Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 11
1.1 Опухолевый супрессор ARF и его значение в канцерогенезе 11
1.1.1 Строение и биологическая значимость локуса INK4a/ARF 11
1.1.2 Cтруктурная организация и биохимические особенности белка ARF 12
1.1.3 Механизмы регуляции экспрессии локуса INK4a/ARF в опухолях человека 14
1.1.5 p53 - зависимые и p53 - независимые функции опухолевого супрессора ARF 19
1.2.1 Типы и механизмы аутофагии 25
1.2.2 Роль аутофагии в поддержании клеточного гомеостаза 29
1.2.5 Роль cелективной и неселективной аутофагии в канцерогенезе 38
ГЛАВА II. Методы исследования 47
2.1 Культивирование клеток 47
2.3 Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле 50
2.4 Трансформация компетентных клеток E. Сoli 51
2.5 Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток 52
2.6 Стабильная трансфекция клеток млекопитающих плазмидной ДНК 53
2.7 Иммуноблоттинг 54
2.8 Метод сайт-направленного мутагенеза 55
2.9 Иммуноцитофлюоресцентный анализ 56
2.10 Флоуцитометрический анализ мембранного потенциала митохондрий (Guava MitoPotential Assay) 57
2.11 Трансмиссионная электронная микроскопия 58
2.12 ПЦР в реальном времени 58
2.13 Инфицирование клеток ретровирусами 59
2.14 Выделение митохондрий 60
2.15 Методы статистического анализа 60
ГЛАВА III. Результаты исследований и их обсуждение 62
3.1 Определение участка митохондриальной локализации опухолевого супрессора p19ARF 62
3.2 Выявление участка белка p19/ARF, отвечающего за активацию неселективной аутофагии 68
3.3 Исследование роли C-концевого участка p14ARF в активации неселективной аутофагии в клетках человека 72
3.4 Влияние точеченых мутаций гена Ink4a/ARF, индуцируемых в опухолевых клетках человека, на ARF – опосредованную аутофагию 78
3.5 Изучение роли укороченной формы белка ARF – smARF в процессе митофагии 81
3.6 Оценка взаимного влияния экспрессии pARF и p53 на регулируемую ими аутофагию в клетке 90
Заключение 94
Выводы 101
Список литературы
- Строение и биологическая значимость локуса INK4a/ARF
- Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле
- Флоуцитометрический анализ мембранного потенциала митохондрий (Guava MitoPotential Assay)
- Исследование роли C-концевого участка p14ARF в активации неселективной аутофагии в клетках человека
Строение и биологическая значимость локуса INK4a/ARF
Значительные успехи в исследовании роли опухолевого супрессора ARF были достигнуты благодаря экспериментам на животных. Так, например, у трансгенных мышей с гомозиготной делецией локуса INK4a/ARF, приводящей к подавлению экспрессии обоих его белковых продуктов, наблюдается спонтанное развитие фибросарком и лимфом уже через 8 недель после рождения. Это приводит к смерти животных на первом году жизни [82]. Интересно, что подобный фенотип наблюдается и у мышей с делецией экзона 1 гена ARF, приводящей к блокированию экспрессии только белка ARF. Однако у мышей, имеющих сниженную экспрессию p16INK4a, но сохранивших экспрессию ARF, нет существенного повышения частоты возникновения опухолей, отмечается лишь редкое возникновение меланом [80, 187]. Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF), в которых инактивирован ген ARF, демонстрируют признаки иммортализации клеток. В отличие от нормальных MEF, подвергающихся репликативному старению уже на 10-15 пассаже, клетки с инактивированным геном ARF способны к неограниченному размножению in vitro («бессмертные» клеточные линии). Кроме того, указанные клетки легко трансформируются в опухолевые онкогенами семейства Ras, в то время как для трансформации нормальных клеток необходимо дополнительное действие комплементирующих онкогенов E1 или Myc [167]. Таким образом, потеря функции опухолевого супрессора ARF в некоторых случаях может заменить трансформирующее действие онкогенов и является важным фактором в канцерогенезе. Eischen и Cleveland исследовали роль ARF при развитии лимфомы Беркитта у трансгенных мышей Em-myc, у которых ген c-myc находится под контролем энхансера IgH. Усиленная экспрессия онкогена c-myc вызывает у этих мышей патологию очень сходную с лимфомой Беркитта у людей [102]. Оказалось, что первоначальная дерегуляция протооонкогена c-myc приводит к активации ARF-MDM2-p53 сигнального пути, что обеспечивает активацию апоптоза и предотвращает развитие опухоли на начальных этапах. Активный c-myc повышает селекцию в пользу иммортализованных клеток c спонтанной инактивацией ARF и p53, что приводит к неконтролируемому росту незрелых B-лимфоцитов и образованию лимфом. Потеря обоих аллелей гена ARF предшествовала развитию патологии и определялась в 24% лимфом [45].
Мыши с нокаутом гена ARF более подвержены развитию новообразований при воздействии канцерогенов по сравнению с диким типом мышей, что свидетельствует о защитной роли опухолевого супрессора ARF в борьбе с трансформацией нормальных клеток в опухолевые [80, 82]. Так как в результате делеции локуса 9p21 происходит потеря и p16 и ARF, предметом дискуссий многих лет остается вопрос: какой опухолевый супрессор данного локуса является ведущим в защите нормальных клеток. Эксперименты на животных показали, что мыши с отсутствием гена p16 или ARF имеют повышенную предрасположенность к спонтанному развитию опухолей по сравнению с диким типом мышей, в которых эти гены интактны. Однако частота развития опухолей у этих мышей была значительно меньше, чем у животных с одновременным отсутствием p16 и ARF, что говорит о взаимном вкладе этих опухолевых супрессоров в борьбе против канцерогенеза [107, 189]. Значимость p16 и ARF подтвердилась также у мышей с повышенной экспрессией этих генов. В этих условиях животные были в 3 раза устойчивее к развитию опухолей, чем интактные животные [132]. Мутации в экзоне 1, повреждающие функции только ARF, были обнаружены во многих случаях меланомы, глиобластомы, астроцитомы, аденокарциномы желудка и других типах опухолей [43, 145, 175, 211]. Наличие этих мутаций подтверждает роль ARF в канцерогенезе. Мутации в экзоне 1, нарушающие только функцию опухолевого супрессора p16, также были найдены во многих опухолях [51]. Однако оказалось, что подавляющее большинство мутаций в локусе INK4a/ARF происходит в экзоне 2, в котором гены p16 и ARF кодируются общей последовательностью ДНК. Это означает, что чаще всего оба гена инактивируются вследствие одного и того же повреждения [59, 82, 233].
Так как INK4a/ARF локус кодирует опухолевые супрессоры, играющие важнейшую роль в регуляции Rb и p53 сигнальных путей, неудивительно, что генетические аномалии данного локуса встречаются в 40% опухолей человека [79, 148, 179]. Необходимо подчеркнуть, что мутации - не единственный путь нарушения функции белка ARF в опухолевых клетках. Так, инактивация гена вследствие метилирования его промотора было зафиксировано в случаях гепатоцеллюлярной карциномы [15], карциноме нижней губы [193], раке почки [43], а также астроцитомах [211], эпендимомах [13, 178] и олигодендроглиоме [13, 216]. Перечень типов новообразований, в которых нарушена функция опухолевого супрессора ARF представлен в таблице1.
Гистологический тип опухоли Мутации гена ARF Частота встречаемости Ссылка на литературный источник карцинома желчного пузыря/общего желчного протока метилирование 46% [93] глиобластома делецииметилирование 58%67% [145][56] глиома делеции 41% [106] гепатоцеллюлярная карцинома делециимутацииметилирование 25%42%7% [75][72][15] наследственный неполипозный колоректальный рак метилирование 33% [220] злокачественная мезотелиома делеции 21% [156] злокачественные опухоли периферических нервов делеции 50% [101, 159] медуллобластома метилированиеделеции 14%10% [67][52] меланома делециимутации семейнаясемейная [108, 170] злокачественные опухоли полости рта делеции 22% [188] неходжкинская лимфома делеции мутации 11% [161] олигодендроглиальные опухоли метилирование 44% [13, 216] опухоли почек метилирование 17% [25] остеосаркома метилированиеделеции 47%9% [150][206] карцинома предстательной железы делеции 13% [97] острая лимфобластическая лейкемия делеции 100% [54] переходно-клеточная карцинома мочевого пузыря делеции 25% [182]
Наиболее изученной биологической функцией ARF является его роль в стабилизации опухолевого супрессора p53 [181]. Инактивация опухолевого супрессора p53 встречается в более 50% различных новообразований [74]. В отсутствие стресса низкий уровень p53 в клетке постоянно поддерживается белком MDM2 (HDM2 у человека). E3 убиквитин-лигаза MDM2 взаимодействует с N-концевым трансактивирующим доменом белка p53, что подавляет способность p53 активировать специфические гены-мишени, а также приводит к протеасомной деградации p53. Напротив, повышение экспресcии онкогенов RAS, MYC, E1A ведет к увеличению концентрации p53 и повышению его транскрипционной активности. Было замечено, что это приводит к значительному усилению экспрессии ARF, что обусловлено присутствием в гене INK4a респонсивных элементов для транскрипционного фактора E2F, активируемого многими онкогенами [153]. Роль ARF в регуляции p53 была окончательно установлена после обнаружения непосредственного взаимодействия между ARF и убиквитин лигазой MDM2. Оказалось, что ARF взаимодействует в ядрышках с MDM2, что прекращает перемещение MDM2 из ядрышек в нуклеоплазму и освобождает p53 от его ингибирующего влияния [152, 177, 202, 213]. В этой связи повышение экспрессии белка р19ARF в ответ на активацию онкогенов приводит к стабилизации p53 путем уменьшения скорости его деградации. Исследователи показали существование зависимости между активностью p53 и присутствием ARF в клетке [181]. Делеция ARF сопровождалась иммортализацией MEF in vitro и в опухолях in vivo и инактивация p53 в данном случае не требовалась [27, 82]. Это свидетельствует, что p53 и ARF функционируют в одном и том же сигнальном пути. p19ARF препятствовал MDM2-индуцированной трансформации MEF, но не проявлял никакого эффекта на клетки с отсутствием p53, что указывает на роль ARF в регуляции MDM2-опосредованной деградации p53 [162]. ARF подавляет все известные функции MDM2: способность ингибировать транскрипционную активность p53 [81, 198], убиквитинировать p53 [64], осуществлять транспорт p53 в цитоплазму для деградации белка протеасомой 26S [202, 213, 231]. Активированный р53 более стабилен и повышает транскрипцию в аномальных клетках генов-мишеней, приводящее к остановке клеточного цикла поcредством активации ингибитора циклинзависимых киназы - белка p21 [46] или апоптозу путем репрессии гена анти-апоптотического белка Bcl2 и активации генов про-апоптотических белков Bax, Puma и Noxa [210]. Делеция гена TP53 в клетках сопровождается значительным повышением экспрессии белка ARF. Напротив, внесение p53 обратно в эти клетки возвращает уровень ARF к его нормальным значениям [81, 198]. Было показано, что гены MDM2 и ARF сами являются транскрипционной мишенью р53, который увеличивает экспрессию MDM2, но подавляет экспрессию ARF [18, 217]. В результате устанавливается регуляторная петля, функционирующая по принципу отрицательной обратной связи (рис. 2). Исследования показали, что именно ARF-опосредованная активация p53 при воздействии онкогенов приводит к антиопухолевому действию белка [28, 44]. Таким образом, ARF является важнейшим регулятором ARF-p53-MDM2 сигнального пути, осуществляющего эффективную элиминацию аномальных клеток в борьбе против канцерогенеза. В клетках с нарушенной функцией ARF онкогенная стимуляция не сопровождается типичным ответом со стороны p53 и ведет к клеточной трансформации [181].
Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле
Амплификация проходила с использованием термостабильной Go Taq Flexy полимеразы в следующем режиме: 94C – 30 сек, 58C - 30 сек, 72C -30 сек на протяжении 17 циклов. Очистка продуктов ПЦР осуществлялась с помощью набора PCR product clean up (Promega, США) с последующей рестрикцией ДНК по сайтам HindIII и XhoI. Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в горизонтальном агарозном геле с буфером 1TAE в присутствии бромистого этидия. Для определения размера полученных фрагментов их сравнивали с коммерчески доступными ДНК известной длины (ДНК «линейка»). При наличии продукта ПЦР необходимого размера проводили его экстракцию из агарозы с помощью набора Zymoclean Gel DNA Recovery Kit, Zymo research, США по методике фирмы-производителя с последующим клонированием в плазмиду pGEM Easy (pGEM Easy Vector System, Promega, США). Использование данного вектора позволило повысить эффективность лигирования продуктов ПЦР и плазмиды, так как концы амплификатов содержат одиночный дезоксиаденозин комплементарный концевому тимидину в сайте клонирования вектора pGEM Easy. Затем проводили трансформацию компетентных клеток полученной рекомбинантной плазмидой с последующей селекцией клонов на основании их резистентности к ампициллину. Присутствие вставки и правильность нуклеотидной последовательности подтверждали секвенированием с использованием соответствующих праймеров. Для создания тетрациклин-зависимой экспрессии полученных укороченных форм фрагменты были встроены в конструкцию pcDNA 4/TO (Invitrogen, США), предварительно обработанную ферментами HindIII и XhoI. Сиквенс клонированных продуктов ПЦР в составе pcDNA 4/TO векторов осуществлялся на автоматическом сиквенаторе в University of Pennsylvania (США).
Для оценки размера фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез в 1,5% агарозном геле. Для этого, 1,5 грамма агарозы (Sigma, США) растворяли в 100 мл TAE буфера и нагревали в микроволновой печи до полного расплавления агарозы. После непродолжительного охлаждения раствора добавляли в него бромистый этидий до конечной концентрации 0,25 мкг/мл. Этот флуоресцентный краситель обеспечивает визуализацию ДНК при облучении ультрафиолетом благодаря способности связываться с молекулой ДНК в препарате. Раствор тщательно перемешивали и заливали в форму для геля, стараясь избегать образование пузырьков. Рядом с маркерной ДНК в лунки застывшего геля наносили образцы ДНК предварительно смешанные с буфером для нанесения (Gel loading dye blue, BioLabs, США) в соотношении 1:10. Электрофорез проводили в течение 45 минут при напряжении 75 вольт. Полоски ДНК в препаратах идентифицировали по флуоресценции в проходящем ультрафиолетовом свете при длине волны 260 нм. 50 мкл суспензии компетентных клеток (One Shot TOP10, Invitrogen, США) медленно размораживали в ледяной бане, а затем добавляли в нее 2мкг рекомбинантной ДНК. Смесь осторожно перемешивали и оставляли во льду на 30 минут. Затем клетки подвергали тепловому шоку в водяной бане (45C в течение 45 секунд) и остужали в ледяной бане в течение последующих 2 минут. После этого к суспензии клеток добавляли 900 мкл среды SOC (Invitrogen, США), содержащей 100 мкг/мл ампициллина для обеспечения селекции и инкубировали при 37C в течение одного часа. Полученные клетки высевали на чашки с агаром, содержащие соответствующий гену резистентности плазмиды антибиотик в концентрации 75 мкг/мл. Для этого отбирали 250 мкл клеточной суспензии и наносили ее на поверхность агара. После растирания суспензии стерильной петлей чашки переворачивали и помещали в термостат (37C) на ночь. На следующий день оценивали рост бактериальных клонов, несущих рекомбинантную плазмиду.
Отдельную колонию E. сoli, содержащую рекомбинантную плазмиду, переносили с чашки Петри в 5 мл среды LB с добавлением необходимого для селекции антибиотика и инкубировали при 37C в течение ночи. Для крупномасштабного выделения ДНК полученную культуру высевали в 300 мл среды LB и снова инкубировали при 37C в течение не менее 16 часов. Затем плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса с использованием набора GenElute HP Plasmid Maxiprep Kit (Sigma, США). Для этого среду с бактериями центрифугировали при 10000 g в течение 5 минут при 4C. Культуральную среду выливали, а осадок растворяли в 12 мл «Ресуспендирующего» раствора, содержащего ЭДТА для разрушения жесткой бактериальной стенки. Для денатурации геномной ДНК добавляли 12 мл «Лизирующего» раствора с последующим осторожным перемешиванием содержимого путем переворачивания пробирки в течение не более 5 минут. Затем для предотвращения деградации плазмидной ДНК добавляли 12 мл охлажденного «Нейтрализующего» раствора и перемешивали до образования творожистой смеси. Затем добавляли 9 мл «Связывающего раствора», который увеличивает эффективность связывания плазмидной ДНК с колонкой. Полученную смесь фильтровали через мини-колонки с силикатными фильтрами. Колонки дважды промывали 12 мл «Промывочного» раствора. Плазмидную ДНК получали путем нанесения на колонки 30 мл «Элюирующего» раствора с последующим центрифугированием колонки и сбором ДНК. Концентрацию выделенной ДНК измеряли спектрофотометрически на аппарате NanoDrop 2000. Образцы хранили при -20C.
Клетки, культивируемые в соответствующей питательной среде, рассеивали на чашки Петри (d=100мм). Трансфекцию клеток, находящихся при плотности монослоя 60%, проводили через 24 часа с использованием липотрансфецирующего агента Fugene 6.0 (Promega, США) по методике производителя. Использование данного реагента позволяет добиться высокой эффективности трансфекции при низкой токсичности для клеток. В пробирке объемом 1,5 мл смешивали 100 мкл подогретой до 37C безсывороточной среды Opti-MEM I (Gibco, CША), 6 мкл Fugene 6.0 и 2 мкг ДНК (соотношение объема реагента к количеству ДНК 3:1). После инкубации полученной смеси при комнатной температуре в течение 30 минут, ее добавляли в питательную среду к клеткам на 24 часа. Для получения стабильных клеточных линий клетки культивировали в течение 14 суток в присутствии антибиотика, соответствующего гену устойчивости используемой плазмиды. Так, селекцию клеток U2OS-ARF осуществляли в присутсвии 50 мкг/мл зеоцина, клеток U2OS-ARF-DsRed в присутствии 400 мкг/мл аминогликозидного антибиотика G418. Островки роста трансфецированных клеток, наиболее вероятно содержащих плазмидную ДНК, разделяли и культивировали отдельно. Уровень экспрессии интересующего белка в полученных клонах определяли методами Вестерн блоттинга и иммунофлюоресцентного анализа.
Флоуцитометрический анализ мембранного потенциала митохондрий (Guava MitoPotential Assay)
Такое изменение величины, формы и внутренней структуры митохондрий является одним из проявлений их деградации, в том числе и в процессе митофагии. Для проверки данного предположения мы сначала изучали накопление аутофагосом вследствие экспрессии smARF в клетках U2OS-smARF. Клетки трансфецировали вектором GFP-LC3, содержащим белок аутофагосом LC3 с зеленой меткой GFP. С использованием конфокальной микроскопии было выявлено, что активация smARF повышала количество клеток, содержащих более четырех GFP-положительных аутофагосом (рис. 22 – А, Б). Индукция wt ARF применялась в качестве позитивного, а 1-100 ARF в качестве негативного контроля образования аутофагосом в данном эксперименте. Так как активация деградации митохондрий сопровождается образованием аутофагосом, в которые доставляются поврежденные митохондрии, одним из методов изучения митофагии является исследование колокализации аутофагосом с митохондриями при окрашивании их разными флюорохромами методом конфокальной микроскопии. Следуя данной методике, мы трансфецировали клетки остеосаркомы U2OS-smARF вектором GFP-LC3 и окрашивали митохондрии красителем митотракером красным. Микроскопию полученной клеточной культуры проводили после инкубации клеток с доксициклином для повышения экспрессии smARF по сравнению с контролем. Индукция smARF вызвала окрашивание митохондрий в желтый цвет вследствие совпадения локализации зеленого (GFP) и красного (митотракер красный) спектров флуоресценции (рис. 22 - В). Это означает, что митохондрии локализованы в тех же субклеточных компартментах, что и зеленый белок аутофагосом и свидетельствует об активации митофагии.
smARF активирует митофагию. А – определение накопления GFP-LC3 вакуолей методом иммуноцитофлуоресцентного анализа в клетках U2OS-ARF предварительно трансфецированных вектором GFP-LC3 до и после повышения экспрессии wt ARF, smARF или 1-100 ARF. Б - таблица отражает количество GFP-LC3-позитивных клеток в образцах. В – изображения, полученные с помощью конфокальной микроскопии клеток экспрессирующих вектор GFP-LC3 и окрашенных красителем митотракером красным до и после индукции smARF.
Еще одним признаком митофагии является фрагментация митохондрий, которые формируют кластеры вокруг ядра. Для подтверждения вывода об активации smARF-опосредованной митофагии, мы провели конфокальную микроскопию клеток остеосаркомы после индукции в них smARF, окрашивания белка митохондрий Tom20 флюорохромом FITC и ядер красителем DAPI. Образование кластеров митохондрий в околоядерном пространстве клеток с повышенной экспрессией smARF наблюдалось у большинства клеток (рис. 23 - А).
Дополнительным критерием митофагии считается снижение общей массы митохондрий. Динамику уменьшения массы митохондрий, являющуюся, по мнению большинства исследователей, самым надежным признаком деградации митохондрий проводили с использованием красителя митотракера зеленого (от англ. MitoTracker Green). Преимуществом данного красителя является то, что он окрашивает митохондрии в независимости от их . Конфокальная микроскопия показала, что активация smARF в течение 48 часов существенно снизила зеленую флюоресценцию, ассоциированную с митохондриями (рис. 23 - Б). Кроме сильной деградации митохондрий клетки с суперэкспрессией smARF морфологически не отличались от контрольных.
Индукция smARF вызывает кластеризацию митохондрий в перинуклеарном пространстве и снижает их общую массу в клетке. А – конфокальная микроскопия клеток U2OS-smARF, инкубированных в присутствии доксициклина и обработанных антителами к Tom20 и ядерным маркером DAPI. Б – микроскопия клеток U2OS-smARF, инкубированных с доксициклином в течение 48 часов с последующей окраской митохондрий митотракером зеленым.
Как уже отмечалось выше, поврежденные митохондрии распознаются белком-адаптором аутофагии p62 и направляются в аутофагосомы для деградации. Мы провели количественный анализ белка p62 в изолированных митохондриях клеток остеосаркомы, инкубированных с доксициклином для индукции wt ARF или smARF, либо с активатором митофагии - CCCP в качестве положительного контроля к данному эксперименту. Инкубации клеток с CCCP вызывала накопление p62 на деполяризованных митохондриях обеих клеточных линий (рис. 24 - А). Однако только активация smARF, но не ARF, приводила к аккумуляции p62 на поврежденных митохондриях (рис. 24 - Б).
Рис. 24. Индукция smARF, но не ARF, приводит к аккумуляции адаптора аутофагии белка p62 на поврежденных митохондриях. Вестерн блоттинг анализ содержания белка p62 в митохондриальной фракции, выделенной из клеток U2OS-ARF и U2OS-smARF, инкубированных с 10 мкм протонофора СCCP (А) или с 100 нг/мл доксициклина (Б) для индукции wt ARF или smARF.
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод, что укороченная форма ARF (smARF) активирует селективную аутофагию - митофагию.
Мы предположили, что локализация smARF в митохондриях определяет его способность активировать митофагию. Чтобы проверить это предположение мы определили способность полноразмерного белка ARF активировать митофагию в случае, когда он полностью располагается в митохондриях. Для этого мы трансфецировали клетки остеосаркомы вектором OTC-ARF, в котором wt ARF слит с лидер-пептидом орнитин транскарбамилазы, способным напралять весь белок ARF в митохондрии (рис. 25 - А). Оценку уровня митофагии проводили по интенсивности флюоресценции митотракера зеленого методом конфокальной микроскопии. В результате данного эксперимента выяснилось, что wt ARF, расположенный в митохондриях, активирует митофагию поскольку снижал общее количество митохондрий в клетках (рис. 25 - Б).
Локализация опухолевого супрессора ARF в митохондриях определяет его способность к активации митофагии. А – определение экспрессии белка ARF в митохондриальной фракции клеток остеосаркомы, трансфецированных вектором OTC-ARF, методом иммуноблоттинга. Б – оценка уровня флюоресценции митотракера зеленого в клетках остеосаркомы, трансфецированных вектором OTC-ARF.
Одним из известных медиаторов митофагии является белок митохондрий NIX, способный направлять разобщенные митохондрии в аутофагосомы для деградации. Мы предположили, что активированный smARF взаимодействует с белком NIX в митохондриях, что опосредует процесс митофагии, вызванный индукцией smARF.
Исследование роли C-концевого участка p14ARF в активации неселективной аутофагии в клетках человека
Для доказательства роли укороченной формы ARF в индукции селективной аутофагии – митофагии мы использовали несколько подходов. Исследования показали, что повышение экспрессии smARF в клетке приводит к потере трансмембранного потенциала митохондрий, что сопровождается деполяризацией митохондрий [41]. Электронномикроскопическое исследование клеток U2OS-ARF выявило существенные нарушения структуры митохондрий – «набухание» органелл. По данным литературы такие повреждения митохондрий являются стимулом к селективной деградации митохондрий. Индукция smARF сопровождалась и другими признаками активации митофагии. Этим же методом была обнаружена фрагментация и кластеризация митохондрий в околоядерном пространстве и снижение общей массы митохондрий. Как известно, поврежденные митохондрии распознаются белком-адаптором аутофагии p62 и направляются в аутофагосомы для деградации. Мы провели количественный анализ белка p62 в изолированных митохондриях клеток остеосаркомы с повышенной экспрессией smARF. Было установлено, что индукция smARF приводит к аккумуляции p62 на поврежденных митохондриях.
Таким образом, полученные результаты, при всех используемых методических подходах, позволяют сделать вывод, что укороченная форма ARF (smARF) активирует селективную аутофагию – митофагию. Причем это связано исключительно с его митохондриальной локализацией. Об этом свидетельствует проведенный нами эксперимент по целенаправленному транспорту в митохондрии wt ARF. Полноразмерный ARF, как известно, активирует неселективную аутофаги в обычных условиях [5, 10]. Целенаправленный транспорт ARF в митохондрии путем использования вектора OTC-ARF приводил к потере общей массы митохондрий вследствие активации митофагии. Это свидетельствует, что именно митохондриальная локализация онкосупрессора, в частности smARF, определяет его функцию индуцировать митофагию. В настоящее время открытым остается вопрос какой фактор запускает распознавание митохондрий и инициирует митофагию. С помощью иммунопреципитации мы определили, что smARF взаимодействует с медиатором митофагии белком NIX, который облегчает транспорт «меченных» для деградации митохондрий в аутофагосомы. Логично предположить, что активация smARF деполяризует митохондрии и, таким образом, маркирует их для аутофагальной деградации, опосредованной белком NIX.
До настоящего времени исследования роли опухолевого супрессора ARF в аутофагии проводились только на примере мышиного белка p19ARF. В наших экспериментах мы определили способность ARF человека (p14ARF) к выполнению этой функции. Была подтверждена консервативность этой функции у человека и оказалось, что у обоих белков (p14ARF и p19ARF) за активацию аутофагии отвечает гомологичный участок С - конца молекулы (а.о. 100-120 в p19ARF, а.о. 140-173 в p14ARF). Несмотря на то, что аминокислотные последовательности белков мыши и человека перекрываются только на 50%, этот участок является одним из двух наиболее гомологичных участков p14ARF и p19ARF, функциональная значимость которого ранее была не известна. Кроме того, эта последовательность кодируется в экзоне 2 локуса INK4a/ARF, где встречается наибольшая частота мутаций в опухолях человека [181]. Мы экспериментально показали, что индукция подобных мутаций полностью блокирует спсобность опухолевого супрессора ARF к активации аутофагии в опухолевых клетках человека. Эти результаты согласуются с ранее полученными данными о том, что опухоль-ассоциированные мутации второго гена INK4a/ARF нарушают функцию ARF [69].
Пока остаются малоизученными p53-независимые функции ARF, хотя работа в этом направлении ведется активно в последние годы. В взаимоотношениях опухолевых супрессров ARF и p53 нерешенным, в частности, оставался вопрос: влияет ли активность опухолевого супрессора ARF на способность p53 активировать/подавлять ауофагию. Нами предпринята попытка рассмотреть некоторые механизмы взаимного влияния ARF и p53 в активации неселективной аутофагии. Во-первых, мы проверили как влияет присутствие p53 в клетке на ARF – опосредованную аутофагию. Опыты показали, что экспрессия гена ARF в клетках карциномы легких H1299, в которых отсутствовал p53, стимулировала накопление GFP в цитоплазматических вакуолях, что характерно для аутофагии. При электронной микроскопии этих клеток наблюдалось увеличение числа аутофагосом в цитоплазме. Эти результаты свидетельствуют, что активация неселективной аутофагии опухолевым супрессором ARF не зависит от экспрессии p53 в клетке. Известно, что ингибирование p53 приводит к активации аутофагии и увеличению уровня ARF [160]. В этой связи представлялось важным определить: может ли аутофагия, наблюдаемая при подавлении экспрессии p53, быть опосредована супрессором ARF. Для раскрытия подобной взаимосвязи мы провели опыты на фибробластах мышей в условиях блокирования экспрессии генов p53 и ARF. Установлено, что нокдаун p53 в клетках с нормальным функционированием гена ARF вызывало повышение экспрессии ARF и активацию аутофагии. Однако нокдаун гена p53 в клетках с отсутствием ARF не приводил к индукции аутофагии. Это позволило сделать вывод, что подавление экспрессии p53 активирует аутофагию вследствие индукции ARF.