Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Роль протеинопатии в патогенезе НДЗ 13
1.2 Боковой амиотрофический склероз (БАС) 17
1.3 Фронто-темпоральная деменция (ФТД) 19
1.4 Общие молекулярные механизмы в патогенезе БАС и ФТД 22
1.5 Гипотезы этиологии БАС и ФТД 34
1.6 Генетические аспекты БАС и ФТД 37
1.7 Патология белка FUS при БАС и ФТД 43
1.8 Моделирование FUS-протеинопатии в животных 47
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1 Экспериментальные животные 52
2.2. Генотипирование животных 52
2.2.1. Конвенционная ПЦР 52
2.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 53
2.2.3. Выделение геномной ДНК 53
2.2.4. Количественная ПЦР в реальном времени 53
2.3. Анализ экспрессии генов 54
2.3.1. Выделение РНК 54
2.3.2. ОТ-ПЦР в реальном времени 55
2.4. Анализ белка 56
2.4.1. Приготовление белковых препаратов 56
2.4.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 56
2.4.3. Иммуноблотинг белков 57
2.5. Гистологический анализ 58
2.5.1. Окраска нейронов по методу Ниссля 59
2.5.2. Иммуногистохимическое окрашивание 59
2.6. Поведенческое тестирование 60
2.6.1. Анализ двигательной функции у мышей 60
2.6.1.1. Тест «ускоряющийся ротарод» 60
2.6.1.2. Тест «перевернутая сетка» 60
2.6.2. Анализ когнитивной функции у мышей 61
2.6.2.1. Тест «Открытое поле» 61
2.6.2.2. Тест «темно-светлая камера» 62
2.6.2.3. Тест приподнятый «О-лабиринт» 62
2.6.2.4. Тест «индуцированный груминг» 62
2.6.2.5. Тест «моделирование страха» 62
2.6.2.6. Тест «резидент-интрудер» 63
2.7. Определение хромосомной локализации трансгенной кассеты 63
2.7.1. Мечение ДНК методом ник-трансляции 63
2.7.2. Гибридизация пробы с препаратами хромосом 64
2.8. Анализ транскриптомов 65
2.8.1. Очистка РНК для последующего секвенирования 65
2.8.2. Секвенирование РНК 66
2.8.3. Анализ данных секвенирования РНК 66
2.9. Статистическая обработка данных 67
Глава 3. Результаты и их обсуждение 68
3.1. Получение линии трансгенных мышей L-FUS[1-359] и её характеристика 68
3.1.1. Выделение из оригинальной трансгенной линии tg hFUS[1-359] группы животных с увеличенной продолжительностью жизни 69
3.1.2. Отсутствие двигательных расстройств у L-FUS[1-359] мышей 72
3.1.3. Сравнительный анализ числа копий FUS кассеты в геноме L-FUS[1-359] мышей и оригинальной линии tg hFUS[1-359] 73
3.1.4. Сравнительный анализ уровней экспрессии трансгенной кассеты в спинном мозге L-FUS[1-359] и tg hFUS[1-359] мышей 74
3.1.5. Анализ экзогенного белка FUS человека в спинном мозге L-FUS[1-359] мышей 75
3.1.6. Диффузное накопление экзогенного белка FUS человека в нейронах спинного мозга L-FUS[1-359] мышей 77
3.1.7. Гистологический анализ двигательных нейронов спинного мозга L-FUS[1-359] мышей 78
3.1.8. Детектирование экзогенного белка FUS человека в нейронах коры головного мозга у L-FUS[1-359] мышей 80
3.2. Трансгенная линия L-FUS[1-359] мышей как модель фронтотемпоральной деменции 82
3.2.1. Исследование уровня экспрессии трансгенной кассеты в головном мозге L-FUS[1-359] мышей 82
3.2.2. Исследование содержания укороченной формы белка FUS человека в головном мозге L-FUS[1-359] мышей 84
3.2.3. Исследование когнитивной функции у L-FUS[1-359] мышей 85
3.2.3.1. Исследование тревожного поведения у L-FUS[1-359] мышей 85
3.2.3.2. Исследование стереотипического поведения у L-FUS[1-359] мышей 89
3.2.3.3. Влияние моделированного стресса на поведение у L-FUS[1-359] мышей 90
3.2.3.4. Нарушение социального поведения у L-FUS[1-359] мышей 92
3.3. Исследование изменения локализации трансгенной кассеты в геноме L-FUS[1-359] мышей 93
3.3.1. Определение хромосомной локализации трансгена в геномах tg hFUS[1-359] и L-FUS[1-359] мышей 94
3.3.2. Исследование влияния положения трансгенной кассеты на фенотип заболевания 95
3.4. Выявление защитных механизмов, подавляющих прогрессию FUS протеинипатии в двигательных нейронах L-FUS[1-359] мышей 97
3.4.1. Сравнительный анализ транскриптомов двигательных нейронов спинного мозга L-FUS[1-359] мышей и животных дикого типа 98
3.4.2. Исследование содержания мРНК в тканях спинного мозга для генов с измененным уровнем транскрипции у L-FUS[1-359] мышей 103
Заключение 106
Выводы 109
Список сокращений 110
Список литературы 112
- Роль протеинопатии в патогенезе НДЗ
- Моделирование FUS-протеинопатии в животных
- Исследование тревожного поведения у L-FUS[1-359] мышей
- Исследование содержания мРНК в тканях спинного мозга для генов с измененным уровнем транскрипции у L-FUS[1-359] мышей
Роль протеинопатии в патогенезе НДЗ
В связи с увеличением качества и продолжительности жизни за последние десятилетия, увеличилось и число регистрируемых нейродегенеративных заболеваний (НДЗ), характерных, в основном, для пожилых пациентов [Commins S. et al., 2019; Prince M. et al., 2016]. НДЗ имеют мультифакторную природу возникновения, характеризующуюся прогрессирующей гибелью нейронов спинного и/или головного мозга, и приводящую к поражениям когнитивных функций и к ограничениям подвижности [Kovacs G.G., 2016]. Среди НДЗ выделяют обширную группу болезней, в патогенезе которых важную роль играет агрегация конформационно нестабильных белков, часто обозначаемую как протеинопатии (proteinopathy) или конформационные болезни (protein missfolding diseases) [Шелковникова Т.А. с соавт., 2012]. Деменции составляют большую часть регистрируемых протеинопатий. Наиболее распространенными деменциями являются болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), фронтотемпоральная деменция (ФТД), болезнь с рассеянными тельцами Леви.
Несмотря на значительные различия в возрасте возникновения первых клинических проявлений, симптоматике заболевания и локализации патологического процесса в разных отделах нервной системы, протеинопатии на клеточном и биохимическом уровнях имеют одинаковую молекулярную основу развития – нарушение структуры определенной группы белков и их агрегирование, часто сопровождаемое формированием патогистологических включений [Forman M.S. et al., 2004]. В многочисленных работах было показано, что в патогенезе протеинопатий важное значение имеют такие факторы, как нарушение функционирования клеточных механизмов утилизации белков: убиквитин протеасомной и аутофаго-лизосомной систем, патологические изменения стресс белков и белков-шаперонов. Результатом этих нарушений становится повреждение нейронов и развитие НДЗ [Nijholt D.A. et al., 2011]. Данные механизмы оказывают влияние на множество других молекулярных клеточных каскадов, задействованных как в энергетической регуляции, так и в изменении метаболизма, ионного гомеостаза и в эффективности клеточной адаптации [von Bernhardi R. et al., 2012]. Например, глутамат и аспартат-опосредованная острая эксайтотоксичность, вызванная увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция (Са2+), приводит к возникновению церебральной ишемии и эпилептического статуса. Хроническая эксайтотоксичность, при которой происходит развитие энергодефицита клетки из-за повреждения митохондрий, является механизмом развития таких НДЗ как боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Альцгеймера, хорея Гентингтона (ХГ) и других [Lewerenz J. et al., 2015]. Нарушения в функционировании митохондрий также могут лежать в основе развития болезни Паркинсона и вносят существенный вклад в процессы ее прогрессирования [Ryan B.J. et al., 2015].
Известно также, что процесс активации микроглии вследствие потери ингибирующего влияния нейронов, влечет за собой активацию фермента NO синтазы и образование оксида азота, что способствует развитию воспалительного процесса и прогрессии нейродегенерации [Кучеряну В.Г. с соавт., 2012; Yuste J.E. et al., 2015]. Окислительный стресс и образование свободных радикалов, митохондриальная дисфункция, нарушение клеточного энергетического метаболизма, повреждения ДНК, нейровоспалительные процессы и нарушение клеточно-аксонального транспорта связаны с образованием токсичных для клетки форм белков при НДЗ. Все эти факторы в комплексе вносят важный вклад в механизмы повреждения нейронов и их гибель и определяют картину патогенеза соответствующего НДЗ [Jellinger K.A., 2010]. При этом в большинстве теоретических работ считается, что при протеинопатиях наиболее существенный и основополагающий вклад в молекулярные механизмы патогенеза вносят именно склонные к агрегации белки, которые различны по своей природе, могут относиться к разным семействам, но при нарушении конформации и метаболизма запускают процессы, приводящие в итоге к поражению и гибели нейронов [Шелковникова Т.А. с соавт.., 2012].
Механизм патогенной агрегации белков при протеинопатиях.
В подавляющем большинстве случаев при протеинопатиях образуются специфические патогистологические включения, как амилоидного, так и не амилоидного типов. Механизм образования белковых отложений при различных протеинопатиях является общим и начинается с нарушения конформации соответствующего белка и последующего образования олигомеров, агрегирующих в белковые фибриллы из мономерных белков с нарушенной структурой (рис. 1). При этом система белков-шаперонов, включая белки теплового шока, может блокировать процесс нарушения структуры мономерной формы белка, возвращая его в состояние нормальной конформации [Wolozin B., 2012]. Патогенная форма белка образуется через переходное состояние, существующее между полностью развернутой и нативной формами полипептидной цепи, поскольку энергия активации, необходимая для перехода из промежуточного состояния в склонную к агрегации форму, незначительно превышает энергию, необходимую для перехода в нативную форму. При этом агрегированная форма белка является энергетически более выгодной [Шелковникова Т.А. с соавт., 2012].
Увеличенная гидрофобность молекулы белка также способствует повышению склонности белка к олигомеризации и минимизированию энергии гидрофобных взаимодействий. Олигомеры и фибриллы, образующиеся в клеточном пространстве, являются растворимыми структурами, почти всегда токсичными для клетки. Данные структуры могут формировать кольцевые молекулы, которые, взаимодействуя с мембранами, создают подобие клеточных пор. Это нарушает целостность мембран клетки и митохондрий, стимулируя нарушение ионного гомеостаза и выброс активных форм кислорода, что может привести к клеточному стрессу или апоптозу [Caughey B. et al., 2003]. Способность олигомеров -амилоида ассоциироваться с плазматической мембраной и формировать ионные каналы усиливается под воздействием фосфатидтлсерина на поверхности клетки. Митохондриальные нарушения при БА могут увеличить уровень фосфатидилсерина на клеточной поверхности в пораженных нейронах и тем самым облегчить формирование -амилоид-опосредованных пор. Данные поры увеличивают входящий ток Ca2+, что вызывает эксайтотоксичность клетки [Пальцев М.А. с соавт., 2019].
В механизмах развития и прогрессии протеинопатий много общего. Считается, что инициирующим фактором запуска патологического каскадного процесса является нарушение нормальной конформации определенного белка, как, например, происходит в случае прионных заболеваний, в которых инфекционным агентом выступает неправильно свернутый патогенный белок – прион. Инфекционность приона заключается в способности белка с нарушенной конформацией инициировать патологическое сворачивание нормальных белков со схожей аминокислотной последовательностью [Shorter J. et al., 2005]. Биофизические исследования показали, что в молекуле приона большинство -спиралей заменяется на перпендикулярно уложенные -слои и формируются стабильные амилоидные фибриллы, устойчивые к воздействию детергентов, протеаз и температурной денатурации [Cushman M. et al., 2010]. Такие белки имеют повышенную склонность к агрегации и образуют нерастворимые белковые комплексы.
Моделирование FUS-протеинопатии в животных
На грызунах создан целый ряд трансгенных линий как со сверхэкспрессией нативного белка FUS человека, так и его мутантных форм. Полученные нокаутные FUS-/- мыши проявляли отсутствие сосательного рефлекса в следствие чего новорожденные животные погибали в течение 16 часов после рождения [Kuroda M. et al., 2000].
Группой ученых под руководством Dupuis et al. были созданы нокаутные животные и трансгенные животные, у которых экспрессировался ген FUS с мутацией, приводящей к утрате домена сигнала ядерной локализации. И линия нокаутных, и линия трансгенных гомозиготных животных, погибали после рождения от дыхательной недостаточности. Анализ генов трансгенных животных выявил нарушения экспрессии и сплайсинга различных генов, что является ожидаемым следствием утраты физиологической функции FUS в ядре и накопление его в цитоплазме, что также подтвердилось методом иммуногистохимии. Экспрессия аберрантной формы FUS у трансгенных мышей, в отличие от линии нокаутных животных, вызывала также потерю двигательных нейронов в перинатальном периоде развития [Scekic-Zahirovic J. et al., 2016].
Агрегационные свойства нативного не мутированного белка FUS были изучены группой Mitchell et al. [Mitchell J.C. et al., 2013], которая получила трансгенных животных со сверхэкспрессией человеческого не мутантного гена FUS и показала, что в двигательных нейронах спинного мозга развивается стремительно прогрессирующий нейродегенеративный процесс, выявляемый уже через четыре недели после рождения, а к восьмой неделе жизни клиническая симптоматика модельного заболевания включает паралич передних конечностей. При патогистологическом исследовании препаратов головного мозга в корковых нейронах выявляются ярко окрашенные ядерные и цитоплазматические FUS-реактивные включения, которые в основном локализованы в V слое коры и в стриатуме, но при этом не наблюдается гибели нейронов. В нейронах же спинного мозга обнаруживаются гранулярные включения FUS и гибель пораженных нейронов, что сопровождается астроглиозом.
Поскольку большинство обнаруживаемых мутаций в гене FUS локализованы в участке, кодирующем домен ядерной локализации, был создан целый ряд моделей трансгенных животных с суперэкспрессией различных мутантных форм белка FUS с нарушенным сигналом ядерной локализации. У трансгенных мышей, в геноме которых экспрессирoвался ген FUS с мутацией R521C, развивалась тяжелая моторная дисфункция со спастической параплегией, мышечной атрофией, нарушениями походки и т.п [Qiu H. et al., 2014]. Смерть таких животных наступала в течение 6 недель после манифестации первых клинических симптомов. В спинном мозге этих мышей погибало более 50% двигательных нейронов на фоне выраженного астроглиоза. Кроме того, были выявлены нарушения развития дендритов и формирования синапсов как в нейронах коры головного мозга, так и спинного мозга. Иммуногистохимические исследования компартментализации патогенной формы FUS показали преимущественно ядерную локализацию, что позволило авторам исследования выдвинуть гипотезу, согласно которой нейродегенеративный процесс, обусловленный мутацией R521C в гене FUS, не зависит от образования цитоплазматических белковых агрегатов. Анализ транскриптомов различных отделов нервной системы трансгенных животных выявил изменения в уровнях экспрессии большого числа генов, участвующих в транскрипции и процессинге РНК, что, по-видимому, и является причиной развития дефектов дендритов и синапсов. Неудивительно, что у исследованных мышей были снижены уровни экспрессии BDNF – основного фактора роста нейронов.
В лаборатории моделирования нейродегенеративных процессов ИФАВ РАН совместно с лабораторией трансгенеза ИБГ РАН была создана линия трансгенных мышей с эктопической экспрессией укороченного гена FUS человека, кодирующего патогенную форму белка с исключительно высокой степенью агрегационной способности и преимущественно цитоплазматической локализацией из-за удаленного домена сигнала ядерной локализации. Данная линия мышей характеризовалась развитием модельного нейродегенеративного заболевания с выраженной моторной дисфункцией, развивающейся с возраста около трех месяцев. Заболевание носило прогрессирующий характер и вело к 100%-ной гибели животных при короткой симптоматической стадии: от 5 до 20 дней с момента регистрации первых клинических симптомов. При патогистологическом исследовании у модельных животных обнаруживались многочисленные FUS-реактивные убиквитинированные включения и потеря значительной части двигательных нейронов передних рогов спинного мозга [Shelkovnikova T.A. et al., 2013a].
Другая линия трансгенных мышей с экспрессией мутантного гена FUS с заменой R522G и полностью удаленным РНК-распознающим доменом, описанные в Robinson et al., характеризовалась исключительно ранней летальностью. Животные рождались со сниженной массой тела, через 3-4 недели у них развивался тремор, после чего не более чем через 48 часов они погибали. Патогистологический анализ препаратов спинного и головного мозга выявил у данных животных крупныe FUS-реактивныe белковые включения в коре и стволе мозга без признаков нейродегенерации и нейровоспаления [Robinson H.K. et al., 2015]. Эти данные подтвердили патогенность форм белка FUS, которые не способны связываться с РНК и при этом накапливаются в цитоплазме из-за отсутствия сигнала ядерной локализации. Мутации в гене FUS, затрагивающие сигнал ядерной локализации, были исследованы так же группой ученых под руководством Huang et al.. Ими были созданы 2 линии трансгенных крыс: в первой линии животные экспрессировали ген FUS человека с мутацией R521C [Huang C. et al., 2012], а во второй – не измененный ген FUS человека [Huang C. et al., 2011]. У мышей с мутантным геном FUS развивалось прогрессирующее нейродегенеративное заболевание с параличами задних и передних конечностей, тогда как у животных со сверхэкспрессией не мутантного белка FUS не было отмечено моторных нарушений, но с возрастом регистрировались ухудшение обучения и памяти. Диффузные цитоплазматические убиквитинированные агрегаты FUS и активация микроглии наблюдались в модели животных с мутантным геном FUS. При этом гибель нейронов коры головного мозга и гиппокампа имела место в обеих моделях.
С использованием новейших современных технологий созданы также две линии CRE-индуцированных трансгенных мышей с низким уровнем экспрессии гена FUS человека дикого типа (FUSWT) и гена FUS человека с мутацией R521C (FUSR521C) [Sephton C.F. et al., 2014]. Обе линии животных характеризуются развитием тяжелых нарушений двигательных функций и ранней смертностью, но у них не было выявлено ни агрегации FUS, ни гибели нейронов. При этом наблюдается денервация нейромышечных контактов и мышечная атрофия. По видимому, тяжелые поражения нейромышечных контактов и блокирование работы мышц приводят к гибели животное до того, как последует ретроградная дегенерация нейрона. Проведенный анализ экспрессии генов показал, что патология у FUSWT развивается по механизму потери нормальной функции белка через его влияние на экспрессию других генов, тогда как у FUSR521C в развитии патологии задействован механизм увеличения белковой токсичности из-за нарушения синаптического гомеостаза. Это наблюдение также подтверждает полученные группой Qiu et al. данные изменения экспрессии группы генов, вовлеченных в функционирование синапсов, у мышей с мутацией R521C в гене FUS. Недавно группой Sharma et al. были созданы несколько линий мышей с экспрессией единичной копии человеческих генов FUS: дикого типа (FUSWT), с мутациями R521C (FUSR521C), P525L (FUSP525L) в локусе гена MAPT [Sharma A. et al., 2016]. При этом мутация FUSP525L приводила к специфической дегенерации двигательных нейронов в более раннем возрасте и увеличению цитоплазматического пула белка FUS, чем в модели FUSR521C. У данных животных моделей также выявлялась денервация нейромышечных контактов, а также астроцитоз и микроглиоз в спинном мозге, но не обнаруживались патологические белковые агрегаты. У животных FUSWT моторные нарушения не развивались.
В настоящее время не вызывает сомнений роль нарушения функции белка FUS в развитии ряда форм БАС и ФТД, однако факторы, определяющие анатомическую локализацию патологического процесса и скорость его прогрессии, остаются неизвестными. Не определены и ключевые компоненты собственных защитных механизмов нейронов, непосредственно вовлеченные в процессы подавления FUS-протеинопатии. Их исследование является важной задачей на пути исследования молекулярных механизмов патогенеза БАС и ФТД и разработки методов патогенетической терапии данных заболеваний.
Исследование тревожного поведения у L-FUS[1-359] мышей
Важным показателем тревожного состояния животных в тесте «открытое поле» является соотношение уровней его активности в центральной и периферической зонах установки: более тревожные животные передвигаются, в основном, вдоль стен. А для оценки исследовательского поведения в тесте «открытое поле» учитывается количество вертикальных стоек животного и попыток исследовать «норки» – отверстия в основании установки. В экспериментальных установках «темно-светлая камера» и «О-лабиринт» тревожность животного оценивается по соотношению периодов времени, проведенных в освещенном и затемненном отсеках, поскольку обычно животное избегает потенциально опасных освещенных областей [Campos A.C. et al., 2013]. А показатель латентного времени начала исследования животными нового потенциально опасного пространства может интерпретироваться как проявление импульсивности [Przybyla M. et al., 2016].
В установках «открытое поле», «темно-светлая камера» и «О-лабиринт» были исследованы сравнительные характеристики поведения самцов линии L-FUS[1-359] и контрольных самцов дикого типа. Сравнительный анализ стареющих гомозиготных по трансгенной кассете самцов линии L-FUS[1-359] и контрольных самцов дикого типа, полученных от общих производителей, в возрасте 5 месяцев выявил различия в показателях когнитивных функций и социального поведения.
На рисунке 16 представлены результаты анализа локомоторной активности и исследовательской реакции у гемизиготных самцов линии L-FUS[1-359] в установке «открытое поле». Тест «открытое поле» является многофункциональным тестом, позволяющим оценивать параметры локомоторной активности, тревожности и исследовательской активности [Przybyla M. et al., 2016]. Проведенный анализ гомозиготных животных L-FUS[1-359] и животных дикого типа показал, что при одинаковых значениях общего времени движения и времени покоя у мышей L-FUS[1-359] увеличены параметры общего пройденного расстояния и средней скорости передвижений (рис.16А). Изменение данных показателей может трактоваться как увеличение возбужденного состояния животных и не является показателем моторных нарушений. Более того, данное тестирование выявило и изменения показателей тревожного поведения в группе L-FUS[1-359] мышей: расстояниe, пройденное в центральной зоне и общее время, проведенное в центральной зоне, были достоверно снижены, что может являться признаком увеличенного тигмотаксиса и показателем повышенной тревожности [Kayasuga Y. et al., 2007] (рис.16Б). Исследовательское поведение также изменено у гомозиготных по трансгенной кассете мышей L-FUS[1-359] в возрасте 5 месяцев. Так, количество вертикальных стоек, совершенных животными L-FUS[1-359], достоверно выше, а количество заглядываний в норки достоверно ниже по сравнению с животными дикого типа (рис. 16В). Возможной причиной снижения уровня заглядываний в норки является расположение их в центральной зоне установки, тогда как L-FUS[1-359] животные имеют сниженный показатель проведенного там времени.
А) параметры локомоторной активности. Б) показатели тревожного поведения. C) показатели исследовательской реакции. – р 0,05, – p 0,01, – p 0,001. Тест Манна-Уитни. n=12. Тесты «темно-светлая камера» и приподнятый «О-лабиринт» являются специальными тестами для оценки тревожного поведения животных. Помещенные в начале эксперимента в темный отсек экспериментальной установки «темно-светлая камера» животные линии L-FUS[1-359] показывают достоверно меньшее латентное время выхода в светлый отсек по сравнению с животными дикого типа (рис. 17A). Также общее число выходов L-FUS[1-359] мышей в светлый отсек достоверно выше. Общее время, проведенное в светлом отсеке, не является достоверно различимым между группами животных.
В тесте приподнятый «О-лабиринт» (рис. 17Б) трансгенные животные L-FUS[1-359] демонстрировали достоверно меньшее время латентного выхода в открытый сектор и достоверно большее число выходов в открытый сектор. Также трансгенные животные L-FUS[1-359] имеют достоверно больший показатель проведенного в открытом секторе времени.
А) тест «темно-светлая камера». Б) тест приподнятый «О- лабиринт». – р 0,05, – p 0,01, – p 0,0001. Тест Манна-Уитни. n=12.
Таким образом, данные теста приподнятый «О-лабиринт» для гомозиготных животных L-FUS[1-359] повторяли данные теста «темно-светлая камера», показывая сниженную тревожность трансгенных животных. Уменьшение показателей латентного времени выхода в светлый сектор и открытый рукав экспериментальных установок у L-FUS[1-359] мышей является показателями увеличенной импульсивности. Увеличение количества выходов животных L-FUS[1-359] в эти зоны установок из темных и закрытых безопасных зон по сравнению с животными дикого типа в обоих тестах свидетельствуют о снижении показателей тревожности. Совокупность этих изменений можно интерпретировать как проявление импульсивности и расторможенности или эмоциональных нарушений, являющихся признаком ФТД у пациентов [Przybyla M. et al., 2016].
Различия в показателях тревожности гомозиготных животных L-FUS[1-359] в тесте «открытое поле» по сравнению с тестами «темно-светлая камера» и приподнятый «О-лабиринт» могут быть объяснены различными исследуемыми показателями тревожности. В установке «открытое поле» тревожное состояние животного является временным ответом на помещение его в незнакомую среду, тогда как тесты «темно-светлая камера» и приподнятый «О-лабиринт» отражают общее состояние тревожности животного, проявляющееся в зависимости от контекста [Prut L. et al., 2003]. В целом же выполненный нами анализ поведения животных в трех основных тестах для изучения эмоционального статуса грызунов показал изменения эмоционального статуса у L-FUS[1-359] мышей ко второй половине жизни.
Исследование содержания мРНК в тканях спинного мозга для генов с измененным уровнем транскрипции у L-FUS[1-359] мышей
Данные об изменении экспрессии генов, полученные при анализе транскриптомов спинного мозга, проверяли методом ОТ-ПЦР. По результатам секвенирования были выбраны гены различных семейств для проверки данных изменения экспрессии в спинном мозге трансгенных животных и животных дикого типа: ген основного белка миелина (MPZ), периаксин (Prx), ген альфа-рецепторов, активируемых пероксисомными пролифераторами (PPARA), ген рецептора, сопряженного с G-белком (Gpr179) и карбогидрат киназа (FGGY) (рис. 25). Выбранные для анализа методом ОТ-ПЦР гены не являются случайными и являются интересными для анализа, поскольку задействованы в регуляции важных молекулярных каскадов в клетке.
Анализ методом ОТ-ПЦР в реальном времени транскриптов, для которых при секвенировании РНК были выявлены: А) повышение экспрессии, Б) неизмененный уровень, В) снижение экспрессии.
Анализ транскриптомов спинного мозга выявил увеличение экспрессии у L FUS[1-359] мышей гена основного белка миелина (MPZ), кодирующего трансмембранный гликопротеин, составляющий 50% структуры периферической миелиновой оболочки [Roa B.B. et al., 1996], в 6 раз, и гена периаксина (Prx), кодирующего белок, две изоформы которого в комплексе с другими белками участвуют в образовании миелиновой оболочки [Yang Y. et al., 2015], в 4 раза. Ген (PPARA) кодирует альфа рецепторы, активируемые пролифератором пероксисом, которые являются ключевыми регуляторами метаболизма глюкозы и липидов, контролируют процессы окисления жирных кислот, а также пролиферации и дифференцировки клеток [Azhar S., 2010]. Экспрессия данного гена не была изменена в транскриптомах спинного мозга у L-FUS[1-359] и контрольных животных дикого типа. Снижение экспрессии в 7 раз у L-FUS[1-359] мышей по сравнению с контролями дикого типа детектировалось для гена карбогидраткиназы (FGGY), участвующем в энергетическом метаболизме клетки и процессе гликолиза.
Методом полногеномного поиска ассоциаций GWAS была выявлена ассоциация вариабельности гена FGGY со спорадическими случаями бокового амиотрофического склероза в некоторых популяциях [Dunckley T. et al., 2007]. Анализ транскриптомов спинного мозга также выявил снижение экспрессии гена GRP179, кодирующего рецептор, сопряженный с G-белком у трансгенных мышей L-FUS[1-359] в 2 раза по сравнению с контролями дикого типа. Таким образом, показано, что результаты экспрессии генов, полученные методом ОТ-ПЦР в реальном времени повторяют данные анализа транскриптомов спинного мозга методом полногеномного секвенирования.