Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Молекулярные механизмы дисрегуляции рецептор- и цитокин-опосредованной активации Т-лимфоцитов при туберкулезе легких Есимова Ирина Евгеньевна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Есимова Ирина Евгеньевна. Молекулярные механизмы дисрегуляции рецептор- и цитокин-опосредованной активации Т-лимфоцитов при туберкулезе легких: диссертация ... доктора Медицинских наук: 14.03.03 / Есимова Ирина Евгеньевна;[Место защиты: ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2018

Введение к работе

Актуальность темы исследования. В настоящее время не вызывает
сомнений, что патогенез туберкулезной инфекции обусловлен, с одной стороны,
изменениями биологических свойств возбудителя инфекции и увеличением доли
штаммов Mycobacterium tuberculosis, обладающих устойчивостью к средствам
этиотропной терапии, с другой стороны – нарушениями в иммунной системе хозяина
[Железникова Г.Ф., 2006; Воронкова О.В. и соавт., 2007; Тюлькова Т.Е. и соавт.,
2008; Ахматова Н.К., Киселевский М.В., 2012; Горлова Е.Е., 2010; Павлов В.А. и
соавт., 2011, Розов С.М. и соавт., 2016; Coll F. et al. 2018; Stutz M.D. et al. 2018].
Дисрегуляция механизмов иммунологической резистентности рассматривается как
один из ведущих факторов, предрасполагающих к возникновению, клинической
манифестации и прогрессированию туберкулезной инфекции. Исследования в
области изучения молекулярных основ вторичной иммунологической

недостаточности при туберкулезе легких (ТЛ) являются перспективными не только для понимания того, почему и как развивается болезнь, но и важными для разработки новых подходов к оптимизации лечения, направленных на повышение эффективности реакций противотуберкулезной защиты.

Туберкулез, ввиду паразитирования микобактерий внутри клеток

инфицированного организма, характеризуется, прежде всего, нарушениями
клеточно-опосредованного иммунитета, регуляторными и эффекторными клетками
которого являются Т-лимфоциты [Новицкий В.В. и соавт., 2006; Скрягина Е.М.,
2008; Воронкова О.В. и соавт., 2010; Чернушенко Е.Ф. и соавт., 2010; Чурина Е.Г. и
соавт., 2011; Новицкий В.В. и соавт., 2012; Elliott T.O. et al., 2015]. На данный
момент выделяют два главных пути активации T-лимфоцитов при их
взаимодействии с антигенпрезентирующими клетками (APC). Первый – рецептор-
опосредованный – реализуется при контактном взаимодействии Т-лимфоцита с АРС
для передачи антигенной специфики Т-лимфоциту через Т-клеточный рецептор для
распознавания антигена (CD3-TCR) при участии молекул костимуляции. Развитие
второго пути опосредуется цитокинами АРС при взаимодействии с

комплементарными им рецепторами на мембране Т-лимфоцита [Ивашкин В.Т., 2008; Ярилин А.А., 2010; Zuiga J. et al., 2012]. Оба пути активации Т-лимфоцитов приводят к поляризации дифференцировки «наивных» Т-лимфоцитов-хелперов (Th0) в Т-лимфоциты-хелперы типа 1 (Th1) и являются обязательными для формирования полноценного иммунного ответа на возбудитель инфекции.

Результирующим этапом рецептор-опосредованной активации Th1-

лимфоцитов являются синтез и секреция интерлейкина (IL) 2 – фактора роста для
всех субпопуляций Т-лимфоцитов, обеспечивающего их клональную пролиферацию
в ответ на антиген [Ивашкин В.Т., 2008; Ярилин А.А., 2010; Commins S.P. et al.,
2010]. Итогом цитокин-зависимой активации становится способность

активированных Th1-лимфоцитов синтезировать интерферон (IFN) , основными биологическими функциями которого являются активация эффекторных Т-

лимфоцитов и клеток врожденного иммунитета, осуществляющих деструкцию антигена (моноцитов/макрофагов, гранулоцитов, натуральных киллеров, или NK-клеток), стимуляция экспрессии молекул гистосовместимости класса II на АРС [Абатуров А.Е., 2007; Костанян И.А. и соавт., 2010; Ярилин А.А., 2010; Maher S.G. et al., 2010; Commins S.P. et al., 2010].

Учитывая ключевую роль секреции IL-2 и IFN для контроля над туберкулезной инфекцией, ее недостаточность или избыток может быть причиной неэффективности иммунного ответа на M. tuberculosis.

В работах, посвященных изучению in vitro секреции IL-2 при туберкулезе,
часто отмечается ее дефицит из-за уменьшения количества и дисфункции (гипо- и
анергии) Т-клеток [Кошкина А.А., 2012; Воронкова О.В. и соавт., 2010; Новицкий
В.В. и соавт., 2009; 2011; Уразова О.И. и соавт., 2010; Черенько С.А., Матвеева С.Л.,
2011]. Однако не до конца ясны механизмы, лежащие в их основе. Не исключено, что
причиной недостаточности IL-2 при туберкулезе могут быть нарушения рецептор-
опосредованной (контактной) активации Т-лимфоцитов [Ивашкин В.Т., 2008;
Ярилин А.А., 2010; Dustin M.L., Groves J.T., 2012; Dustin M.L., 2014], в том числе
дефицит молекул костимуляции – CD28 на Т-лимфоцитах и СD80/СD86 на APC,
обеспечивающих «усиление» специфического (антигенного) сигнала активации Т-
клеток через CD3-TCR [Bromley S.K. et al. 2001; Ивашкин В.Т., 2008; Ярилин А.А.,
2010]. Блок костимуляции приводит к апоптозу Т-лимфоцитов. При этом показано,
что инактивировать сигналы костимуляции и, напротив, запускать программу Т-
клеточной гибели могут молекулы, экспрессируемые клетками с
иммуносупрессорной функцией, к примеру, цитотоксический Т-лимфоцитарный
антиген 4 (CTLA4) на поверхности регуляторных Т-клеток (Treg) [Ярилин А.А.,
2010; Chen L., Flies D.B., 2013; Gardner D. et al. 2014]. Другим фактором нарушений
рецептор-опосредованной индукции Т-лимфоцитов, их анергии и гипосекреции IL-2
может быть несостоятельность или дефицит механизмов сигнальной трансдукции и
ядерных факторов NF-kB, AP-1, NFAT, участвующих в транскрипции гена IL2
[Macian F., 2005; Ивашкин В.Т., 2008; Ярилин А.А., 2010].

Что касается IFN, то результаты исследований, посвященных анализу его концентрации в крови и продукции in vitro у больных туберкулезом, носят противоречивый характер. В одних случаях авторы указывают на их увеличение [Новицкий В.В. и соавт., 2008; Воронкова и соавт., 2010; Уразова О.И. и соавт., 2010; 2011; Черенько С.А., Матвеева С.Л., 2011; Писаренко М.С., 2013], в других – на снижение в связи с угнетением Т-клеточного звена иммунной системы [Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2004; 2012; Мезенцева М.В. и соавт., 2011; Черенько С.А., Матвеева С.Л., 2011]. Вопрос о том, чем обусловлена такая разница в описании результатов, и какие молекулярные механизмы лежат в основе нарушений интерферонопродукции при туберкулезе, остается открытым.

Известно, что основными цитокинами АРС, опосредующими активацию Т-лимфоцитов в индуктивную фазу Th1-зависимого иммунного ответа, секрецию и рецепцию IFN, являются интерлейкины 12 и 27 [Симбирцев А.С., 2004; Watford W.T. et al. 2004; Pompei L. et al. 2007; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Pot C. et al. 2010]. Их влияние определяется экспрессией на Т-клетках рецепторных

молекул, состоящих из конститутивных и индуцибельных (синтезируемых в ответ на активацию) субъединиц. При этом синтез и экспрессия индуцибельных рецепторов к одним цитокинам может зависеть от синтеза и секреции других цитокинов. Так, экспрессия индуцибельной 2-субъединицы рецептора к IL-12 (IL-12R2) на Т-лимфоцитах активируется IL-27 через WSX1/gp130-рецепторный комплекс к цитокину [Hunter C.A., 2005; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Silver J.S., Hunter C.A., 2010; Hunter C.A., Kastelein R., 2012].

Поскольку взаимодействие цитокинов с комплементарными им рецепторами на поверхности Т-лимфоцитов приводит к запуску сигнальных JAK-STAT-путей, основными компонентами которых, применительно к Th1-иммунному ответу, являются тирозиновые янус-киназы JAK1, JAK2, TYK2 и транскрипционные факторы STAT1, STAT4 и T-bet [Минеев В.Н. и соавт., 2010; Kaushal M., Chorawala N.M., 2012], очевидно, что их дефицит может быть причиной нарушений активации Т-лимфоцитов и секреции IFN.

Несмотря на то, что алгоритмы рецепторной и цитокин-опосредованной
активации Т-лимфоцитов в общем известны, сведения о молекулярных механизмах
дисрегуляции иммунного ответа на различных этапах межклеточных

взаимодействий при туберкулезе носят фрагментарный и разнородный характер.

Степень разработанности темы исследования. Учитывая существенную роль нарушений Т-клеточного звена в иммунопатогенезе туберкулеза, большое внимание уделяется раскрытию механизмов супрессии противотуберкулезного иммунитета, активации различных типов программируемой гибели Т-клеток, нарушению их пролиферативной и цитокинсекреторной активности, а также поиску путей иммунокоррекции указанных нарушений.

В работах, направленных на изучение дисрегуляционной патологии
иммунитета, представлен широкий спектр нарушений функций клеток

макрофагального звена, в частности, показано снижение их фагоцитарной, антигенпрезентирующей и секреторной активности [Сахно Л.В. и соавт., 2008; 2009; Сорняков С.Н. и соавт., 2012; Сахно Л.В., Черных Е.Р., 2012; Хаитова З.К. и соавт., 2012; 2013; Romagnoli A. et al. 2012; Ottenhoff T.H., 2012]. Установлены нарушения процессов созревания и генерации APC при туберкулезе, приводящие к формированию толерогенных клеточных клонов макрофагов и дендритных клеток (DC), обладающих иммуносупрессорной активностью в отношении CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов [Сахно Л.В. и соавт., 2010; Тихонова М.А. и соавт., 2012; Сахно Л.В., Черных Е.Р., 2012; Теплова Н.В., 2012; Тыринова Т.В. и соавт., 2012; Хаитова З.К., 2013; Siddiqui K.F. et al., 2014; Kim H. et al., 2017]. In vitro «перепрограммирование» DC с помощью цитокинов и антигенов является перспективным направлением в терапии туберкулезной инфекции.

Важным аспектом исследований механизмов супрессии и апоптоза Т-лимфоцитов при ТЛ является изучение субпопуляций Treg [Железникова Г.Ф., 2011; Новицкий и соавт., 2012; Чурина Е.Г. и соавт., 2011; 2012; 2013; Churina E.G. et al., 2012; Хаитова З.К., 2013; Arram E.O. et al., 2014; Daz A. et al., 2015; Parkash O. et al., 2015]. Treg-опосредованное угнетение антигензависимой дифференцировки и клональной пролиферации Т-лимфоцитов-хелперов может лежать в основе

формирования Т-клеточной анергии при туберкулезе. Установлены молекулярно-клеточные механизмы, с помощью которых Treg и другие регуляторные Т-клетки реализуют свои иммуносупрессорные свойства: контактная супрессия при участии молекул CTLA4/B7, LAG3, гранзимов и др., супрессия посредством локальной секреции ингибиторных цитокинов (трансформирующего фактора роста (TGF) , IL-10, IL-35), супрессия за счет конкурентного связывания факторов роста [Onishi Y. et al., 2008; Mandapathil M. et al., 2010; Sakaguchi S. et al., 2010; Железникова Г.Ф., 2011; Chaturvedi V. et al., 2011; Munn D.H., 2011; Sakaguchi S., 2011; Trinath J. et al., 2012; Feruglio S.L. et al., 2015; Розов С.М. и соавт., 2016]. Однако до сих пор не установлено, какие типы регуляторных Т-клеток играют ключевую роль в развитии стойкой Т-клеточной иммуносупрессии при туберкулезной инфекции, какие конкретные механизмы используются данными клетками для реализации своих супрессивных свойств и как это соотносится с различными клинико-патогенетическими вариантами ТЛ.

Предположение о связи генетически обусловленных изменений продукции
активирующих и супрессорных цитокинов с характером протекания иммунного
ответа, тяжестью и продолжительностью инфекционных заболеваний

способствовало активному поиску генов-кандидатов, определяющих

подверженность туберкулезу. Установлено, что подверженность туберкулёзной инфекции ассоциирована с полиморфизмами генов ряда цитокинов – IL1В, IL2, IL4, IL12, IFNG и TGFB [Наследникова И.О. и соавт., 2010; Никулина Е.Л. и соавт., 2010; Байке Е.Е. и соавт., 2015; Qrafli M. et al., 2017]. Результаты данных исследований актуальны для решения проблемы целесообразности избирательной стимуляции продукции цитокинов в случае, если организм генетически детерминирован на низкий уровень их образования и, напротив, мишень-ориентированной блокады передачи сигнала активации в цепочке «рецептор-ядро-ген» при гиперсекреции супрессорных цитокинов.

В то же время следует учитывать, что для направленной коррекции нарушений
противотуберкулезного иммунитета необходимо четкое понимание молекулярных
механизмов его реализации и факторов, ей препятствующих. Однако, несмотря на
значительные успехи в области молекулярной иммунологии, патофизиологии
иммунитета и других смежных областях медико-биологической науки, молекулярно-
генетические механизмы, связанные с нарушениями инициации Th1-
ассоциированного иммунного ответа, в том числе на этапе рецепторной и цитокин-
зависимой активации Т-лимфоцитов при туберкулезной инфекции, сохраняются
практически неисследованными. Остается открытым вопрос о том, какие сигнальные
факторы инициируют или блокируют экспрессию генов антимикобактериальной
защиты и на каком этапе происходит разрушение кооперативных взаимодействий
между клетками иммунной системы – на уровне распознавания презентируемых АРС
антигенных детерминант, костимуляции, транскрипционных факторов, экспрессии
генов и кодируемых ими пептидов (цитокинов и их рецепторов)? Каковы
особенности этих нарушений при разных клинических формах болезни и связаны ли
они с биологическими характеристиками инфицирующего штамма возбудителя?

Цель исследования: установить общие закономерности и механизмы

нарушений CD3/CD28-рецепторной и IL-12/IL-27-цитокиновой активации Т-лимфоцитов при инфильтративном и диссеминированном туберкулезе легких.

Задачи исследования:

  1. Выявить нарушения рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов в ответ на индукцию CD3/CD28-антирецепторными антителами in vitro на клеточном (по экспрессии поверхностных кластеров дифференцировки (CD) 3 и 28, CTLA4) и внутриклеточном (по содержанию белков-регуляторов транскрипции NF-kB, NFAT, AP-1) этапах у больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-резистентным туберкулезом легких.

  2. Оценить клеточный этап цитокин-опосредованной активации Т-лимфоцитов in vitro по базальной и BCG-индуцированной секреции мононуклеарными лейкоцитами цитокинов семейства интерлейкина 12 (IL-12 (p70, p35, p40) и IL-27) и экспрессии комплементарных им рецепторов IL-12R2 (к IL-12) и WSX1/gp130 (к IL-27) у больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-резистентным туберкулезом легких.

  3. Оценить внутриклеточный этап цитокиновой активации IL-12/IL-27-индуцированных in vitro Т-лимфоцитов по содержанию тирозиновых киназ JAK 1 и 2, TYK2 и белков-регуляторов транскрипции STAT 1 и 4, T-bet в лимфоцитах крови у больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-резистентным туберкулезом легких.

  4. Охарактеризовать функциональный ответ Т-лимфоцитов in vitro на CD3/CD28-рецепторную (по количеству IL-2-позитивных клеток и секреции IL-2) и IL-12/IL-27-цитокиновую (по количеству IFN-позитивных клеток и секреции IFN) стимуляцию у больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-резистентным туберкулезом легких.

  5. Установить общие закономерности нарушений CD3/CD28-рецепторной и IL-12/IL-27-цитокиновой in vitro активации Т-лимфоцитов у больных туберкулезом легких и особенности их молекулярных механизмов в зависимости от клинической формы заболевания и лекарственной чувствительности возбудителя.

Научная новизна исследования. Впервые проведено многоуровневое
исследование нарушений отдельных этапов CD3/CD28- и IL-12/IL-27-

опосредованной активации Т-лимфоцитов при in vitro ее моделировании и дана их комплексная оценка при туберкулезе легких с учетом клинико-патогенетического варианта болезни.

Обосновано, что после CD3/CD28-индукции in vitro дефицит CD3/CD28-экспрессирующих лимфоцитов сочетается со снижением количества субпопуляций IL-2-позитивных клеток (CD3+CD28+IL2+, IL2+) и гипосекрецией IL-2 с наибольшей выраженностью при диссеминированной форме лекарственно-устойчивого ТЛ. Доказано, что у больных ТЛ увеличение относительного и абсолютного числа Т-

лимфоцитов с иммуносупрессорным фенотипом CTLA4+ и, напротив, дефицит Т-клеток, содержащих NF-B и NFAT2 - факторы рецепторно-ядерной трансдукции сигнала Т-клеточной активации, сопровождается снижением секреции IL-2. Показано, что дисрегуляция сигнальной трансдукции в условиях CD3/CD28-индукции клеток in vitro сочетается с увеличением числа Т-лимфоцитов с иммунофенотипами CD3+NFAT1+ и CD3+AP-1+ при лекарственно-резистентном варианте инфильтративного ТЛ и снижением их количества при диссеминированном лекарственно-чувствительном (CD3+NFAT1+) и лекарственно-резистентном (CD3+AP-1+) ТЛ. Выявленные изменения позволяют заключить, что нарушения рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов при ТЛ определяются на всех этапах ее реализации, начиная с формирования иммунологического синапса вследствие дефицита образующих его рецепторных молекул CD3 и CD28, CTLA4-зависимой супрессии сигнала костимуляции Т-клеток, и заканчивая нарушением передачи активирующего сигнала в ядро клетки в связи с дефицитом белков транскрипции NF-B и NFAT2 в Т-лимфоцитах.

Впервые установлено также, что при ТЛ, за исключением диссеминированной формы его лекарственно-резистентного варианта, отмечается гипосекреция провоспалительного цитокина IL-12(p70) и его биологически активной субъединицы IL-12(p35) мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro на фоне выраженной гиперсекреции IL-27 и обладающего иммуносупрессорной активностью полипептида IL-12(p40). При диссеминированном лекарственно-резистентном ТЛ гиперсекреция IL-12(p40) сочетается с соответствующей норме in vitro секрецией IL-12(p70), IL-12(р35) и IL-27 мононуклеарными лейкоцитами, изолированными из цельной крови. Показано, что у больных ТЛ абсолютный дефицит СD3+IL-12R, СD3+gpl30+, CD3+WSX1+ и СD3+WSXl+gpl30+ клеток отмечается на фоне увеличения численности Т-лимфоцитов, характеризующихся высокой экспрессией gpl30-связывающей рецепторной молекулы WSX1 (CD3+WSXl+hl, СD3+WSXl+hlgpl30+ и СD3+WSXl+hlgpl30-), способной подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов. Вместе с тем, установлено снижение количества Т-лимфоцитов с внутриклеточной экспрессией фактора T-bet, являющегося главным индуктором транскрипции гена IFN в условиях активации Т-клеток цитокинами АРС. Дефицит СD3+ лимфоцитов, экспрессирующих транскрипционный регулятор дифференцировки ТЫ-лимфоцитов T-bet, оказался наиболее выраженным при диссеминированном лекарственно-резистентном ТЛ. Обнаружено, что в лизатах лимфоцитов крови у всех больных ТЛ, независимо от клинической формы заболевания и чувствительности M. tuberculosis к лекарственным средствам, отмечается снижение концентрации компонентов JAK-STAT-сигнального каскада передачи импульса цитокиновой активации -тирозиновых янус-киназ JAK1, JAK2, TYK2 и белков транскрипции STAT1, STAT4. Показано также, что для ТЛ характерна базальная и 1Ь-12/1Ь-27-индуцированная in vitro гиперсекреция IFN лимфоцитами крови на фоне дефицита CD3+IFN+ и CD3+IFN" клеток и увеличения числа лимфоцитов, не имеющих фенотипического СВЗ-маркера Т-клеток (CD3"IFN+). Сочетание указанных изменений позволяет заключить, что нарушение 1Ь-12/1Ь-27-зависимой активации Т-клеток при ТЛ отмечается на всех ее этапах, начиная с нарушений секреции активирующих

цитокинов, экспрессии воспринимающих их рецепторов, и заканчивая дефицитом компонентов JAK-STAT-сигналинга, и опосредует дефицит CD3+ клеток с внутриклеточным содержанием IFN – маркерного цитокина T-лимфоцитов-хелперов типа 1. Вместе с тем, гиперсекреция IFN лимфоцитами in vitro на фоне увеличении численности IFN+ клеток, негативных по Т-клеточному кластеру дифференцировки CD3, дает основание полагать, что основными клетками-продуцентами цитокина при ТЛ являются не Т-лимфоциты, а натуральные киллеры, или NK-клетки.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные

фундаментальные данные расширяют имеющиеся представления об

иммунопатогенезе туберкулеза органов дыхания и туберкулезной инфекции в целом, и вносят дополнительный вклад в понимание молекулярных механизмов нарушений периода инициации Т-клеточного иммунитета и формирования состояния гипо- и анергии Т-лимфоцитов, приводящих к дисрегуляции иммунного ответа при туберкулезе легких. Результаты оценки нарушений реализации ключевых звеньев активации Т-клеток на этапе их взаимодействия с АРС и распознавания антигена в условиях экспериментального in vitro моделирования направленной рецептор-зависимой и цитокин-опосредованной индукции лимфоцитов представляются значимыми с позиций новых знаний о механизмах формирования иммунных отклонений при различных клинико-патогенетических вариантах туберкулеза легких. Полученные новые данные обосновывают необходимость коррекции нарушений индуктивной фазы иммунного ответа на ранних этапах активации Т-клеток с учетом клинической формы заболевания и чувствительности M. tuberculosis к лекарственным средствам противотуберкулезной терапии и могут служить основой для разработки новых подходов к диагностике, профилактике осложнений и патогенетически обоснованной терапии заболевания, в том числе на основе применения молекулярно-клеточных технологий.

Результаты работы применяются на кафедрах патофизиологии, иммунологии и аллергологии, фтизиатрии и пульмонологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России в курсах лекций и практических занятий для обучения студентов врачебных (лечебного и педиатрического) и медико-биологического факультетов.

Методология и методы исследования. Для реализации поставленных задач в
работе использовались методы in vitro стимуляции Т-лимфоцитов антирецепторными
антителами и рекомбинантными цитокинами для экспериментального

моделирования их активации при контактном и цитокин-зависимом взаимодействиях с антигенпрезентирующей клеткой в индуктивную фазу клеточно-опосредованного иммунного ответа. Исследования выполнялись на базе ЗАО «Томские клеточные технологии» и лабораторий ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России. В качестве материала для исследований использовали венозную кровь, а объекта – лимфоциты и мононуклеарные лейкоциты. Основные методы исследования:

  1. Выделение, культивирование и экспериментальное моделирование in vitro индукции лимфоцитов крови моноклональными антителами к рецепторным молекулам CD3 и CD28;

  2. Выделение, культивирование и экспериментальное моделирование in vitro

индукции лимфоцитов крови рекомбинантными цитокинами IL-12 и IL-27;

  1. Выделение, культивирование и экспериментальное моделирование in vitro специфической (антигенной) индукции мононуклеарных лейкоцитов крови с использованием вакцинного штамма BCG;

  2. Типирование лимфоцитов крови после CD3/CD28-индукции in vitro для определения поверхностных молекул (CD3 – общий кластер дифференцировки Т-клеток; CD28 – молекула костимуляции; CTLA4 – ингибиторная молекула) и внутриклеточных белков (факторы транскрипции NF-B, NFAT, АР-1 и цитокин IL-2) (проточная цитометрия);

  3. Типирование лимфоцитов крови после IL-12/IL-27-индукции in vitro для определения поверхностных молекул (CD3 – общий кластер дифференцировки Т-клеток; IL-12R2 – 2-субъединица к рецептору для IL-12; WSX1/gp130 – рецептор к IL-27) и внутриклеточных белков (фактор транскрипции T-bet и цитокин IFN) (проточная цитометрия);

  4. Измерение in vitro базальной и индуцированной секреции лимфоцитами крови IL-2 (после инкубации с CD3/CD28-антирецепторными антителами) и IFN (после инкубации с рекомбинантными цитокинами IL-12/IL-27) (метод твердофазного иммуноферментного анализа);

  5. Измерение in vitro базальной и антиген-стимулированной (после инкубации с вакцинным штаммом BCG) секреции мононуклеарными лейкоцитами крови IL-27, IL-12(p70) и его субъединиц IL-12(p35) и IL-12(p40) (метод твердофазного иммуноферментного анализа);

  6. Определение содержания белков транскрипции STAT1, STAT4 и тирозинкиназ JAK1, JAK2, TYK2 в лизатах лимфоцитов крови (метод твердофазного иммуноферментного анализа);

  7. Статистический анализ результатов. Положения, выносимые на защиту:

  1. Патогенетическими факторами нарушений клеточного этапа рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов в условиях CD3/CD28-индукции in vitro при туберкулезе легких являются дефицит поверхностных рецепторов CD3 и CD28, участвующих в формировании иммунологического синапса, и CTLA4-зависимая супрессия костимуляторного сигнала.

  2. Нарушения внутриклеточной трансдукции сигнала CD3/CD28-рецепторной in vitro активации Т-лимфоцитов при туберкулезе легких связаны с дефицитом белков транскрипции NF-B, NFAT2 и вариабельностью числа NFAT1+ и AP-1+ Т-клеток при инфильтративной (увеличение) и диссеминированной (снижение) формах заболевания.

  3. Дисбаланс in vitro секреции цитокинов семейства IL-12 (гипосекреция IL-12 (p70 и p35) на фоне гиперсекреции IL-12-рецепторного антагониста IL-12(p40) и IL-27) при туберкулезе легких сочетается с дефицитом IL-12/IL-27-индуцированной экспрессии Т-лимфоцитами их рецепторов (IL-12R2 и WSX1/gp130) при увеличении числа Т-клеток с высокой экспрессией ингибиторной молекулы WSX1 (WSX1+hi).

  4. Нарушения внутриклеточного этапа IL-12/IL-27-цитокиновой in vitro

активации Т-лимфоцитов при туберкулезе легких обусловливаются дефицитом
сигнальных тирозинкиназ JAK (1 и 2), TYK2 и белков-регуляторов
транскрипции STAT (1 и 4), T-bet.
5. Дисрегуляция клеточного и внутриклеточного этапов рецепторной и

цитокиновой in vitro активации Т-лимфоцитов, наиболее выраженная при диссеминированном лекарственно-резистентном туберкулезе легких, при инфильтративной и диссеминированной формах болезни обусловлена однотипными механизмами и приводит к нарушению дифференцировки Т-лимфоцитов-хелперов типа 1 (Th1) и синтеза Th1-цитокинов IL-2 и IFN. Гиперсекреция IFN in vitro ассоциируется с увеличением числа IFN+ CD3-негативных лимфоцитов.

Степень достоверности и апробация результатов. Полученные результаты имеют высокую степень достоверности, которая подтверждается достаточным объемом клинико-лабораторного материала и числом проведенных экспериментов in vitro, использованием современных методических приемов и высокоинформативных методов исследования (проточная цитофлуориметрия, иммуноферментный анализ), высокотехнологичного оборудования и адекватных критериев для статистической обработки результатов.

Основные положения диссертации докладывались и обсуждались: на IX
Съезде фтизиатров России (Москва, 2011); X Научно-практической конференции
молодых ученых «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов
Сибири» (Красноярск, 2012); XVIII Межгородской научной конференции молодых
ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2012); II
Международной научно-практической конференции «Актуальные направления
фундаментальных и прикладных исследований» (Москва, 2013); XVII Юбилейной
Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница:
проблемы и решения» (Ленинск-Кузнецкий, 2013); Юбилейной научно-практической
конференции, посвященной 70-летию образования Новосибирского НИИ

туберкулеза «Эффективное решение проблем туберкулеза: от научной идеи до медицинской практики» (Новосибирск, 2014); III Конгрессе Национальной Ассоциации фтизиатров России (Санкт-Петербург, 2014); XV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2015); XVI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2017); на научно-образовательных семинарах кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (Томск, 2012-2017).

Работа осуществлена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт №16.512.11.2046), Российского фонда фундаментальных исследований (проект №11-04-98057-р_сибирь_а), Совета по грантам Президента Российской Федерации для ведущих научных школ (гранты НШ-614.2012.7, НШ-4184.2014.7, НШ-2690.2018.7).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 работа, из них 1 монография, 19 статей в научных журналах, включенных в перечень

рекомендованных ВАК при Минобрнауки России рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, 11 статей и тезисов в материалах конференций, форумов, конгрессов, съездов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 231 странице, состоит из введения, четырех глав, включающих обзор литературы, описание объекта, материала и методов исследований, собственных результатов и их обсуждение, выводов, списков сокращений и литературы. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 28 таблицами. Библиографический список включает 382 источника, в том числе 116 отечественных и 266 зарубежных авторов.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в
диссертации.
Соискатель принимал непосредственное участие в разработке научной
идеи, постановке цели и задач диссертации, отработке методических приемов,
организации и проведении экспериментальных работ. Лабораторные исследования
проводились соискателем лично или при его прямом участии. Результаты получены,
статистически обработаны и обсуждены автором самостоятельно. На их основе
соискателем подготовлены к публикации материалы по теме диссертации (тезисы,
статьи, монография) – полностью или их разделы в соавторстве.

Оформление диссертации и автореферата выполнены автором лично.