком-переносчиком гемоцианин лимфы улитки (KLH) через N-концевой цистеин пептида для формирования пептид-белковых конъюгатов. Смесь пептидов ANDV или SNV с полным адъювантом Фрейнда использовали для иммунизации кроликов. Сыворотку собирали через 2 месяца после первой иммунизации. Специфические антитела к гликопротеину G2 ANDV и SNV очищали с применением аффинной хроматографии на колонке SulfoLink Kit (Pierce), коньюгированной с соответствующими пептидами. Специфичность генерируемых анти-G2 антител определялась с помощью ИФА и иммуноблотинга.

Монослой клеток Vero E6 инфицировали смесью вирусов ANDV и SNV при MOI 1. Через 1 час инкубации (370C, 5% CO2) вирусный инокулят удаляли, клетки дважды промывали раствором Хэнкса и добавляли свежую культуральную среду. Культивирование инфицированных Vero E6 продолжалось 14 дней. Вирусный сток состоял из культуральной среды и соскоба клеточного монослоя. Собранный материал подвергался 2-х кратному циклу заморозки и разморозки для выделения внутриклеточного вируса. После этого клеточный дебрис удалялся путем центрифугирования в течение 1 часа при 40С и 30,000 об/мин. 3.23. Клональная селекция хантавирусов

Монослой клеток Vero E6 инфицировался 500 мкл исследуемого вирусного сбора (разведение 10–4) и инкубировался в течение 1 часа (370C, 5% CO2). После инкубации вирусный инокулят удалялся, клетки дважды промывались раствором Хэнкса и покрывались средой, содержащей агарозу (DMEM, 2% FBS, 0,6% агароза). Через 12 дней, 500 мкл нейрального красного (1:1000) добавляли поверх агарозной среды, инкубирование продолжалось в течение последующих 24-х часов (370C, 5% CO2). При этом инфицированные клетки аккумулировали нейтральный красный краситель, что позволяло определять инфицированные клетки по красному окрашиванию. Вирусные бляшки собирали и индивидуально переносили на свежий монослой клеток Vero E6 в 24-луночном планшете, где инкубирование продолжалось в течение еще 10 дней (370C, 5% CO2). По окончании инкубации, инфицированные клетки и культуральная жидкость собирали и хранили при –800C. Аликвоты собранного материала использовали для выделения общей РНК с использованием реагента Trizol согласно рекомендациям производителя (Invitrogen).

Для скрининга потенциальных вирусных реассортантов проводили два цикла вирусной селекции. После первого цикла селекции, вирусные клоны анализировали на присутствие РНК, кодирующей S, M и L сегменты вирусов SNV и ANDV с использованием смеси специфических праймеров и проб по технологии ПЦР-РВ. Общая РНК из клеток Vero E6, инфицированных хантавирусами SNV или ANDV, использовалась в качестве положительного контроля. Для реакций ПЦР-РВ нами были использованы наборы Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step System (Promega). Реакции ПЦР-РВ проводились на ABI Prism 7000 Sequence Detection System. Рекомбинанты, удовлетворявшие Ct-критерию для SNV и ANDV, отбирались для селекции во втором цикле селекции. Для этого общая РНК из отобранных образцов анализировалась на наличие S-, M- и L-сегментов SNV и ANDV с использованием тех же праймеров и проб, использованных в первом цикле селекции.

Анализ TUNEL выполнялся с применением набора in situ Cell Death-POD kit (Roche) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки HUVEC растили на стеклянных покровных стёклах в течение двух дней, фиксировали в 4% параформальдегиде и обрабатывали 3% перекисью водорода в течение 10 минут при комнатной температуре для блокирования эндогенных пероксидаз. Проницаемость мембраны фиксированных клеток увеличивали путем инкубации с Triton-X100 (0,1% 2 мин на льду). После этого, монослой HUVEC инкубировали с метящим реагентом в течение часа 370C), после чего монослой инкубировали в AEC субстрате (DAKO Laboratories). Апоптозные клетки визуализировали с помощью световой микроскопии на микроскопе Nikon Optiphot-2. Для расчёта числа апоптозных клеток фотографировали через 20 объектив шесть случайных полей зрения. Изображения распечатывали и считали число апоптозных клеток.

Статистический анализ выполнялся с помощью t-критерия Стьюдента для сравнений между индивидуальными экспериментальными группами (инфицированные и неинфицированные). Статистическую значимость устанавливали на p 0,05. Данные представляли как среднее значение ± стандартное отклонение.

Эффект надосадочной жидкости, взятой от инфицированных SNV и обработанных ЛПС альвеолярных макрофагов, на проницаемость монослоя клеток HUEVEC

Клетки HUVEC инфицировались сохранившим инфекционность и облучённым гамма-излучением инактивированным штаммом 23 ANDV. Общая РНК собиралась через 3, 24 и 72 часа после инфицирования. Анализ ПЦР-РВ выполняли с помощью проб на устройстве ABI Prism 7000 Sequence Detection System.

A — внутриклеточные уровни S-сегмента ANDV в клетках HUVEC, инфицированных сохранившим инфекционность и облучённым гамма-излучением инактивированным ANDV.

Значения S-сегмента РНК ANDV корректировались относительно значений гена 18S в соответствующем образце. B — внутриклеточные уровни гена р78 в клетках HUVEC, инфицированных сохранившим инфекционность и облучённым гамма-излучением инактивированным ANDV. Значения гена р78 корректировались относительно значений гена 18S в соответствующих образцах. Скорректированные значения затем выражались как относительные значения для того же гена, экспрессированного в контрольной неинфицированной группе.

Транскрипция гена р78 регулируется интерферон-регулирующим фактором 3 (IRF-3), который в свою очередь активируется интерфероном (1999, J Interferon Cytokine Res 19:1–13.). В норме, IRF-3 является белком цитоплазмы. Однако, при активации, IRF-3 образует фосфорилируется и перемещается в ядро клетки и инициирует транскрипцию. Поэтому нами было принято решение изучить, влияние хантавирусной инфекции на внутриклеточную локализацию IRF-3, где обнаружение IRF-3 в ядре инфицированных клеток являлось бы доказательством активации этого транскрипционного фактора. Монослои клеток HUVEC фиксировались через 48 часов после инфицирования вирусом ANDV и инкубировались с анти-IRF-3 антителами (Рисунок 26, А-В). Неинфицированные монослои клеток HUVEC использовали в качестве контрольных. В неинфицированных клетках HUVEC (Рисунок 26, А) локализация IRF-3 ограничивалась цитоплазмой. Однако через 48 часов после инфицирования IRF-3 перемещался в ядра клеток HUVEC, инфицированных ANDV.

Монослои клеток HUVEC инфицировались ANDV с MOI 1. Инфицированные и неинфицированные монослои фиксировались (3:1 метанол:ацетон) и использовались для определения внутриклеточной локализации IRF-3 с помощью анти-IRF-3 моноклональных антител (1:200; Santa Cruz). A — неинфицированный монослой клеток HUVEC; Б — монослой клеток HUVEC, инфицированный ANDV, спустя 24 часа после инфицирования;

Клеточные белки HUVEC и A549 собирались в определённые моменты времени после инфицирования (24, 48 и 72 часа после инфицирования) и использовались для анализа внутриклеточных уровней белка р78 с помощью метода вестерн блота.

Инутриклеточный уровень белка р78 оставался неизменным в контрольных клетках HUVEC на протяении всего эксперимента (Рисунок 27 А). Однако повышенние внутриклеточного уровня белка р78 обнаруживалось в клетках HUVEC к 24 часам после инфицирования. Уровни р78 белка продолжали увеличиваться с прогрессированием инфекции. Отличная картина экспрессии р78 обнаруживалась в клетках A549, инфицированных ANDV (Рисунок 27 Б). В клетках A549 не наблюдалось изменений экспрессии белка р78, в сравнении с неинфицированными клетками A549, в любой момент времени после инфицирования.

Клетки HUVEC и A549 инфицировались штаммом 23 ANDV с MOI 1. Общий белок собирался через 24, 48 и 72 часа после инфицирования и анализировались с помощью метода вестерн-блот. Белок р78 выявляли при помощи инкубации с кроличьими поликлональными антителами к белку р78 (1:50). Комплексы антиген-антитело идентифицировались козьими противокроличьими HRP-конъюгированными антителами. А. Экспрессия белкар78 в инфицированных ANDV клетках HUVEC. M-маркёр 1, 3 и 5 — неинфицированные контрольные клетки HUVEC (24, 48 и 72 часа, соответственно). 2, 4 и 6 — клетки HUVEC, инфицированные вирусом ANDV клетки ( 24, 48 и 72 часа, соответственно). Б. Экспрессия белка р78 в клетках A549, инфицированных ANDV. M-маркёр 1, 3, и 5 — неинфицированные клетки A549 (24, 48, и 72 96 часa после соответственно) 2, 4, и 6 — инфицированные вирусом ANDV клетки (24, 48, 72 и 96 часов после инфицирования соответственно) .С — положительный контроль, клетки HUVEC, обработанные ИФН- в течении 72 часов.

Монослои клеток VE6/р78 (клон 1) и VE6/GFP (клон 1) инфицировались вирусом ANDV с МОЇ 1. Общая РНК, общий белок и супернатант собирались в определённые моменты времени после инфицирования. Тотальная РНК использовалась для определение внутриклеточных уровней мРНК кодирующей р78 и S-сегмент вируса ANDV. Аккумуляция N-белка вируса ANDV и белка р78 определялась количественно с помощью вестерн-блота. Титры вируса устанавливались методом непрямого бляшкообразования.

Транскрипционная и трансляционная активация белка р78 была обнаружена в клетках Vero Е6, трансфицированных плазмидой pcDNA-HA-MxA(р78), (Рисунок 28, А и В соответственно). Конституциональная экспрессия белка р78 клетками Vero Е6 подавляла репликацию ANDV. Внутриклеточные уровни N-белка ANDV были ниже в р78-трансфицированных клетках Vero Е6 по сравнению с клетакми трансфицированными pEGFP-puro плазмидой (Рисунок 28, В). Аналогично, внутриклеточные уровни S-сегмента РНК ANDV были в 10 раз ниже в клетках Vero Е6, трансфицированных р78, по сравнению с клетками трансфицированными pEGFP-puro плазмидой (3,0х106 против 2,5х105). Клетки Vero Е6, трансфицированные pEGFP-puro плазмидой, поддерживали репликацию ANDV, где вирусные титры достигали 2x10 на 6-й день после инфицирования. Однако в клетках VE6/р78 репликация ANDV подавлялась, что проявлялось в снижении вирусного титра до ЗхЮ3 на 6-й день после инфицирования.