Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. История исследования нейроиммунных взаимодействий 14
2.2. Участие гипоталамуса в механизмах нейроиммунных взаимодействий . 18
2.3. Нейропептиды орексин А и орексин В.. 24
2.4. Орексин-содержащие нейроны гипоталамуса в регуляции вегетативных функций организма.
2.4.1. Участие орексин-содержащих нейронов в регуляции пищевого поведения и потребления воды 30
2.4.2. Влияние системы орексин-содержащих нейронов на поддержание состояния бодрствования 34
2.4.3. Участие орексин-содержащих нейронов в процессах терморегуляции 35
2.4.4. Участие орексин-содержащих нейронов в регуляции функций эндокринной системы 37
2.4.5. Участие орексин-содержащих нейронов в механизмах реализации ответных реакций на стрессорные воздействия и в развитии стресс-индуцированных форм патологии 39
2.4.6. Участие орексин-содержащих нейронов в реакциях автономной нервной системы 41
2.4.7. Вовлечение системы орексин-содержащих нейронов в механизмы восприятия боли 42
2.5. Участие орексин-содержащих нейронов в механизмах модуляции
функций иммунной системы и в реакциях на введение антигена 43
2.6. Заключение 46
3. Материалы и методы исследования. 47
3.1. Экспериментальные животные, группы и схема эксперимента. 47
3.2. Иммуногистохимическое выявление орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов в гипоталамусе крыс 48
3.3. Определение количества и относительной оптической плотности орексин-содержащих нейронов в структурах гипоталамуса 49
3.4. Измерение уровня экспрессии гена препроорексина в гипоталами-ческих структурах крыс. 50
3.5. Электрофорез в агарозном геле 51
3.6. Термометрия. 52
3.7. Статистическая обработка данных 52
4. Результаты исследования 53
4.1. Общее количество орексин-содержащих нейронов на срезах
гипоталамуса крыс после введения антигенов различной природы 53
4.1.1. Орексин-А-позитивные нейроны гипоталамуса после введения липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина .. 54
4.1.2. Орексин-B-позитивные нейроны гипоталамуса после введения липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина...
4.2. Температурная реакция крыс на введение антигенов 62
4.3. Экспрессия гена препроорексина в гипоталамических нейронах крыс после введения липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина 64
4.4. Реакция субпопуляций орексин-содержащих нейронов, локализованных в определенных структурах гипоталамуса, после введения липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина 70
4.4.1. Относительная оптическая плотность и количество орексин-А-позитивных нейронов, локализованных в определенных структурах гипоталамуса, после введения антигенов .. 71
4.4.2. Относительная оптическая плотность и количество орексин-В-позитивных нейронов, локализованных в определенных структурах гипоталамуса, после введения антигенов..
5. Обсуждение результатов. 91
6. Заключение 101
7. Выводы 1 8 список сокращений 105
9 список литературы
- Участие гипоталамуса в механизмах нейроиммунных взаимодействий
- Иммуногистохимическое выявление орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов в гипоталамусе крыс
- Орексин-А-позитивные нейроны гипоталамуса после введения липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина
- Относительная оптическая плотность и количество орексин-А-позитивных нейронов, локализованных в определенных структурах гипоталамуса, после введения антигенов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Исследование механизмов взаимодействия нервной и иммунной систем является одним из актуальных и динамично развивающихся научных направлений. Комплекс полученных результатов, а затем и предложенная концепция организации многоуровневой системы нейрогуморальной регуляции иммунных процессов в целостном организме, стало базисом для формирования научной дисциплины – иммунофизиологии (нейроиммуномодуляции, психонейроиммунологии) (Корнева Е.А., Шхинек Э.К., 1988). Электрофизиологическими методами (60-80-е годы XX века) показано, что в реализацию реакций ЦНС на антигенное воздействие вовлекаются в первую очередь структуры гипоталамуса (Клименко В.М., Корнева Е.А., 1974; Григорьев В.А., 1981; Корнева Е.А. и соавт., 1982).
Гипоталамус вовлекается в регуляцию вегетативных функций организма, следовательно особый интерес представляет изучение роли этой области мозга в механизмах нейроиммунных взаимодействий. Показана активация различных структур гипоталамуса, измеренная по количеству белка с-Fos (общепризнанного маркера активации нейронов), в ответ на инъекцию антигенов различной природы (липополисахарид, бычий сывороточный альбумин, стафилококковый энтеротоксин В, столбнячный анатоксин) (Перекрест С.В. и соавт., 2006; Elmquist J.K., 1996; Gaykema R.P.A. et al., 1999; Goehler L.E. et al., 2000; Goehler L.E. et al., 2001; Nosov M.A. et al., 2001; 2002; Wanner S.P. et al., 2013). В настоящее время исследован ряд гипоталамических нейропептидов, участвующих в реализации реакций ЦНС на антигенное воздействие, в их числе – орек-сины.
Орексины А и В, а также их G–белок ассоциированные рецепторы были открыты 1998 году (de Lecea L. et al., 1998; Sakurai T. et al., 1998). Эти нейро-пептиды участвуют в регуляции многих физиологических процессов, включая цикл сон/бодрствование, терморегуляцию, пищевое поведение, аддиктивное поведение, ответные реакции на стресс, болевое восприятие, функции репродуктивной, эндокринной (Kukkonen J.P., 2013; Li J. et al., 2014), а также иммунной систем (Перекрест С.В. и соавт., 2009; Perekrest S.V. et al., 2008; Gaykema R. P., Goehler L.E., 2009; Grossberg A.J. et al., 2011). Несмотря на то, что орексин А и орексин В участвуют в регуляции жизненно важных функций организма, существуют некоторые различия в характере вовлечения этих нейропептидов в такие процессы как потребление пищи, терморегуляция, функции эндокринной системы (Sakurai T. et al., 1998; Dube M.G. et al., 1999; Mitsuma T. et al., 1999; Sweet D.C. et al., 1999; Jones D.N. et al., 2001; Samson W.K., et al., 2001; Russell S.H. et al., 2002; Yasuda T. et al., 2005; Yang Y.L., Lu K.T., 2008).
Принимая во внимание, что орексин А и орексин В образуются гипота-ламическими нейронами из одного предшественника (de Lecea L. et al., 1998; Sakurai T. et al., 1998), а также вовлекаются в механизмы регуляции вегетативных функций, представляет особый интерес исследование степени вовлечения этих нейропептидов в механизмы реализации реакций ЦНС на антигенное воздействие.
Степень разработанности темы. Существуют литературные данные, показавшие, что инъекция липополисахарида вызывает морфо-функциональные изменения орексин-содержащих нейронов, причем характер реакции этих нейронов зависит от дозы, способа и кратности введения антигена. В работах Перекрест С.В. показано, что через 2 часа после внутривенного введения липопо-лисахарида в несептической дозе (25 мг/кг) происходит увеличение количества орексин-А-позитивных нейронов в гипоталамусе крыс, а затем снижение их числа через 6 часов. Инъекция липополисахарида в субсептической дозе (500 мг/кг) вызывает только снижение количества визуализированных нейронов, содержащих орексин А. Таким образом, показано вовлечение орексин-А-содержащих нейронов в ответные реакции мозга на введение антигена, что проявляется изменением иммунореактивности этих клеток, а наблюдаемые морфо-функциональные различия имеют дозозависимый эффект (Перекрест С.В. и соавт., 2009; Perekrest S.V. et al., 2008).
Существенный вклад в изучение ответных реакций системы орексин-содержащих нейронов гипоталамуса на антигенное воздействие внесли Gaykema R.P. и Goehler L.E., показавшие в своих исследованиях, что внутри-брюшинная инъекция липополисахарида (100 мкг/кг) крысам способствует увеличению количества c-Fos-позитивных орексин-А-содержащих нейронов через 1,5 – 2 часа после аппликации антигена. Вместе с тем, предварительное введение эндотоксина снижает вызванную исследовательским поведением активацию этих нейронов (тестирование в приподнятом крестообразном лабиринте) (Gaykema R.P., Goehler L.E., 2009). Другая группа ученых (Grossberg A.J. et al., 2011) выявила, что внутрибрюшинное введение липополисахарида (250 мкг/кг) приводит к снижению активации орексин-А-иммунореактивных нейронов гипоталамуса, что сопровождается, уменьшением локомоторной активности в вечернее время, а также снижением уровня орексина А в цереброспинальной жидкости у крыс. Выявленное противоречие может быть объяснено различием доз вводимого антигена.
Определенное влияние на дальнейшее исследование участия системы орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в реакциях ЦНС на антигенное воздействие оказали работы по хроническому введению липополисахарида. Так, еженедельное интраперитонеальное введение этого антигена мышам (100 мкг/кг) приводило к постепенному снижению количества орексин-А-позитивных нейронов через 4 недели. Восстановление числа орексин-А-иммунореактивных нейронов до контрольных величин происходило только через 30 дней после последней инъекции эндотоксина (Palomba M., et al., 2014).
Приведенные литературные данные позволяют заключить, что нейро-пептид орексин А вовлекается в механизмы реализации реакций ЦНС на введение липополисахарида. Однако степень участия орексина В в указанных реакциях остается неизученной.
Принимая во внимание тот факт, что липополисахарид и бычий сывороточный альбумин вызывают активацию гипоталамических структур, паттерн которой различен (Перекрест С.В. и соавт., 2006), становится актуальным вопрос о степени вовлечения орексин-А- и орексин-В-содержащих нейронов ги-
поталамуса в механизмы реализации реакций мозга на введение антигенов различной природы.
Цели и задачи исследования. Целью работы явилось изучение реакции гипоталамических нейронов, содержащих орексин А и орексин В, на введение антигенов различной природы: липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина.
Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить иммунореактивность нейронов, содержащих орексин А и орексин В, в структурах гипоталамуса крыс на срезах мозга через 1, 2, 4, 6 часов после внутривенного введения липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина.
-
Исследовать уровень экспрессии гена препроорексина в нейронах гипоталамических структур крыс через 1, 2, 4, 6 часов после внутривенного введения липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина.
-
Определить количество и относительную оптическую плотность орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов, в структурах гипоталамуса, расположенных в области свода мозга: дорсомедиальном ядре и зонах латеральной гипоталамической области (LHAjd, LHAs, LHAd, LHAvm) через 1, 2, 4, 6 часов после внутривенного введения липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина.
Научная новизна. Впервые получены данные о степени вовлечения орексина А и орексина В в орексин-содержащих нейронах гипоталамуса крыс в реакции мозга на внутривенное введение тимус-независимого (липополисаха-рид) и тимус-зависимого (бычий сывороточный альбумин) антигенов. Впервые проведен сравнительный анализ изменения уровня экспрессии гена предшественника орексинов (препроорексина), а также изменения иммунореактивности орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов в определенных гипоталамиче-ских структурах после внутривенного введения крысам антигенов различной природы.
Теоретическая и практическая значимость работы. Работа посвяще
на исследованию центральных механизмов реализации нейроиммунных взаи
модействий, что представляет собой важный этап изучения ответных реакций
ЦНС на введение антигенов различной природы. Получены приоритетные дан
ные о степени вовлечения орексина А и орексина В в орексин-содержащих
нейронах гипоталамуса на введение тимус-зависимого и тимус-независимого
антигенов. Выявлены различия реакций орексин-А- и орексин-В-
иммунореактивных нейронов в первые часы после инъекции липополисахари-да, что косвенно свидетельствует о нарушении баланса между процессами продукции и утилизации этих нейропептидов. Полученные иммуногистохимиче-ским методом результаты демонстрируют возможность вовлечении орексина А, но не орексина В, в механизмы реализации реакций мозга на введение бычьего сывороточного альбумина в первые часы после воздействия. Показано, что уровень экспрессии гена препроорексина возрастает через 2 часа после инъекции липополисахарида, а затем снижается через 6 часов после инъекции. Вве-
дение бычьего сывороточного альбумина не оказывает влияния на интенсивность экспрессии гена препроорексина ни на одном из исследуемых сроков.
Комплекс полученных результатов позволяет заключить, что нейроны гипоталамуса, содержащие орексин А и орексин В, участвуют в реакциях ЦНС на введение липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина, а степень вовлечения этих нейронов зависит от природы применяемого антигена, что свидетельствует о дифференцированном ответе системы орексин-содержащих нейронов.
Результаты настоящего исследования расширяют сложившиеся на данный момент представления о морфо-функциональных особенностях системы орексин-содержащих нейронов гипоталамуса и могут быть использованы в научной практике, связанной с изучением молекулярно-клеточных механизмов формирования реакций организма на антигенное воздействие, а также могут быть включены в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и иммунологии.
Методология и методы исследования
В настоящей работе проведено исследование реакции орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов гипоталамуса крыс в первые часы после введения антигенов различной природы. Для определения степени вовлечения указанных нейронов в реакции мозга на введение липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина использовано иммуногистохимическое выявление орексина А и орексина В в клетках гипоталамуса. Вследствие того, что увеличение или снижение количества орексин-позитивных нейронов гипоталамуса является результатом изменения, как синтеза, так и потребления орексинов, для конкретизации происходящих процессов была выполнена количественная по-лимеразно-цепная реакция, определяющая уровень экспрессии гена препро-орексина — предшественника этих нейропептидов в клетках гипоталамуса крыс.
Сопоставление результатов общего количества орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов и уровня экспрессии препроорексина позволяет косвенно судить об изменении баланса процессов синтеза и потребления орексинов в гипоталамусе в целом, но не характеризует процессы, происходящие в отдельных гипоталамических структурах. В настоящей работе проведено исследование количества орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов и относительной плотности их окраски в соответствие с зонами гипоталамуса, выделенными Л.В. Свансоном (Swanson L.W., 2004).
Поскольку ЛПС является экзогенным пирогеном, было проведено исследование температурной реакции у крыс в ответ на инъекцию антигенов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Нейроны гипоталамуса, содержащие орексин А и орексин В, участ-
вуют в реакциях ЦНС на антигенное воздействие, что проявляется изменением иммунореактивности этих клеток, а пространственно-временная динамика изменений их морфо-функциональных характеристик зависит от природы антигена.
-
Введение липополисахарида приводит к увеличению интенсивности экспрессии гена препроорексина через 2 часа и ее снижению – через 6 часов. Инъекция бычьего сывороточного альбумина не влияет на уровень экспрессии исследуемого гена.
-
Реакция субпопуляций орексин-содержащих нейронов, локализованных в различных зонах гипоталамических структур, характеризуется дискретностью и разнонаправленностью ответа на введение липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина.
Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности полученных результатов определяется большим количеством экспериментальных животных (180 крыс), рандомизацией и формированием групп сравнения и контроля, адекватными морфологическими и молекулярно-биологическими методами исследования, а также корректными методами статистического анализа данных.
Материалы диссертации изложены в 8 публикациях, из них 3 публикации размещены в журналах, рекомендованных ВАК.
Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на Российских и Международных конференциях:
1) 9th Congress of the International Society for NeuroImmunoModulation, 25-
27 September 2014, Liege, Belgium.
-
VIII Российская конференция «Нейроиммунопатология», посвящён-ная памяти академика РАМН Г.Н. Крыжановского, 11-12 ноября, Москва, Россия.
-
XVIII Международная медико-биологическая конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина. Человек и его здоровье», посвященная двадцатилетию медицинского факультета СПбГУ, 18 апреля 2015, г. Санкт-Петербург, Россия.
-
V International Symposium «Interaction of Nervous and Immune Systems in Health and Disease» 23-26 June 2015, St.Petersburg, Russia.
5) XIX Международная медико-биологическая конференция молодых
исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина. Человек и
его здоровье», 23 апреля 2016, г. Санкт-Петербург, Россия.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, а также их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Библиографический указатель содержит 291 источник, в том числе 28 работ на русском и 263– на иностранных языках. Работа проиллюстрирована 21 рисунком и 16 таблицами.
Участие гипоталамуса в механизмах нейроиммунных взаимодействий
Одним из кардинально важных направлений является исследование афферентных путей поступления информации от иммунной системы к нервной. Существует несколько возможных путей ее передачи, в том числе, посредством вовлечения цитокинов, воздействующих на структуры ствола мозга в областях, где ге-матоэнцефалический барьер (ГЭБ) наиболее проницаем. В последние годы показано, что информация об антигене, введенном внутрибрюшинно, поступает в мозг через афферентные волокна блуждающего нерва (Goehler L.E. et al., 1998; Goehler L.E. et al., 1998b; Gaykema R.P.A. et al., 1998).
Введение липополисахарида (эндотоксин, ЛПС) является широко используемой моделью при изучении реакций мозга на антигенное воздействие. Необходимо отметить, что доза и способ введения ЛПС влияют на характер ответных реакций ЦНС (Phelps C., Chen L., 2008).
ЛПС – тимус-независимый антиген, способный связывать поверхностные иммуноглобулины В-лимфоцитов, вызывая их поликлональную активацию и синтез антител, без участия Т-лимфоцитов (Кульберг А.Я., 1986). При попадании в кровяное русло наблюдается специфическое взаимодействие ЛПС с ЛПС-связывающим белком (ЛСБ), что необходимо для инициации сложного каскада реакций по распознаванию и транспортировке антигена (Tobias P.S. et al., 1989; Yu B. et al., 1996; Schumann R.R. et al., 2011). Образовавшийся комплекс ЛПС/ЛСБ связывается с рецептором эндотоксина – CD14, который располагается на нейтрофилах, моноцитах/макрофагах и дендритных клетках (Cadenas S., Cadenas A.M., 2002). Вероятно, ЛСБ является своеобразным катализатором для взаимодействия ЛПС с CD14 (Yu B. et al., 1996). Долгое время именно CD14 считался единственным специфическим рецептором для ЛПС, однако на культуре клеток, дефицитных по этому маркеру, наблюдался ответ на аппликацию данного антигена (Akashi S. et al., 2000). Открытие toll-подобного рецептора 4 типа (TLR4) (Hoshino K. et al., 1999; Beutler B., 2000) и миелоидного фактора дифференциации – MD-2 (Shimazu R. et al., 1999) позволило создать полное представление о рецеп 20 торном комплексе, который взаимодействует с ЛПС. Кроме того, в распознавании ЛПС участвуют CR3-рецепторы комплемента (CD11b/CD18), координирующие взаимодействие CD14 и TLR4 при введении септических доз эндотоксина (Munford R.S., 2008). Таким образом, совокупность взаимодействий, включающих связывание ЛПС/ЛСБ с рецепторными структурами, способствует запуску внутриклеточного сигнального каскада, который завершается активацией ядерного фактора транскрипции – NF-kB (Takeuchi O., Akira S., 2010). Описанные процессы приводят к синтезу и секреции комплекса провоспалительных цитокинов – IL 1, 6, 12; TNF; INF , , участвующих в инициации развития продромального синдрома (Beutler B., 2000; Pardon M-C., 2015). Внутривенное введение ЛПС приводит к увеличению уровня IL-1 уже через 30-60 мин (Ma X.C. et al., 2000), уровня TNF – через 2 часа после аппликации данного антигена, а через 2-4 часа отмечается увеличение концентрации циркулирующего IL-6 (Martich G.D. et al., 1991). После внутривенной или внутрибрюшинной инъекции ЛПС в головном мозге обнаружены значительные концентрации цитокинов, происхождение которых до сих пор является предметом дискуссии (Pardon M-C., 2015). Данные о проникновении ЛПС через ГЭБ и взаимодействии с TLR4, с целью инициации иммунного ответа, достаточно противоречивы. Через 2 часа после внутривенного введения ЛПС, этот антиген был обнаружен в ткани мозга в концентрации только 0,025% от введенной дозы (Banks W.A., Robinson S.M., 2010). Следовательно, можно предположить, что синтезированные в ответ на инъекцию ЛПС провоспалительные ци-токины могут индуцировать синтез идентичных цитокинов микроглией мозга по TLR4-независимому пути (Banks W.A. 2005; Chen Z. et al., 2012). Тем не менее, вовлечение TLR4, локализованных на клетках микроглии, необходимо для развития устойчивой воспалительной реакции при системном введении ЛПС (Chakravarty S., Herkenham M., 2005). Некоторые цитокины продуцируются клетками микроглии после стимуляции ЛПС в структурах мозга, лишенных ГЭБ (цир-кумвентрикулярные органы) (Laflamme N., Rivest S., 2001). Кроме того, ЛПС вызывает повышение проницаемости ГЭБ после связывания с TLR4, локализованного на клетках эндотелия, способствуя возникновению «позднего нарушения про 21 ницаемости» ГЭБ, через опосредованную активацию микроглии и синтез цитоки-нов (IL-1, TNF) (Singh A.K., Jiang Y., 2004; Banks W.A., Erickson M.A., 2010).
В процессе передачи информации о поступлении антигена участвуют не только провоспалительные цитокины, изменяющие проницаемость ГЭБ и действующие на клетки микроглии. Существуют и другие афферентные пути, реализуемые, в частности, посредством вовлечения волокон блуждающего нерва (Goehler L.E. et al., 2000).
Установлено, что индукция синтеза белка c-Fos в нейронах PVH и супра-оптического ядра гипоталамуса (SO) в ответ на интраперитонеальную инъекцию ЛПС блокируется предварительной субдиафрагмальной перерезкой блуждающего нерва (Wan W.L. et al., 1994). Кроме того, субдиафрагмальная ваготомия нивелирует изменения поведенческих реакций, вызванных инъекцией ЛПС (Bluthe R.M. et al., 1994), а типичные для продромального синдрома гипертермия и гипералге-зия вовсе отсутствуют (Watkins L.R. et al., 1994.; Watkins L.R. et al., 1995). Введение IL-1 или ЛПС, а также стафилококкового энтеротоксина В (СЭВ) приводит к экспрессии белка c-Fos в чувствительных нейронах ядер блуждающего нерва (Goehler L.E. et al., 1998; Gaykema R.P.A. et al., 1998). Особое внимание привлекает наличие дендритных клеток (ДК) между волокнами блуждающего нерва (Goehler L.E. et al., 2000). Локализация большого количества рецепторов на поверхности ДК, а также их способность синтезировать провоспалительные цитоки-ны могут играть важнейшую роль в механизме передачи информации в мозг (Ek M. et al., 1998). Ряд исследователей показали, что информация о повышении уровня цитокинов через блуждающий нерв поступает в PVH, ядра таламуса и структуры амигдалы (Sagar S.M. et al., 1995; Day H., Akil H., 1996; Elmquist J.K., Saper C.B., 1996; Gaykema R.P. et al., 2007).
Степень вовлечения различных структур мозга в ответные реакции ЦНС на антигенное воздействие может быть разной в зависимости от природы применяемого антигена. Показано, что уже через 2 часа после введения ЛПС происходит активация таких структур гипоталамуса как SO, PVH и ARH (Elmquist J.K. et al., 1996), определенная по количеству c-Fos-позитивных клеток. Подобные измене 22 ния наблюдаются также в структурах амигдалы и ядрах таламуса(Goehler L.E. et al., 2000). В то же время инъекция СЭВ вызывает активацию преимущественно нейронов ядра солитарного тракта (NTS) и амигдалы (Gaykema R.P.A. et al., 1999; Goehler L.E.et al., 2001). По данным Перекрест С.В., внутривенное введение ЛПС ведет к выраженной активации нейронов переднего гипоталамического поля (AHN), заднего гипоталамического поля (PH), LHA и PVH. Введение бычьего сывороточного альбумина (БСА) инициирует активацию меньшего количества нейронов, однако содержание в них белка c-Fos повышается, что проявляется в увеличении относительной оптической плотности нейронов VMH, LHA и PH (Перекрест С.В. и соавт., 2006). Различный характер реакции структур головного мозга на введение ЛПС, СЭВ и БСА может быть связан с разной природой и иммуно-генностью этих антигенов. В отличие от эндотоксина, БСА и СЭВ – тимус-зависимые антигены, аппликация которых требует Т-В клеточной кооперации, результатом которой является синтез иммуноглобулинов. В первые часы после введения тимус-зависимого антигена, наблюдается активация макрофагов, ДК и других антигенпрезентирующих клеток (АПК). Инициация ранних процессов иммунного ответа включает процессы захвата антигена, а также презентацию его в АПК. Следовательно, можно предположить, что иммунный ответ на аппликацию ЛПС развивается быстрее, так как не требует кооперации Т- и В-лимфоцитов. Кроме того, введение ЛПС сопровождается высвобождением дополнительного пула про-воспалительных цитокинов, что, вероятно, способствует усилению сигнала, воспринимаемого клетками мозга в ответ на антигенный стимул. Комплекс описанных реакций приводит к более выраженной активации нейронов гипоталамиче-ских структур.
Таким образом, введение антигенов различной природы вызывает разный паттерн активации структур мозга, что свидетельствует о дифференцированном ответе ЦНС на антигенные стимулы. В соответствие с литературными данными, можно заключить, что исследование реакции структур гипоталамуса на введение антигенов различной природы и степени иммуногенности представляет особый интерес при исследовании механизмов взаимодействия нервной и иммунной систем.
Как было описано выше, синтезируемые в ответ на антигенное воздействие провоспалительные цитокины играют первостепенную роль в развитии продромального синдрома, который характеризуется изменениями терморегуляции, пищевого поведения, цикла сон/бодрствование, локомоторной активности, восприятия боли (Hart B.L., 1988).
В настоящее время исследовано большое количество нейропептидов гипоталамуса, участвующих в механизмах регуляции перечисленных функций организма, в том числе и сравнительно недавно открытые орексины А и В.
Иммуногистохимическое выявление орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов в гипоталамусе крыс
В последнее время появились многочисленные данные, свидетельствующие о том, что орексины могут участвовать в механизмах обезболивания (Kukkonen J.P., 2013; Cristino L. et al., 2016). Так, в работе Mobarakeh J.I. et al. (2005) проведено исследование интрацеребровентрикулярного, интратекального и подкожного введения орексинов А и В с целью изучения влияния этих пептидов на болевую чувствительность у крыс в ответ на термическое раздражение (тест «горячая пластинка», тест «отдергивания хвоста», тест «отдергивания лапы»), механическое воздействие (тест «давления на лапу») и химическое раздражение (подкожное введение формалина и капсаицина). Авторы показали, что интраце-ребровентрикулярное введение орексина А вызывает большее антиноцицептивное действие в сравнении с орексином В. Причем интенсивность болевой реакции снижалась во всех проведенных тестах вне зависимости от предъявленного воздействия. Наблюдаемый эффект полностью блокировался антагонистом аденози-нового рецептора типа 1 и теофиллином, но не налоксоном, что говорит о возможной причастности аденозина в развитии анальгезии, обусловленной введением орексина А.
Существует ряд экспериментальных работ, результаты которых свидетельствуют о вовлечении только орексина А в механизмы болевой чувствительности. Показано, что интратекальное введение орексина А крысам приводит к обезболивающему эффекту после подкожного введения формалина и исследования поведения животных в тесте «горячая пластинка» (Yamamoto T. et al., 2002). Обезболивающий эффект интратекальных инъекций орексина А наблюдался после моделирования хронического сжатия седалищного нерва у крыс (Suyama H. et al., 2004). Инъекция орексина В не оказывала анальгетического эффекта ни в одном из перечисленных экспериментов (Yamamoto T. et al., 2002; Suyama H. et al., 2004). Группа исследователей Okumura T. et al. (2015) в модели патологического расширения толстой кишки (мегаколон) выявила антиноцицептивное действие орексина А, но не орексина В после их интрацистернального введения крысам. Авторы заключили, что орексин А вызывает анальгезию посредством вовлечения OxR1, поскольку введение SB-334867 (селективный антагонист OxR1) блокирует обезболивающий эффект подкожной инъекции морфина.
Таким образом, несмотря на то, что орексины образуются из общего предшественника, в экспериментальных моделях при купировании болевого синдрома терапевтический эффект проявляется только после инъекции орексина А.
В настоящее время большое внимание уделяется изучению участия орек-синов в регуляции функций иммунной системы. Электростимуляция LHA способствует усилению цитотоксической активности NK клеток селезенки (Wrona D., 2003; Wenner M. et al., 2000), а наибольшее количество орексин-содержащих нейронов локализовано именно в этой структуре гипоталамуса (De Lecea L. et al., 1998; Sakurai T. et al., 1998). Более того, нейроны LHA связаны полисинаптически с нейронами, иннервирующими селезенку (Cano G., 2001; Denes A., 2005) и красный костный мозг (Denes A. et al., 2005). Показано, что OxR1 и OxR2 обнаружены на стволовых клетках (CD34+) красного костного мозга (Steidl U. et al., 2004). Широко обсуждается степень участия орексинов А и В в механизмах модуляции фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов как in vitro, так и in vivo (Ichinose M. et al., 1998; Izguet-Uysal V.N. et al., 2011).
Актуально изучение антимикробных свойств нейропептидов, в том числе, таких как VIP, NPY, нейрокинин-1, вещество P и адреномедуллин (Borden K.A. et al., 2005; Augustyniak D. et al., 2012). Более того, исследователи стали уделять внимание изучению антимикробных свойств орексина В. Выбор орексина В объясняется его структурными особенностями, сходными с VIP, а относительно этого нейропептида уже появились данные, свидетельствующие о его прямой антимикробной активности против многих Грам-положительных и Грам-отрицательных микроорганизмов (El Karim I.A. et al., 2008). Как орексин В, так и VIP состоят из 28 аминокислот, в числе которых имеются положительно заряженные аргинин, лизин и гистидин (14,3 % в составе орексина В и 17,9 % в составе VIP). Оба ней-ропептида имеют изоэлектрическую точку, близкую с таковой у антимикробного пептида LL-37. Следовательно, структурные особенности орексина В и VIP могут свидетельствовать, о том, что эти нейропептиды могут функционировать как ка-тионные антимикробные белки наравне с LL-37, человеческим -дефенсином и -дефенсином. Основываясь на этом предположении Ohta K. et al. (2011) провели серию экспериментов, в которых было выявлено, что VIP и орексин В обладают противомикробной активностью, причем орексин В проявлял ее только в отношении Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, а VIP в отношении Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Streptococcus mutans. Комбинация этих нейропептидов с LL-37 приводила к выраженному аддитивному эффекту в отношении всех микроорганизмов. Авторы полагают, что орексин В и VIP могут проявлять антимикробную активность в синергизме с LL-37, что особенно актуально в защите слизистой оболочке кишечника от инфекционных агентов.
Поскольку орексин-содержащие нейроны вовлечены во многие физиологические процессы, включая терморегуляцию, цикл сон/бодрствование, пищевое поведение (Kukkonen J.P., 2013), а нарушения этих процессов происходят при развитии продромального синдрома, представляется наиболее интересным исследование реакции орексин-содержащих нейронов на введение различных антигенов, в том числе и ЛПС.
Известно, что введение ЛПС в дозе 500 мкг/кг веса, данная доза характеризуется как субсептическая (Phelps C., Chen L.., 2008), приводит к снижению количества орексин-А-позитивных нейронов через 6 часов после внутривенной инъекции (Perekrest S.V. et al., 2008). Введение несептической дозы ЛПС (25 мкг/кг) вызывает, напротив, увеличение количества орексин-А-позитивных нейронов через 2 и 4 часа после инъекции (Перекрест С.В. и соавт., 2009). Увеличение количества орексин-А-позитивных нейронов, выявленных иммуногистохимическим методом, означает, что содержание орексина А в этих клетках возросло. Соответ ственно уменьшение их количества говорит о том, что содержание орексина А в этих нейронах снизилось, и их невозможно выявить этим методом. С помощью количественной полимеразно-цепной реакции показано, что внутривенное введение ЛПС способствовало увеличению экспрессии гена PPO в клетках гипоталамуса, что может быть косвенным свидетельством возрастания синтеза орексинов в нейронах (Перекрест С.В. и соавт., 2009). В экспериментах на мышах показано, что внутрибрюшинные еженедельные инъекции ЛПС (100 мкг/кг) вызывают постепенное снижение количества орексин-А-содержащих нейронов через 4 недели. Количество нейронов, содержащих орексин А, возвращалось к контрольным величинам только через 30 дней после последней инъекции ЛПС (Palomba M. et al., 2014). Применение в экспериментах метода сочетанного выявления орексинов и общепризнанного маркера активации нейрональных клеток – белка с-Fos, позволило судить о вовлечении орексин-содержащих нейронов в ответные реакции ги-поталамических структур на поступление в ЦНС информации о введении антигена. Gaykema R.P. и Goehler L.E. показали увеличение количества c-Fos-позитивных орексин-А-содержащих нейронов через 1,5-2 часа после внутрибрю-шинной инъекции ЛПС (100 мкг/кг) крысам. Вместе с тем, предварительное введение эндотоксина снижало вызванную исследовательским поведением активацию этих нейронов (тестирование в приподнятом крестообразном лабиринте) (Gaykema R. P., Goehler L.E., 2009). С другой стороны, существуют работы, в которых изучены эффекты хронического введения ЛПС (0,22 мкг/ч) в зоны LHA крыс. Авторами показано снижение количества орексин-содержащих нейронов через 30 дней, обусловленное их гибелью в результате развития воспалительной реакции (Gerashchenko D., Shiromani P., 2004). Показано, что у мышей, которым после 12-часовой депривации давали корм, через 6 часов после введения ЛПС выявлялось снижение активации орексин-А-содержащих нейронов, что сопровождалось уменьшением потребления корма (Becskei C. et al., 2008).
Орексин-А-позитивные нейроны гипоталамуса после введения липополисахарида и бычьего сывороточного альбумина
При анализе данных экспрессии гена PPO у интактных животных и животных после введения физиологического раствора не выявлено значимых различий.
Введение ЛПС сопровождалось увеличением интенсивности экспрессии гена PPO через 2 часа после воздействия. В дальнейшем, через 4 часа после аппликации антигена, наблюдалось восстановление уровня экспрессии гена до контрольных величин, а уже через 6 часов – достоверно значимое уменьшение экспрессии гена PPO по сравнению с уровнем его экспрессии у животных после инъекции физиологического раствора. Инъекция БСА не оказывала влияния на интенсивность экспрессии исследуемого гена (рисунок 12). Рисунок 12. Уровень экспрессии гена препроорексина в нейронах гипоталамуса через 1, 2, 4, 6 часов после инъекции антигенов. Животные: — интактные после введения: — физиологического раствора — ЛПС (500 мкг/кг) — БСА (25 мг/кг) — P 0,05 по сравнению с уровнем экспрессии гена препроорексина в гипоталамических нейронах у животных после введения физиологического раствора. Таким образом, результаты иммуногистохимического выявления орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов позволяют констатировать, что через 1 час после инъекции ЛПС происходит накопление этих нейропептидов в клетках, что проявляется увеличенным количеством иммунопозитивных нейронов. Этот период времени характеризуется отсутствием изменений уровня экспрессии гена PPO. Через 2 часа после инъекции ЛПС зарегистрировано двукратное повышение уровня экспрессии гена – предшественника орексинов, что сопровождается снижением иммунореактивности орексин-А- и орексин-В-содержащих нейронов. Вероятно, в этот период времени происходит резкое повышение потребления орек-синов. Через 4 часа после инъекции ЛПС баланс между синтезом и потреблением орексинов уравновешивается и становится сходным с показателями, характерными для контрольных животных. Через 6 часов определено снижение уровня экспрессии гена PPO и уменьшение количества орексин-А-позитивных нейронов гипоталамуса. Количество нейронов, содержащих орексин В, не изменялось. Полученные данные позволяют предположить, что в указанные сроки происходит усиленная утилизация только орексина А. Вероятно, сниженный уровень экспрессии гена PPO через 6 часов после инъекции ЛПС обусловлен механизмом отрицательной обратной связи в результате избыточной продукции орексина А. Стоит отметить, что аппликация БСА не оказывает влияния на уровень синтеза предшественника орексинов, однако вызывает снижение иммунореактивности орексин-А-позитивных нейронов. Вероятно, такие изменения могут быть обусловлены слабой иммуногенностью этого антигена.
При анализе иммунореактивности орексин-А- и орексин-В-содержащих нейронов в гипоталамусах крыс, обнаружено неравномерное распределение данных клеток в ростро-каудальном направлении, а так же сгруппированность их соответственно зонам, выделенным Л.В. Свансоном (Swanson L.W., 2004). Для определения степени участия орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов, расположенных в различных структурах гипоталамуса, проведена количественная оценка, а также определение относительной оптической плотности нейронов, содержащих орексин А и орексин В в определенных структурах гипоталамуса (DMH, LHAjd, LHAs, LHAd, LHAvm), соответствующих 28, 29 и 30 уровням моз га.
Для оценки изменений количества орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов в структурах гипоталамуса после внутривенного ведения антигенов было проведено картирование этих нейронов в структурах перифорникальной области гипоталамуса у интактных животных (рисунок 13, 14).
Распределение орексин-А-позитивных нейронов в структурах гипоталамуса интактных крыс Wistar (28, 29, 30 уровни мозга согласно атласу Swanson L.W.). Точками обозначены орексин-А-позитивные нейроны. Структуры, в которых не нанесены условные обозначения, содержали 5 или менее нейронов.
Распределение орексин-В-позитивных нейронов в структурах гипоталамуса интактных крыс Wistar (28, 29, 30 уровни мозга согласно атласу Swanson L.W.). Точками обозначены орексин-В-позитивные нейроны. Структуры, в которых не нанесены условные обозначения, содержали 5 или менее нейронов. Подсчет количества и определение относительной оптической плотности (ООП) орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов в структурах гипоталамуса (DMH и зоны LHA: LHAjd, LHAs, LHAd, LHAvm) проведены с целью оценки особенностей распределения этих нейронов у интактных животных, а также у животных после введения физиологического раствора и антигенов.
При исследовании количества и ООП орексин-А-позитивных нейронов в структурах гипоталамуса у интактных животных и у животных после внутривенного введения физиологического раствора не выявлено значимых различий.
На срезах мозга, соответствующих 28 уровню обнаружено увеличение количества орексин-А-позитивных нейронов в LHAs через 1 час после инъекции ЛПС. Следовательно, выявленное в указанный срок увеличение общего количества орексин-А-позитивных нейронов происходит за счет увеличения их иммуноре-активности только в LHAs. Через 2 и 4 часа изменения выявлены не были. Однако через 6 часов как после введения ЛПС, так и после введения БСА, обнаружено снижение количества нейронов, содержащих орексин А, в LHAjd и LHAs (таблица 5) (рисунок 15, 16). Аппликация исследуемых антигенов сопровождалась уменьшением ООП орексин-А-позитивных нейронов во всех структурах и на всех исследуемых сроках (таблица 6) (рисунок 15, 16).
Относительная оптическая плотность и количество орексин-А-позитивных нейронов, локализованных в определенных структурах гипоталамуса, после введения антигенов
Изменение иммунореактивности орексин-А- и орексин-В-позитивных нейронов, наблюдаемое в DMH и LHA позволяет предположить, что орексины могут вовлекаться в механизмы терморегуляции. Известно, что DMH является одной из важнейших структур мозга, которая участвует в реализации процессов терморегуляции посредством влияния на механизмы несократительного термогенеза в БЖТ (Morrison S.F., 2016). Еще в исследованиях Bernardis L.L. и Luboshitzky R. (1983) было показано, что разрушение DMH приводит к снижению массы БЖТ у крыс, а электростимуляция этой гипоталамической структуры индуцирует процессы термогенеза в БЖТ (Freeman P.H., Wellman P. J.,1987). Активация нейронов DMH с использованием микроинъекций бикукуллина метиодида (антагонист ГАМКа-рецепторов) способствовала повышению температуры тела, а также увеличению ЧСС и локомоторной активности у крыс (Zaretskaia M.V. et al., 2002). Позднее было показано, что нейроны DMH могут оказывать влияние на обменные процессы в БЖТ при помощи моносинаптических связей с нейронами ростральной части бледного ядра шва (rostral raphe pallidus – rRPa) продолговатого мозга. Это объясняется тем, что rRPA содержит симпатические премоторные ядра, связанные с преганглионарными нейронами грудной части симпатического ствола, передающими регулирующие сигналы в БЖТ (Cao W.H., Morrison S.F., 2006). Немаловажную роль в реализации механизмов терморегуляции играют также нейроны LHA. Следует отметить, что популяция орексин-содержащих нейронов, локализованная в этой структуре гипоталамуса, связана с клетками бурой жировой ткани при помощи прямых проекций из LHA в rRPa. Кроме того, в опытах на крысах показано стимулирующее влияние микроинъекций орексина А в rRPa на процессы термогенеза в БЖТ и ЧСС (Morrison S.F. et al., 2012). Рядом авторов показана зависимость эффектов действия орексинов на температуру тела животных как от пути их введения, так и от состояния животного. Несмотря на то, что разные дозы орексинов могут индуцировать как повышение, так и понижение температуры тела животных (Jaszberenyi M., 2002; Szkely M., 2002; Monda M., 2004; Digby J. E., 2006) существуют литературные данные, указывающие на то, что орексин А и орексин В могут по разному вовлекаться в механизмы терморегуляции. В опытах на анестезированных крысах показано, что орексин В обладает термогенным эффектом, поскольку внутрижелудочковое введение этого нейропептида способствует увеличению частоты импульсов в симпатических нервах, иннервирующих БЖТ, тогда как орексин А наоборот уменьшает ее (Yasuda T. et al., 2005). Другой группой авторов выявлено, что внутрижелудоч-ковое введение орексина А дозозависимо увеличивает температуру тела у крыс (Yoshimichi G. et al., 2001), а введение орексина А на фоне инъекции ЛПС снижает выраженность пирогенной реакции (Jaszberenyi M., 2002). Кроме того, предварительное введение индометацина (ингибитор циклооксигеназы) блокирует вызванную орексином А гипертермию (Yang Y.L. et al., 2008).
Следует отметить, что степень выраженности пирогенной реакции, индуцированной введением эндотоксина зависит от вида бактерии, в состав клеточной стенки которой входит ЛПС, а также от способа и дозы введения антигена. Кроме того, аппликации ЛПС от различных серотипов Escherichia coli (E. coli О55:B5; О127:B5; О111:B4), вызывают разную температурную реакцию у крыс, что может объясняться структурными особенностями ЛПС. Немаловажным является тот факт, что интраперитонеальное введение ЛПС крысам может вызывать предшествующую повышению температуры гипотермию. Этот феномен имеет дозозависи-мый эффект, а степень проявления гипотермии зависит от серотипа E. coli. Авторами было показано, что серотип E. coli О111:B4 инициирует развитие гипотермии, в отличие от серотипа E. coli О55:B5, который обладает выраженными пиро-генными свойствами (Dogan M.D. et al., 2000). Позднее, в экспериментах на крысах, была выявлена зависимость степени выраженности гипотермии от уровня TNF в сыворотке крови: повышенная концентрация TNF коррелировала с наименьшим значением температуры тела крыс (Akarsu E.S., Mamuk S., 2007).
С целью исследования влияния внутривенного введения ЛПС и БСА на температуру у крыс, в настоящей работе проведена термометрия в первые часы после введения этих антигенов. Через 6 часов после введения ЛПС у крыс наблюдалась выраженная пирогенная реакция, а период повышения ректальной температуры тела крыс после введения ЛПС совпадает по времени с периодом снижен-ния синтеза PPO и уменьшения иммунореактивности орексин-А-позитивных нейронов.
Существуют экспериментальные работы, посвященные исследованию влияния аппликации ЛПС на цикл сон/бодрствование у ataxin3 трансгенных мышей (лишенных в постнатальном периоде орексин-содержащих нейронов) и у беспородных мышей. Процесс выздоровления после внутрибрюшинной инъекции эндотоксина у ataxin – 3 трансгенных мышей, протекал быстрее, чем у контрольных животных, что может быть связано с увеличением продолжительности сна, а значит и периода отдыха у мышей, имеющих дефицит орексинов (Tanaka S. еt al., 2015). Авторы акцентируют внимание на том, что исследование участия системы орексин-содержащих нейронов в ответных реакциях мозга на введение антигенов различной природы необходимо для понимания механизмов развития продромального синдрома у людей, больных нарколепсией, а также при моделировании данного заболевания у животных. Такой подход позволит подобрать наиболее оптимальные схемы лечения инфекционных болезней с учетом имеющийся патологии в системе орексин-содержащих нейронов.