Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Характеристика про- и антиоксидантных процессов в норме и при критических состояниях (Обзор литературы) 14
1.1. Характеристика компонентов системы перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты крови в норме 14
1.2. Окислительный стресс как реакция адаптации к экстремальным воздействиям 28
1.3. Способы оценки состояния про- и антиоксидантной систем организма
1.4. Роль нарушений перекисного окисления липидов и функционирования антиоксидантной системы для патогенеза острых отравлений 41
1.5. Влияние физико-химических методов лечения на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы 51
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 63
2.1. Характеристика материала собственных наблюдений 63
2.2 Методы исследования 69
2.2.1. Методы определения продуктов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в сыворотке крови 70
2.2.2. Методы определения показателей гемореологии, иммунитета, лабораторных показателей эндотоксикоза 74
2.2.3. Химико-токсикологические исследования
2.3. Методы лечения 76
2.4. Статистическая обработка материала 80
ГЛАВА III. Первичная реакция перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы на острую химическую травму 82
3.1. Нарушения процессов перекисного окисления липидов и антиокси дантной системы при острых отравлениях психофармакологическими средствами
3.1.1. Зависимость нарушений в системе перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы от тяжести острых отравлений психофармаколгическими средствами 82
3.1.2. Нарушения процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях психофармакологическими средствами отдельных фармакологических групп 87
3.1.3. Зависимость нарушений процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях психофармакологическими средствами от концентрации токсиканта... 89
3.1.4. Зависимость нарушений процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях психофармакологическими средствами разной степени тяжести от вре-мени,прошедшего между приемом токсиканта и началом специализированного лечения 96
3.1.5. Влияние возраста пациентов на дисбаланс в системе перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях психофармакологическими средствами 99
3.2. Нарушения перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы крови при острых отравлениях этанолом 101
3.2.1. Зависимость нарушений показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях этанолом от тяжести отравления и хронического алкоголизма.. 101
3.3. Нарушения процессов перекисного окисления липидов и антиоксидант ной системы при острых отравлениях веществами прижигающего действия 104
3.3.1. Влияние степени и протяженности химического ожога желудочно-кишечного тракта на показатели системы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы 104
3.3.2. Влияние времени, прошедшего с момента приема вещества прижигающего действия до начала специализированной помощи, на выраженность нарушений в системе перекисного окисления
липидов и антиоксидантной системы ПО
3.3.3. Влияние вида вещества прижигающего действия на нарушения в системе перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы 112
3.3.4. Влияние гемоглобинемии на нарушения в системе перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях веществами прижигающего действия 113
3.4. Влияние острой дыхательной недостаточности на нарушения в систе меперекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при ост
рых отравлениях 114
ГЛАВА IV. Нарушения лабораторных показателей гомеоста за при окислительном стрессе, вызванном острыми отрав лениями психофармакологическими средствами, этано лом, веществами прижигающего действия 118
ГЛАВА V. Динамика показателей окислительного стресса при острых отравлениях 139
5.1. Динамика показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при отравлениях психофармакологическими средствами легкой степени 139
5.2. Динамика показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях психофармакологическими средствами средней степени тяжести 140
5.3. Динамика показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях психофармакологическими средствами тяжелой степени 142
5.4. Изменение показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при развитии инфекционных осложнений
соматогенной стадии отравления психофармакологическими средствами и их неблагоприятном исходе 145
5.5. Динамика показателей перекисного окисления липидов и антиокси-дантной системы при острых отравлениях веществами прижигающего действия 155
5.6. Изменение показателей перекисного окисления липидов и антиокси-дантной системы при развитии осложнений и неблагоприятном исходе отравлений веществами прижигающего действия 160
ГЛАВА VI. Влияние методов лечения острых отравлений психофармакологическими средствами, этанолом, вещества ми прижигающего действия на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы 166
6.1. Влияние методов детоксикации на показатели перекисного гомеостаза в токсикогенной стадии острых отравлений 166
6.2. Влияние методов лечения на показатели перекисного гомеостаза в соматогенной стадии острых отравлений 180
VII. Заключение 195
Выводы 221
Практические рекомендации 224
Список сокращений 226
Список литературы
- Способы оценки состояния про- и антиоксидантной систем организма
- Методы определения показателей гемореологии, иммунитета, лабораторных показателей эндотоксикоза
- Зависимость нарушений процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях психофармакологическими средствами разной степени тяжести от вре-мени,прошедшего между приемом токсиканта и началом специализированного лечения
- Динамика показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях психофармакологическими средствами тяжелой степени
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Острые химические отравления являются важным фактором, определяющим демографическую ситуацию за счет высокой заболеваемости и смертности, прежде всего лиц трудоспособного и репродуктивного возраста (Медицинская токсикология: нац. рук-во., 2012; Ю.Н.Остапенко и соавт., 2013; Ю.Л.Гладченко и соавт., 2013). В структуре острых экзотоксикозов наибольшая доля приходится на отравления лекарственными препаратами, спиртами, веществами прижигающего действия, которые в зависимости от региона составляют 27,7-55,3%, 18,7-39,1%, 6,2-12,3% соответственно (А.В.Мартынов и соавт., 2013; В.Г.Сенцов и соавт., 2013).
Стационарная летальность, несмотря на достигнутые успехи в лечении данного контингента больных остается на высоком уровне (Медицинская токсикология: нац. рук-во, 2012) и достигает 30-45% при развитии госпитальной пневмонии. (К.К. Ильяшенко, Е.А.Лужников, 2004).
Известно, что в патогенезе острых экзотоксикозов принимают участие нарушения различных функций и систем организма, однако сведения о роли перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы (АОС) носят немногочисленный характер, часто отражающий результаты экспериментальных исследований, либо рассматриваются только отравления тяжелой степени.
Согласно современным представлениям в адаптационной перестройке организма во время экстремальных воздействий самым быстродействующим звеном является усиление окислительных процессов. Оно способствует изменению энергетического обмена, запускает реакции ПОЛ, стимулирует компенсаторную активность АОС, т.е. выполняет важную регуляторную функцию, и при адекватной стимуляции приводит к повышению резистентности организма (Ф.З. Меерсон и соавт., 1988; В.А.Барабой и соавт., 1992, Arkhipenko Yu.V. et al., 1997, В.В.Мороз и соавт., 2001). В то же время, неконтролируемая активация свободно-радикальных окислительных процессов расценивается как основной патогенетический фактор многих заболеваний и патологических состояний, сопровождающихся нарушением барьерных функций клеточных мембран и напряжением регуляторных систем (Рябов Г.А. и соавт., 2002; В.В.Мороз и соавт, 2003, 2013, В.Т.Долгих и соавт., 2006; Е.Е.Дубинина, 2006; Е.Б.Меныцикова и соавт., 2007, С.В.Пирожков, 1997).
Окислительный стресс (ОС) приводит к необратимой инактивации ферментов, структурной и функциональной перестройке клеточных мембран, изменению их
проницаемости, вплоть до разрыва, и в конечном итоге - к гибели клеток. Показано, что у больных реанимационного профиля свободно-радикальные процессы протекают наиболее интенсивно, а защитные механизмы, направленные на связывание токсичных метаболитов, снижены (М.М.Абакумов и соавт., 2000; И.Н.Пасечник и соавт. 2001; Л.Г.Шикунова и соавт., 2001; Н.В.Сачков, Н.М.Федоровский, 2007; С.П.Лапшин и соавт, 2007, А.В.Власенко, 2011).
Особое значение процессы ПОЛ и состояние антиоксидантной системы имеют в патологии острых химических отравлений. Мембраны эндоплазматического ретикулума, где происходит гидроксилирование ксенобиотиков, и мембраны митохондрий, осуществляющие синтез АТФ, функционируют в условиях, способствующих окислительной деструкции мембранных липидов за счет высокого уровня потребления кислорода, протекания многочисленных биохимических процессов, которые сопровождаются генерацией активных форм кислорода. В то же время окислительный метаболизм ксенобиотиков необходим, поскольку является неотъемлемой частью естественных детоксикационных процессов организма. Активацию свободно-радикальных процессов, в частности ПОЛ, принято считать одним из ведущих общих механизмов токсичности (С.П.Голиков и соавт., 1986). В связи с этим важно определить допустимый уровень дисбаланса между про- и антиоксидантными процессами и необходимый объем лечебных мероприятий по его коррекции.
Анализ данных литературы свидетельствует о том, что нарушения ПОЛ и АОС при острых отравлениях исследованы, большей частью, на экспериментальном уровне (С.И.Глушков, 1998; В.А.Мышкин, Д.А.Еникеев, 2009), а в условиях клиники изучены в меньшей степени: часто ограничены отдельными токсикантами или одной группой токсикантов, рассматривают преимущественно отравления тяжелой степени, исследования не несут системного подхода в оценке ОС (Б.В. Батопыренов, 1998; СИ. Глушков, 2002; Н.А.Калянова, 2002; В.В.Тютиков и соавт., 2000, Г.А.Ливанов и соавт., 2010). В недостаточном объеме изучено влияние лечебных технологий, используемых в терапии острых отравлений, на показатели ПОЛ и АОС, что необходимо для обоснования их применения с позиции патогенетической направленности.
В связи с этим исследования, направленные на выявление и уточнение механизмов развития окислительного стресса (ОС) и его роли в патогенезе острых отравлений и их осложнений, с целью совершенствования лечебных технологий, несомненно являются актуальными.
Цель работы: выявление механизмов формирования окислительного стресса и его роли в течении наиболее распространенных острых отравлений, обоснование принципов его коррекции с целью совершенствования лечения этих заболеваний.
Задачи:
1. Показать возможность использования интегрального показателя дисбаланса в системе
перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы - коэффициента К - для оценки интенсивности окислительного стресса при наиболее распространенных острых отравлениях.
2. Оценить изменения показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной
системы крови при острых отравлениях психофармакологическими средствами (ПС), этанолом, веществами прижигающего действия (ВПД) разной степени тяжести;
-
Изучить нарушения лабораторных показателей гемореологии, клеточных и гуморальных факторов иммунитета, маркеров эндогенной интоксикации при окислительном стрессе различной тяжести, вызванном острыми отравлениями психофармакологическими средствами, этанолом, веществами прижигающего действия.
-
Определить роль нарушений в системе ПОЛ-АОС крови в патогенезе острых отрав-
лений на этапах развития интоксикации с учетом комплексной оценки нарушений показателей гемореологии, иммунитета, маркеров эндогенной интоксикации.
5. Выявить характер нарушений в системе ПОЛ-АОС при развитии осложнений и не
благоприятного исхода наиболее распространенных острых отравлений.
6. Оценить влияние различных лечебных технологий, применяемых при острых отрав
лениях психофармакологическими средствами, этанолом, веществами прижигающе
го действия, на показатели ПОЛ-АОС крови.
7. Разработать принципы коррекции нарушений показателей перекисного гомеостаза при
наиболее распространенных острых отравлениях.
Научная новизна
На основании комплексной оценки изменений показателей ПОЛ и АОС крови, гемореологии, клеточных и гуморальных факторов иммунитета, альбуминового теста и маркеров эндогенной интоксикации объективно установлено место окислительного стресса в системном ответе организма на острую химическую травму разной тяжести и определена его роль в патогенезе наиболее распространенных острых отравлений.
Установлена информативная значимость коэффициента К, являющегося интегральным показателем баланса в системе ПОЛ-АОС крови, для количественной оценки интенсивности окислительного стресса, прогноза и исхода острых отравлений психофармакологическими средствами, этанолом, веществами прижигающего действия.
Впервые обнаружено, что в первые часы острой химической травмы, в среднем, у 30% больных в дальнейшем с благоприятным течением отравлений коэффициент К имеет нормальные или незначительно сниженные значения за счет высоких уровней компонентов антиоксидантнои защиты, что можно рассматривать как адекватный компенсаторный ответ организма на острую химическую травму.
Проведена токсикометрическая оценка интенсивности окислительного стресса у больных с отравлениями различными психофармакологическими средствами, выявлено и объяснено нарушение линейной зависимости между концентрацией токсикантов и величиной коэффициента К.
Продемонстрировано, что интенсивность окислительного стресса выше при отравлениях веществами, в процессе биотрансформации которых образуются активные метаболиты, способные вступать в радикальные реакции.
Объективно подтверждена зависимость интенсивности окислительного стресса от временного и возрастного факторов у изучаемого контингента больных.
Сформулирована концепция окислительного стресса при наиболее распространенных острых отравлениях, отражающая роль в его развитии специфических и неспецифических факторов, а также место самого окислительного стресса в патогенезе экзотоксико-зов, которая явилась основанием для научно-обоснованных принципов его коррекции.
Теоретическая и практическая ценность полученных результатов
Выявление роли окислительного стресса в системном ответе организма на острую химическую травму различной тяжести имеет как общее медико-биологическое, так и клиническое значение, поскольку расширяет представления о патогенезе острых химических отравлений и обеспечивает направленный поиск патогенетически обоснованных способов ее терапии.
Определены информативные показатели системы перекисного окисления липидов-антиоксидантной системы в оценке риска развития пневмонии, как основного осложнения острых отравлений, исхода заболевания и эффективности проводимого лечения.
С учетом механизмов развития окислительного стресса и влияния на показатели ПОЛ и АОС крови медицинских технологий, применяемых в лечении острых отравлений, разработаны научно обоснованные рекомендации для коррекции этих параметров.
Положения, выносимые на защиту
-
Активация перекисного окисления липидов в токсикогенной стадии острых отравлений происходит под действием как специфических факторов, отражающих особенности токсического действия и метаболизма ксенобиотиков, так и неспепифических, обусловленных нарушением вязкостных и агрегационных характеристик крови, высокой метаболической активностью нейтрофилов, нарастанием в крови уровней циркулирующих иммунных комплексов, веществ средней молекулярной массы, снижением связывающей способности альбумина, что способствует развитию и усилению дисбаланса в системе ПОЛ-АОС. По мере нарастания интенсивности окислительного стресса усиливается его негативное влияние на указанные лабораторные показатели гомео-стаза. При тяжелой степени интоксикации он занимает ведущее место в системном ответе организма на острую химическую травму и в патогенезе отравления.
-
При острых отравлениях психофармакологическими средствами, этанолом, веществами прижигающего действия коэффициент К - интегральный показатель баланса в системе ПОЛ-АОС, а также нарушения отдельных показателей и АОС, являются дополнительными объективными критериями для оценки тяжести отравления, развития осложнений и исхода заболевания.
-
Лечебные технологии, используемые при острых отравлениях психофармакологическими средствами, этанолом, веществами прижигающего действия не оказывают отрицательного влияния на показатели ПОЛ и АОС и не усиливают интенсивность окислительного стресса. Из них методом выбора для коррекции дисбаланса в системе ПОЛ-АОС является применение 2-зтжгі-6-метжгі-3-щдроксипиридина сукцината.
Степень достоверности и апробация работы
Высокая степень достоверности научных результатов основана на использовании современных методов исследования, адекватных поставленным задачам, и математической обработки данных, полученных при анализе значительного по объему клинического материала (528 пациентов с острыми отравлениями ПС, этанолом, ВПД различной тяжести и 30 здоровых добровольцев).
Материалы исследования доложены на Конгрессе «Национальные дни лабораторной медицины-2005» (Москва, 2005); городской научно-практической конференции «Диагностика и лечение токсикогипоксической энцефалопатии при острых отравлениях веществами психотропного действия» (Москва, 2005); Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), XIV Конференции Московского общества гемафереза «Трансфузионная и де-токсикапионная терапия при неотложных состояниях» (Москва, 2006); Всероссийской научной конференции с международным участием «Реаниматология - наука о критических состояниях» (Москва, 2006); ХШ Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006); 3-м съезде токсикологов России (Москва, 2008); на Московской ассамблее «Здоровье столицы» (Москва, 2008, 2009, 2010, 2011 г.г.); Научно-практической конференции «Методы детоксикапии организма при острых отравлениях» (Москва, 2010); Научной конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, Крым, 2012), II съезде врачей неотложной медицины (Москва, 2013).
Экспертиза материалов диссертации прошла на научной конференции в рамках заседания проблемно-плановой комиссии №7 «Острые отравления» ГБУЗ г. Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В.Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы» с участием сотрудников отделения лечения острых отравлений, отдела клеточных и тканевых технологий, клинико-биохимической лаборатории экстренных методов исследования, лаборатории клинической иммунологии института, сотрудников ФГБУ Научно-практический токсикологический центр ФМБА России и кафедры клинической токсикологи ГБОУ ДПО Российской медицинской академии последипломного образования МЗ России.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в клиническую практику отделения лечения острых отравлений ГБУЗ г. Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В.Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы». Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре клинической токсикологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России. Опубликованы 5 методических рекомендаций и Информационное письмо, утвержденные департаментом здравоохранения г. Москвы.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 46 печатных работ, в том числе 18 статьей в изданиях, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 265 страницах, содержит введение, обзор литературы, 5 глав собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации. Текст иллюстрирован 54 таблицами и 15 рисунками. Библиография включает 339 источников, в том числе 272 отечественных и 67 зарубежных.
Способы оценки состояния про- и антиоксидантной систем организма
Одним из ведущих общих механизмов токсичности принято считать активацию свободно-радикальных процессов, в частности активацию ПОЛ.
ПОЛ протекает по свободно-радикальному цепному механизму. Необходимым условием его осуществления является наличие активных форм кислорода (АФК), металлов переменной валентности, субстратов окисления, в качестве которых выступают полиненасыщенные жирные кислоты (ГГНЖК) и фосфоли-пиды (ФЛ) биологических мембран [34, 251, 277, 299, 300].
Окислению подвергаются в первую очередь ГГНЖК с 6, 4, 2 сопряженными двойными связями, в результате чего образуются липоперекиси и радикалы. Следует отметить, что радикальным окислительным атакам подвергаются не только липиды, но и белки, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, однако образующиеся при этом радикальные формы пептидов, нуклеиновых кислот, углеводов, в отличие от липидных радикалов, не вступают в самоиницируемые и самоускоряющиеся реакции [34, 73, 167, 180, 277, 282]. Скорость образования свободных радикалов липидов зависит от структурной организации липидного бислоя мембраны: чем плотнее «упаковка» ПНЖК и ФЛ, тем сложнее доступ АФК и ниже скорость зарождения радикалов. Поэтому любые воздействия, нарушающие структурную целостность ПНЖК, вызывающие изменение состава ФЛ мембран, могут существенно влиять на общую скорость ПОЛ [209,214,232,277,299].
В физиологических условиях стационарный уровень ПОЛ является жизненно важным для регуляции барьерных и транспортных функций клеточных мембран, синтеза простаноидов, метаболизма катехоламинов, стероидов, диф-ференцировки и деления клеток и других клеточных механизмов. Особое зна 15 чение ПОЛ играет в обновлении мембран клеток и поддержании посредством этого структурного гомеостаза [34, 58, 167, 188, 214, 221].
В норме ПОЛ протекает на крайне низком уровне, что предохраняет организм от накопления токсичных продуктов (липоперекисей, альдегидов, кетонов, др.) в цитотоксических концентрациях.
Анализу АФК, их генерации, адаптивному и токсическому действию посвящены в настоящее время многочисленные монографии и обзоры отечественной и зарубежной литературы [13, 34, 58, 73,166,167,180,214,217,271,274,299, 300].
Согласно современным представлениям все свободные радикалы можно разделить на 3 категории в зависимости от происхождения и биологического действия:
Первичные - образуются при одноэлектронном окислении. Эти радикалы функционируют в нормальных физиологических условиях и принимают участие в различных биохимических процессах, происходящих в здоровом организме, выполняя жизненно важные функции. Первичные радикалы не обладают мембрано-токсичностью и не оказывают патогенного действия. Более того, они участвуют в жизнедеятельности живой клетки и их устранение может способствовать развитию негативных явлений, нарушению её нормального функционирования.
Вторичные - образуются из первичных в результате развития цепных реакций ПОЛ. Это гидроксильные и липидные радикалы, которые возникают при разложении перекиси водорода и липидных перекисей под действием Fe2+ (реакция Фентона). Они способны оказывать на клетку сильнейшее мутагенное и цитотоксическое действие, вызывая повреждение нуклеиновых кислот, инактивацию ферментов, продолжают реакции ПОЛ.
Третичные - образуются при взаимодействии вторичных радикалов с молекулами антиоксидантов и других легкоокисляющихся веществ. Они обладают малой реакционной активностью. Но следует помнить, что, хотя и происходит замедление процессов ПОЛ, общее содержание радикальных соединений в системе при этом не меняется. В живых системах существуют два принципиально разных источника АФК: радикальное окисление и ферментативные металлопротеиновые системы.
Пусковым моментом, инициирующим процесс СРО, является образование супероксид-анион-радикала О/. Он способен как отдавать, так и принимать электроны, хотя в большинстве биологических процессов выступает донором электронов. В физиологических условиях является довольно слабым окислителем, не способным непосредственно инициировать процессы ПОЛ, однако в результате последовательных реакций с участием ферментов и ионов металлов переменной валентности он дает начало высоко реактивным гидроксильному и пероксильному радикалам, синглетному кислороду, гипогалогенитам, оксидам азота, обладающим достаточной энергией для разрыва межуглеродных связей и образования первичных липидных радикалов.
Супероксидный радикал в клетках является промежуточным продуктом многих биохимических реакций, таких как окисление тиолов, хинонов, флавинов, катехоламинов и др., а также метаболизма ксенобиотиков. Основным его источником служат ферментативные системы: НАДФН-оксидаза фагоцитирующих клеток, ксантиноксидоредуктаза, микросомальные монооксигеназы и др. [10, 21, 31,34,83,167,273,303,313].
Впервые связь метаболического (респираторного) «взрыва», наблюдаемого при стимуляции фагоцитирующих клеток, с продукцией О2 мембраносвязанной НАДФН-оксидазой показана в 1973 г. Бебиором Б.М. и соавт.[273]. Установлено, что до 90% кислорода, потребляемого в процессе развития метаболического взрыва стимулированными нейтрофилами, расходуется на образование О/.
Его генерация при активации НАДФН-оксидазы фагоцитов играет важную роль в реализации антимикробного, цитотоксического, иммунорегуляторного действия последних. О/участвует в наработке пептидов хемотаксиса, индуцирует синтез интерлейкин-1-подобного фактора, усиливает митогенстимулирующую пролиферацию лимфоцитов. О 2 малоактивный радикал и не влияет на функционирование большинства ферментов, однако может инактивировать каталазу, глютатионпероксидазу, креатинин фосфокиназу, др. [94, 167]. О 2 окисляет липопротеины сыворотки и ФЛ мембран, что приводит к разрушению эритроцитов, выходу лизосомальных ферментов и образованию цитотоксинов [277, 290, 313, 332].
Кроме того, он может окислять Fe в Fe в молекулах гемоглобина, превращая их в метгемоглобин, тем самым снижая кислородтранспортную функцию крови, а также может производить обратное действие - восстанавливать гемоглобин [175, 307].
Относительно механизмов цитотоксичности О2 существуют различные мнения: некоторые исследователи считают, что он не обладает непосредственной активностью, а служит пусковым звеном в каскаде реакций, приводящих к образованию других более активных форм кислорода [167, 317].
Существует также гипотеза, что О2 служит мембранным модулятором, изменяющим свойства фосфолипидного бислоя, облегчая доступ другим активным соединениям к гидрофобной внутренней части клеточной мембраны и повышающим ее вязкость [277, 326]. О2 необходим клеткам для быстрой перестройки мембраны и активного поглощения, а непосредственно микробицидной активностью обладает в большей мере пероксид, чем (9/.
Генерация АФК может происходить и в нефагоцитирующих клетках. Явления, имеющие общие черты с «респираторным взрывом», наблюдали при стимуляции В- и Т-лимфоцитов в эндотелиальных клетках в ответ на действие цитокинов, брадикинина, ангиотензина II и др. [310, 322, 325, 328]. Было показано, что эти эффекты не были напрямую связаны с цитотоксичностью лимфоцитов (киллерных клеток) и образование АФК происходило преимущественно в цикле окисления арахидоновой кислоты [167, 180, 217]. При этом генерируемый нефагоцитирующими клетками О2 играет в большей степени регуляторную, сигнальную роль, а не цитотоксическую [156, 313].
Методы определения показателей гемореологии, иммунитета, лабораторных показателей эндотоксикоза
Метод определения диеновых коньюгатов Определение ДК проводили в гексановых экстрактах сыворотки крови с помощью спектрофотометрии [93].
Для проведения анализа в стеклянные пробирки (опыт) отмеряли 0,5 мл сыворотки, добавляли 0,5 мл дистиллированной воды, пробирки встряхивали. В контрольную пробирку сразу вносили 1 мл дистиллированной воды. Затем в каждую из пробирок добавляли 1 мл этанола, пробирки встряхивали и к полученной смеси добавляли 2 мл гексана. В работе использовали очищенные однократной перегонкой этанол и гексан. После этого содержимое пробирок интенсивно перемешивали на лабораторном горизонтальном встряхивателе LT-1 (фирма «Kavalier», Чехословакия) под углом 45 градусов в течении 20 мин. Разделение фаз осуществляли центрифугированием при 1500 g в течение 15 мин. Для исследования брали верхнюю гексановую фазу в объёме 1,5 мл. В полученном гекса-новом экстракте определяли содержание ДК по разности оптической плотности между опытными и контрольной пробами при длине волны 233 нм. Поскольку содержание продуктов ПОЛ в гексановом экстракте зависит от количества экстрагированных липидов, содержание ДК пересчитывали на липиды.
Метод определения содержания общих липидов в гексановом экстракте Количество общих липидов в гексановом экстракте определяли фосфовани-линовым методом с использованием наборов фирмы «Lachema» (Чехия). Использовали гексановый экстракт, оставшийся после определения ДК и ТФ. В пробирки с опытными пробами помещали по 0,2 мл гексанового экстракта и 1,5 мл концентрированной серной кислоты. В контрольные пробирки добавляли только по 1,5 мл серной кислоты. В пробирки с контролем на гексан помещали по 0,2 мл перегнанного гексана и по 1,5 мл концентрированной серной кислоты, а в эталонные пробирки вносили по 20 мкл эталонного раствора из набора, 0,2 мл перегнанного гексана и 1,5 мл концентрированной серной кислоты. Пробирки тщательно перемешивали и ставили в кипящую водяную баню на 15 мин, не закрывая пробками. После этого пробирки охлаждали под током холодной воды до комнатной температуры, брали из каждой пробирки по 0,2 мл гидролизата в чистую пробирку и добавляли туда по 3 мл реактива для липидов (из набора). Содержимое пробирок тщательно перемешивали и инкубировали 40 мин при комнатной температуре в темном месте. Измеряли светопоглощение при длине волны, равной 530 нм против контроля. Полученная величина характеризовала суммарное содержание липидов в 1 мл гексанового экстракта.
Метод определения ТБК-реагирующих субстанций (малонового диальдегида) Определение в сыворотке крови содержания вторичных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) и других ТБК-реагирующих субстанций, проводили спектрофлуориметрическим методом после реакции с тиобарбитуровой кислотой, по методике В.Б. Гаврилова и соавт. [47] с небольшими изменениями. Для проведения анализа в стеклянные пробирки (опыт) вносили 0,1 мл сыворотки, 1,5 мл 1% ортофосфорной кислоты (рН=2,0) и 0,5 мл 0,67% тиобарбитуровой кислоты. Пробирки встряхивали. В контрольную пробирку вместо сыворотки вносили 0,1 мл дистиллированной воды. Затем опытные и контрольную пробирки инкубировали 45 мин в кипящей водяной бане. После этого пробирки охлаждали в токе холодной воды до комнатной температуры, добавляли в каждую из них по 2 мл н-бутанола и содержимое пробирок интенсивно перемешивали на лабораторном горизонтальном встряхивателе под углом 45 градусов в течение 15 мин. Разделение фаз осуществляли центрифугированием при 1500 g в течение 15 мин. Для исследования брали 1,5 мл верхней бутанольной фазы.
Для определения концентрации МДА записывали спектр флуоресценции бута-нольного экстракта на спектрофлуориметре RF-5000 «Shimadzu» (Япония) при длине волны возбуждения, равной 515 нм и длине волны флуоресценции, равной 545 нм. Об уровне МДА судили по интенсивности флуоресценции. При проведении флуоресцентных измерений для приготовления стандартной пробы в реакционную смесь добавляли вместо воды 0,1 мл 5 10 6М раствора І. І.З. 3-тетраметоксипропана (фирма «Merck», ФРГ), что соответствовало содержанию 1 нмоль МДА в пробе. Далее, все этапы проводились так же, как с опытными и контрольной пробами. Концентрацию МДА (С) рассчитывали по формуле: где F0 Fk и FST - интенсивность флуоресценции опытной, контрольной и стандартной проб, соответственно; А - концентрация МДА стандартного раствора (1 нмоль/мл). Метод определения степени окисленности липидов
Степень окисленности (СО) липидов сыворотки крови определяли по соотношению величины поглощения липидного экстракта при длине волны, равной 233 нм, к величине его поглощения при длине волны, равной 218 нм [21]. Метод определения концентрации альфа-токоферола
Определение содержания ТФ в сыворотке крови проводили по методике D.E.Duggan [289] с небольшими изменениями. Для этого осуществляли экстракцию липидов и липидных компонентов при помощи системы растворителей: во-да-этанол-гексан, с последующей спектрофлуориметрией гексановой фазы. Методика проведения анализа: в стеклянные пробирки (опыт) отмеряли 0,5 мл сыворотки, добавляли 0,5 мл дистиллированной воды, пробирки встряхивали. В контрольную пробирку сразу вносили 1 мл дистиллированной воды. Затем в каждую из пробирок добавляли 1 мл этанола, пробирки встряхивали и к полученной смеси добавляли 2 мл гексана. В работе использовали очищенные однократной перегонкой этанол и гексан. После этого содержимое пробирок интенсивно перемешивали на лабораторном горизонтальном встряхивателе LT-1 (фирма «Kavalier», Чехословакия) под углом 45 градусов в течение 20 мин. Разделение фаз осуществляли центрифугированием при 1500 g в течение 10-15 мин. Для исследования брали верхнюю гексановую фазу в объёме 1,5 мл. Для определения содержания ТФ проводили измерение флуоресценции верхней гексановой фазы при длине волны возбуждения, равной 295 нм, и длине волны флуоресценции, равной 330 нм, на спектрофлуориметре RF-5000 «Shimadzu» (Япония).
Зависимость нарушений процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях психофармакологическими средствами разной степени тяжести от вре-мени,прошедшего между приемом токсиканта и началом специализированного лечения
Содержание МДА при увеличении числа пораженных отделов ЖКТ снижалось, статистически значимо различаясь в группах I и III. Степень окисленности была снижена во всех группах, но у больных с химическим ожогом трех органов этот показатель был выше, чем в сравниваемых группах.
Наиболее высокие уровни компонентов АОС были отмечены в группе I: концентрации ТФ в 3 раза, а ЦП - в 1,2 раза статистически значимо превышали норму. С увеличением протяженности ожогового поражения антиокислительный потенциал крови переставал соответствовать высокой активности процессов пероксидации, что можно расценивать как напряженность АОС. Значения показателей ТФ и ЦП в группах больных с поражением двух и более органов практически не отличались от нормальных. Концентрации ТФ были достоверно ниже в 2,5 и 2,1 раза в группах II и III, соответственно, по сравнению с таковыми в I группе.
Дисбаланс в системе ПОЛ-АОС с преобладанием продуктов пероксидации был наиболее выражен у пациентов III группы: коэффициент К у них был в 6,3 раза выше нормы и в 2,5 раза - чем при поражении одного органа. Следовательно, протяженность химического ожога ЖКТ ведет к прогрессированию дисбаланса в системе ПОЛ и АОС с преобладанием перекисных процессов.
Следует отметить, что так же, как при отравлениях другими токсикантами, были лица, у которых показатель дисбаланса К находился ниже нормы. Доля лиц с низкими значениями К составила 20% при отравлениях ВПД с поражением одного органа и 27% - при поражении двух органов, в случае ожога трех и более отделов ЖКТ лиц с низкими значениями К не было выявлено.
В таблице 18 показано состояние системы ПОЛ и АОС у больных с отравлениями ВПД при поражении одного отдела ЖКТ с различными значениями коэффициента К.
Она демонстрирует, что у лиц с низким коэффициентом К были увеличены как показатели ПОЛ, так и АОС. Наблюдался рост концентрации ТФ в 3,7 раза и ЦП на 28% относительно нормы. Показатель дисбаланса К достоверно не отличался от нормы, в среднем находясь ниже этого уровня. Вероятно, представителей этой подгруппы следует рассматривать, как лиц, адекватно реагирующих на выраженную химическую травму с сохраненным уровнем компенсаторных механизмов. У всех пациентов этой подгруппы наблюдался химический ожог пищевода, у одного он сочетался с алкогольным отравлением легкой степени.
Во второй подгруппе наблюдалось увеличение концентрации ДК - в 3,4 раза, МДА - в 2,2 раза. Ответ АОС был менее выражен: концентрация ТФ статистически значимо отличалась от одноименного показателей в группе сравнения, тем не менее, достоверно превышала норму в 2,5 раза. Это приводило к дисбалансу: коэффициент К в этой подгруппе превышал норму в 3,5 раза. В указанной подгруппе также преобладали лица с химическим ожогом пищевода, у трех больных диагностировали изолированный ожог желудка. У 4 пациентов с отравлениями уксусной эссенцией обнаруживались признаки гемоглобинемии -концентрация свободного гемоглобина в крови составила, в среднем, 4,5 мг/мл.
Как видно из таблицы, в обеих подгруппах наблюдалась активация ПОЛ. В большей мере это происходило в группе с высокими значениями коэффициента К: значения ДК и степени окисленности липидов в 1,45 раза превышали величины одноименных показателей в группе сравнения. В подгруппе с низкими значениями коэффициента К наблюдалась большая активность АОС: концентрация ТФ статистически значимо превышала норму в 2,3 раза и в 2,5 раза соответствующий показатель в сравниваемой подгруппе. Активность ЦП в обеих подгруппах достоверно не отличалась от нормы, но была немного выше в подгруппе с низкими значениями К. В результате различия между подгруппами по коэффициенту К составили 6 раз.
Следует отметить, что в первой подгруппе, несмотря на высокие уровни всех измеряемых показателей, коэффициент К практически не отличался от нормы, оставаясь ниже неё, что указывало на сбалансированность процессов ПОЛ-АОС у этой категории больных.
На примере наиболее многочисленной группы лиц с химическим ожогом двух органов нами было проанализировано влияние возраста пациентов на выраженность дисбаланса в системе ПОЛ-АОС (таблица 20).
У лиц до 39 лет наблюдались наименее выраженный среди сравниваемых групп рост ДК и достаточно высокие показатели АОС. Это обеспечивало наименьший уровень дисбаланса в системе ПОЛ-АОС, хотя медианное значение коэффициента К составило 3,26.
У лиц старших возрастных групп признаки ОС были более выражены и по коэффициенту К они достоверно отличались от пациентов молодого возраста. Обращает на себя внимание, что основные различия между группами касались уровней первичных продуктов ПОЛ и ТФ, а концентрации МДА во всех рассмотренных возрастных группах практически не различались.
У больных пожилого и старческого возраста медианные значения уровней ДК и ТФ и показателя дисбаланса ПОЛ-АОС были ниже, чем в предыдущей сравниваемой группе. По нашему мнению, это свидетельствует о снижении защитных возможностей организма у лиц старшей возрастной группы и подтверждает закономерность, выявленную при обследовании пациентов с отравлениями ПС.
При острых экзогенных отравлениях ВПД воздействие токсиканта не является одномоментным, а продолжается по мере нахождения токсиканта и/или его активных метаболитов в организме. В этом случае токсикант не только является пусковым механизмом для развития реакции организма на стрессорное воздействие, но сам по мере резорбции продолжает воздействовать в течение времени, вызывая расстройства гомеостаза. Исходя из этого, важно было оценить влияние промежутка времени, прошедшего от приема ВПД до госпитализации больного, на выраженность ОС.
В основном больные поступали в сроки от 1 ч до 12 ч после отравления. Лишь у 7 пациентов экспозиция токсиканта превышала эти сроки, причем у двоих была более суток. Они были исключены из данного исследования.
Уровни показателей ПОЛ и АОС у больных с различной экспозицией токсиканта при острых отравлениях ВПД представлены в таблице 21.
При острых отравлениях средней тяжести все больные поступали в первые 3 часа после приема токсиканта. В этой группе уровни продуктов ПОЛ были ниже (р 0,05), чем у больных с тяжелыми отравлениями ВПД, поступающими в том же временном интервале. Концентрации компонентов АОС были самыми высокими среди рассматриваемых групп. В результате проявления дисбаланса в системе ПОЛ-АОС были наименее выраженными. У 6 больных дан Ill ной группы значения коэффициента К были ниже нормы, что указывало на эффективное сдерживание процессов ПОЛ у этих пациентов.
Динамика показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при острых отравлениях психофармакологическими средствами тяжелой степени
Величины факторных нагрузок показателей иммунитета ниже, чем у лиц с отравлениями легкой степени. Тем не менее, они достаточно высоки, значимы, присутствуют в I и II факторах и характеризуют как клеточные, так и гуморальные факторы иммунитета. Это можно расценивать как снижение детоксикаци-онной функции иммунной системы, что подтверждается изменениями в лейкоцитарной формуле - ЛИИ имеет достаточно высокие значения факторных нагрузок в I и II факторах.
Другим свидетельством напряженности в механизмах естественной де-токсикации является нарастающая эндогенная интоксикация, о котором говорят высокие факторные нагрузки ЭКА, ОКА в первом факторе и СЦИК, МЦИК, СМИ - во втором.
Перемещение вязкостных характеристик крови и плазмы во II фактор, в сочетании с возрастанием содержания фибриногена, и агрегационной активности эритроцитов (I фактор) указывает на нарушения кровотока как в мелких, так и более крупных сосудах, возникающие при этом уровне химической травмы. Все это создает условия для снижения доставки кислорода тканям и развития гипоксии, следствием чего может явиться усиление ПОЛ.
Из изложенного следует, что у пациентов с отравлением средней тяжести увеличивается роль ОС в патогенезе заболевания.
В случае химической травмы тяжелой степени (таблица 30) в системном ответе принимает участие наибольшее количество показателей, при этом подавляющее большинство из них входит в I фактор. Самые высокие факторные нагрузки имеют показатели ДК, МДА и К, в то время как характеристики анти-оксидантной системы - низкие, что отражает несостоятельность антиоксидант-ной защиты. Значимая факторная нагрузка для ЦП в третьем факторе, по-видимому, отражает его активное расходование в реакциях сдерживания ПОЛ, нарушение его продукции и высвобождения в кровь за счет снижения синтезирующей функции печени и гемодинамических нарушений. Все это свидетельствует о выраженном ОС, возникающем за счет нарастания в крови продуктов пе-роксидации на фоне недостаточной активности АОС.
Таким образом, при тяжелой степени химической травмы нарушения перекисного гомеостаза приобретают лидирующее значение в развитии патологического процесса.
Высокими нагрузками в I факторе отмечены гемореологические характеристики. Значительная длительная активация ПОЛ приводит к снижению деформируемости эритроцитов, увеличению их агрегационнои активности; параллельно растет агрегация тромбоцитов. Эти процессы отражаются в высоких факторных нагрузках показателей ИДЭ, АЭ и AT в I факторе.
Интенсивность ПОЛ поддерживается высокой метаболической активностью нейтрофилов. На это указывают большие факторные нагрузки и-НСТ- и НСТ-теста в первом факторе. Примечательно, что они сочетаются с умеренными нагрузками латекс-теста во втором. В целом по сравнению с отравлениями средней степени значимость иммунной системы в патологическом процессе выросла. Высокие факторные нагрузки показателей В-лимфоцитов, иммуноглобулинов классов М, G и ЦИК средних и, особенно, малых размеров свидетельствовали о перенапряжении и срыве регуляции как клеточного, так и гуморального звена иммунитета.
Перемещение факторных нагрузок ЦИК в 1 фактор может указывать не только на активацию иммунного связывания, но и на рост нарушений в системе выведения. Нарастание числа ЦИК связано с увеличением токсичных агентов экзогенного и эндогенного происхождения, в частности, вызванного усилением перекисных процессов. С другой стороны, особенностью ЦИК, в частности МЦИК, является способность повреждать ткани собственного организма, среди которых наиболее чувствительными к их действию являются почки и эндотелий кровеносных сосудов. Указанные процессы способствуют затруднению кровотока, изменению гемореологических показателей крови, нарушению экскреции эндо- и экзотоксикантов и дальнейшему нарастанию окислительных процессов.
В системном ответе организма на тяжелую химическую травму участвуют также серотонин и гистамин (0,58 и 0,63 в 1 факторе) как «стресс лимитирующие» факторы. Их выброс из депо в кровь в ответ на раздражение или повреждение направлен на преодоление повреждающего воздействия. Однако возникающее на этом уровне химической травмы чрезмерное повреждение приводит к инверсии их активности в направлении патогенеза - усилению выраженности коагулопатии, воспаления, лейкоцитоза, активации кислородза-висимого метаболизма клеток крови.
Указанные процессы протекают на фоне истощения механизмов естественной детоксикации: снижения доли молекул альбумина, способных к связыванию токсикантов, (ЭКА в I факторе, РССА - во II факторе), роста СМП и КЭИ, в целом (высокие нагрузки во II факторе).
Полученные результаты показывают, что при тяжелой степени химической травмы и высоком уровне ОС наблюдается конкурентное доминирование различных систем в патогенезе отравления. Чрезмерная активация перекисно-го окисления поддерживается нарушениями в функционировании рассмотренных систем, а продукты пероксидации, в свою очередь, способствуют нарушениям в деятельности этих систем, и истощению естественных механизмов защиты, вследствие чего, формируется «порочный патогенетический круг».
Резюме Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали, что при острых отравлениях роль ОС в системном ответе организма на химическую травму не однозначна. По мере нарастания интенсивности ОС проявляется прогрессирующее его негативное влияние на функционирование все большего числа систем организма. При отравлениях тяжелой степени оно достигает максимума, и ОС занимает ведущее место в патогенезе экзотоксикозов.