Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 10
1.1 Кровопотеря и основные звенья патогенеза 10
1.2 Биоэнергетические процессы и гипоксия 16
1.3 Липидный обмен при кровопотере 19
1.4 Гипоксия и свободнорадикальное окисление 24
1.5 Антиоксидантная система (АОС) 30
Глава 2 Материалы и методы исследования 34
Глава 3 Результаты собственных исследований 41
3.1 Динамика изменения уровня липидов и свободнорадикального окисления при 0,5% кровопотере
3.2 Динамика изменения уровня липидов и свободнорадикального окисления при 1% кровопотере
3.3 Динамика изменения уровня липидов и свободнорадикального окисления при 2% кровопотере 66
ГЛАВА 4 Обсуждение результатов: сравнительный анализ липидного обмена и сро при кровопотерях различной степени тяжести
Выводы 110
Список сокращений и условных обозначений 112
Список литературы
- Биоэнергетические процессы и гипоксия
- Гипоксия и свободнорадикальное окисление
- Динамика изменения уровня липидов и свободнорадикального окисления при 1% кровопотере
- Динамика изменения уровня липидов и свободнорадикального окисления при 2% кровопотере
Биоэнергетические процессы и гипоксия
Практически все исследователи придают важное значение в патогенезе кровопотери изменениям со стороны нейроэндокринной [156, 208], сердечнососудистой систем [104, 206], а в настоящее время особое внимание уделяется нарушению метаболизма [123, 297]. Важное значение придаётся оценке метаболических изменений на молекулярном и клеточном уровнях, что определяет патогенетические основы лечения, диагностику и прогноз для жизни больного [59, 91, 141]. Как известно, обеспечение нормального объема циркулирующей крови является одним из наиболее важных параметров организма, который необходим для поддержания гомеостаза [135]. Средний объем крови взрослого человека составляет 7% от веса тела (или 70 мл/кг массы тела) [174]. Объем крови (EBV) меняется в зависимости от возраста и физиологического состояния. Например, люди старшего возраста имеют больший объем крови – у пожилых людей EBV может достигать 9-10% от общей массы тела. Дети имеют EBVs 8-9% от массы тела [106].
С позиции патологической физиологии и клинической медицины под острой кровопотерей понимают состояние, характеризующееся быстрой и значительной потерей внутрисосудистого объёма, что может привести к нестабильной гемодинамике, снижению доставки кислорода, снижению перфузии тканей, клеточной гипоксии, повреждению органов и смерти [144].
Современная клиническая классификация кровопотери, которую используют в практике врачи-анестезиологи и хирурги, основана на зависимости от ОЦК: малая кровопотеря – 0,5-10% ОЦК, средняя – от 10% до 30% ОЦК, большая – от 30% до 40% ОЦК, массивная – более 40% ОЦК, смертельная – более 70% ОЦК [44]. Ведущим патогенетическим звеном при кровопотере считается гиповолемия, запускающая каскад патологических и компенсаторных реакций. Крайним проявлением кровопотери является шок. Шок – это состояние гипоперфузии, связанное с гемодинамическими нарушениями, ведущими к краху гомеостаза, или являющейся, как поэтически выразился Джон Коллинз Уоррен, «кратковременной паузой в акте смерти» [286]. Патологические эффекты острой кровопотери связаны, в первую очередь, со снижением объема циркулирующей крови (ОЦК), активацией симпатической и эндокринной систем, централизацией кровообращения, нарушениями периферического кровотока и, в конечном итоге, приводят к развитию гипоксии органов и тканей [37]. Компенсаторные реакции организма при острой кровопотере зависят от объёма и скорости кровопотери, но имеют общие черты и в первую очередь направлены на компенсацию гиповолемии. Важность поддержания объёма циркулирующей крови была продемонстрирована на животных, подвергнутых последовательному удалению крови из центральной вены [222]. В таких условиях организм старается ликвидировать возникшее в результате кровопотери опасное для центральной гемодинамики несоответствие между общей массой крови и емкостью сосудистого русла [13]. Это обеспечивается рядом последовательных и взаимосвязанных ответных реакций организма. Первичной (экстренной) реакцией является спазм мелких артерий и артериол, возникающий рефлекторно в ответ на раздражение рецептивных полей сосудов (барорецепторов дуги аорты, синокаротидной зоны и вторично вовлекающихся в процесс хеморецепторов тканей) и повышение тонуса симпатического отдела вегетативной нервной системы. Возникает веномоторный рефлекс, так как венозные сосуды наиболее чувствительны к воздействию симпатической нервной системы и реагируют на меньшую силу раздражения, чем артериальные сосуды [165]. Повышение активности симпатико-адреналовой системы приводит к переходу части циркулирующей крови из системы низкого давления (в котором находится около 70% всей циркулирующей крови) в систему высокого давления [57]. Общее периферическое сопротивление сосудов нарастает в соответствии с тяжестью кровопотери. Следствием снижения ОЦК является уменьшение венозного притока к сердцу и минутного объёма кровообращения (МОК). Учащение сердечного ритма в начальных стадиях кровопотери в какой-то мере поддерживает МОК, в дальнейшем он неуклонно падает. Другим целевым ответом на кровотечение является увеличение числа открытых капилляров в органах, которые способны к этому. Например, в скелетных мышцах лишь часть капилляров обычно открыта для прохождения эритроцитов, в то время как в оставшихся капиллярах проходит только плазма [278]. Во время кровотечения количество открытых капилляров возрастает пропорционально степени тканевой гипоксии, то есть от скорости и объёма кровопотери [185] сокращается диффузионное расстояние между красными клетками крови и окружающими тканями [229], увеличивается площадь капиллярной поверхности для диффузии кислорода [150]. Соответственно капиллярная сеть поддерживает уровень кислорода в тканях на приемлемом уровне и при более низком капиллярном давлении кислорода [39]. Однако, несмотря на органоспецифические микрососудистые ответы, все органы страдают от гиповолемии [246].
В первые сутки сохраняются, а в некоторых случаях повышаются уровни гематокрита (Нt) и гемоглобина (Нb) в крови за счет выброса форменных элементов из депо [20]. Изоволюмическая анемия (гидремическая стадия компенсации) развивается ко вторым суткам после кровопотери, характеризуется адекватным объемом крови, но сниженной концентрацией гемоглобина и низкой пропускной способностью кислорода за счет перехода межтканевой жидкости в сосудистое русло и протекает в две фазы. В первую фазу поступает, причем сравнительно медленно, безбелковая жидкость. Так, у людей, перенесших кровопотерю в количестве до 1000 мл, начальная скорость поступления интерстициальной жидкости составляет 0,5-2 мл / мин. Вторая фаза наступает через 2-12 часов, причем восстановление ОЦК идет за счет межтканевой жидкости с белком. Коллоидно-осмотическая активность поступающих белков значительно превосходит белки крови, которые начинают увеличиваться в кровотоке лишь на 8-10-е сутки после кровопотери. Восполнение объёма циркулирующих эритроцитов (ОЦЭ) – более длительный процесс, так для восстановления 1/3 ОЦЭ потребуется 25 дней и больше [28].
Гипоксия и свободнорадикальное окисление
Методика проведения: 20 мкл исследуемого материала без гемолиза перемешивали и инкубировали 10 мин. при +37С с 2 мл рабочего реагента. Измеряли оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны 500 нм.
Холестерол в ЛПВП определяли с помощью наборов реагента Ольвекс-диагностикум (кат. № 013.004). Принцип метода: хиломикроны, липопротеиды очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеиды низкой плотности (ЛПНП) осаждаются при добавлении к образцу фосфорновольфрамовой кислоты и Mg2+ [67]. После центрифугирования в супернатанте остается только холестерол ЛПВП, концентрация которого определяется так же, как концентрация общего холестерола с помощью набора реагентов фирмы Ольвекс-диагностикум (кат. № 013.022 – 500 мл). Методика: перемешать 0,3 мл реагента и 0,15 мл исследуемого материала и инкубировать в течение 10 мин. при температуре +25С. По окончании инкубации пробы центрифугировали в течение 10 мин. при 4000 g . Прозрачный супернатант использовали для определения концентрации холестерола ЛПВП. Определяли уровень холестерола во всех пробах в течение часа. Концентрацию холестерола липопротеидов очень низкой плотности (ХС ЛПОНП) и холестерола липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП) последовательно рассчитывали по формуле Friedewald W.T.: холестерол ЛПОНП = триацилглицеролы/2,2; холестерол ЛПНП=общий холестерол-холестерол ЛПВП-триацилглицеролы/2,2 [132].
Расчет индекса атерогенности (ИА) проводили по формуле А.И. Климова (1977): ИА = холестерол ЛПНП + холестерол ЛПОНП/ холестерол ЛПВП [14].
Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в гептан-изопропаноловых экстрактах исследуемых тканей по методике И.А. Волчегорского и др. [8]. Методика: 0,5 мл биологического образца суспендировали в 0,1% растворе ЭДТА на 0,9% NaCl, экстрагировали пятью мл смеси гептан-изопропанол (1:1, объём: объём) при встряхивании в течение 15-ти мин. Липидный экстракт отделяли центрифугированием, разбавляли пятью мл смеси гептан-изопропанол (3:7, объём: объём) и разделяли на фазы добавлением 2 мл водного раствора HCl (pH = 2). Через 30 мин верхнюю (гептановую) фазу переносили в отдельную пробирку, а к нижней (водно-спиртовой) добавляли 1 г NaCl для обезвоживания.
В каждой фазе экстракта измеряли оптическую плотность при 220, 238 и 278 нм. Соответствующие величины экстинкции отражают поглощение изолированных двойных связей, диеновых коньюгатов, ацилгидроперекисей (первичных молекулярных продуктов ПОЛ), кетодиенов и сопряженных триенов (вторичных молекулярных продуктов ПОЛ). Результаты выражали в единицах оптической плотности. Кроме того, результаты выражали в так называемых индексах окисления, для чего рассчитывали соотношение Е232/Е220 и Е278/Е220. Содержание конечных продуктов ПОЛ определяли спектрофотометрическим методом по Е.И. Львовской с соавторами по величине оптической плотности гептановых и изопропанольных фаз липидных экстрактов при 400 нм (толщина оптического слоя 2 см) и выражали в единицах оптической плотности [34].
Определение уровня гемоглобина проводилось на базе лаборатории кафедры патологической физиологии ЮУГМУ г. Челябинск, исследование выполнено на фотометре LINSON Junior (Швеция). Методика исследования: в пробирки вносили по 3,5 мл 0,1% рабочего раствора Na2HCO3, добавляли 0,02 мл крови, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре (+18–+25С) в течение 10 мин, после чего измеряли величину оптической плотности опытных проб против контроля (дистиллированной воды).
Хемилюминесцентный анализ
Исследовали железоиндуцированную хемилюминесценцию плазмы крови с помощью хемилюминомера ХЛ-003 (г. Уфа) с компьютерным обеспечением (ТУ 4281-3459-0206938-95). Прибор соответствует требованиям ГОСТ Р 50444-92, ГОСТ 15.013-94 и комплекту технической документации 3.459.00.00.000. Проверка стабильности работы установки проводилась перед каждым измерением по излучению вторичного эталона СФХМ-1 (ГОСТ 9411-81). Методика: полученную в ходе эксперимента кровь выдерживали 30 мин., после чего центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 мин. Фосфатный буфер: 2,72 г. КН2РО4; 7,82 г. КСI; 1 г цитрата натрия на 1 литр дистиллированной воды. Величину рН полученного раствора доводили до 7,45 ед. титрованием насыщенным раствором КОН. Отбирали 0,5 мл приготовленной плазмы крови и разводили ее в 20 мл фосфатного буфера, стаканчики для проб выдерживались в термостате при температуре +37С. Стаканчик вместе с пробой помещали в камеру прибора, настроенного на исследование по программе «Плазма» (быстрое перемешивание, время измерения 3 мин.). Свечение индуцировали добавлением 1 мл 50 мм раствора FeS04 х 7Н20, ускоряющего процесс перекисного окисления липидов. Регистрировали хемилюминограмму (рисунок 4).
Динамика изменения уровня липидов и свободнорадикального окисления при 1% кровопотере
Итак, просматривается общая тенденция к снижению уровня ТГ и ФЛ. Ни в одном случае исследуемые показатели не были выше исходных значений, но в большей мере отмечены изменения со стороны ФЛ, а именно: количественное снижение уровня фосфолипидов во все сроки наблюдения, представительство которых не достигает исходных значений и на 120 ч после кровопотери. Динамика изменений ТГ и ФЛ не связана только с гемодилюцией, так как нет согласованного снижения ТГ и ФЛ на 48 ч, 72 ч после кровопотери, когда максимально выражен эффект разведения из-за поступления в кровоток интерстициальной жидкости. Динамика изменений может быть связана с интенсивностью их синтеза, выделения и потребления клетками.
В литературе указывается, что одним из основных изменений в ответ на гипоксию является HIF - опосредованное перепрограммирование клеточного метаболизма. HIF-1 активирует гены, отвечающие за синтез ферментов гликолиза, лактатдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы [203]. Кроме того, гипоксия стимулирует хранение липидов и ингибирует катаболизм липидов в культивируемых кардиомиоцитах и макрофагах [81]. Более поздние исследования с использованием трансгенных мышей показали, что индуцированная активация передачи сигналов HIF в гепатоцитах приводит к изменению липидного обмена и увеличивает в них накопление липидов [176, 220, 236]. Ключевую роль в биосинтезе липидов играет липин, семейство белков с Mg2+ – зависимой фосфатидит-фосфатазой PAP1, деятельность которой катализирует превращение фосфатидной кислоты в диацилглицерин (DAG) в предпоследнем шаге синтеза триглицеридов (ТГ) [113, 145]. Липин -1 (Lipin 1), а также Липин – 2 (Lipin 2) активируются несколькими факторами транскрипции, в том числе рецептором активации пролиферации пероксисом (PPAR) из семейства SREBP, которые контролируют экспрессию генов, участвующих в липидном обмене [114, 127, 179, 232]. Илиас Милонис и соавторы доказали наличие прямой связи между HIF-1 и Липин - 1 как особенностью клеточного ответа на гипоксию, который приводит к синтезу триглицеридов и формированию липидных капель в клетках [218]. Различные стрессовые гормоны, такие как глюкокортикоиды, инсулин способны изменить экспрессию и/или активность Липин – 1,2, регулирование которых, возможно, включает контроль транскрипции [146]. ТГ составляют ядро липидных капель в адипоцитах, а также других типах клеток. Идея о том, что клетки в стрессовой ситуации, такой как кислородное голодание, способны временно реагировать анаболическими процессами, в частности, усилением биосинтеза липидов, является новой, но не единственной. Так, гипоксия способна стимулировать синтез гликогена HIF-1 зависимым путем [84, 122].
По-видимому, воздействие на клетки умеренной гипоксии – это способ сохранения питательных веществ в организме для последующего использования в качестве источника энергии. Тем не менее, это предположение не может полностью ассоциироваться с липидами, так как они могут производить энергию только через окислительное фосфорилирование, которое резко тормозится при тяжелой гипоксии. Более вероятное объяснение – хранение триглицеридов в виде липидных капель в условиях гипоксии может быть защитной реакцией, которая предотвращает внутриклеточную липотоксичность при гипоксии [122, 274], хотя хранимые таким образом триацилглицеролы могут служить в качестве источника липотоксинов, если клетки длительное время находятся в гипоксии и не в состоянии справиться с метаболическими нарушениями [223].
Данные о метаболизме ФЛ при кровопотере крайне скудны. Можно сослаться на работу Шварца Х.П., отметившего снижение общего содержания фосфолипидов в плазме после кровопотери [249]. Результаты исследований Г.С. Левина, Ц.Л. Каменецкой также свидетельствуют о том, что снижение уровня фосфолипидов в крови после кровопотери является закономерной реакцией [29]. Они предположили, что снижение содержания фосфолипидов в крови при кровопотере обусловлено недостатком кислорода и энергии, необходимой для их синтеза.
Снижение уровня ФЛ также может быть связано с их разрушением и/или усилением их использования для восполнения клеточных элементов крови. Хорошо известно, что гипоксия приводит к активации СРО, а ФЛ наиболее чувствительны к действию свободных радикалов. Усиление их использования при стрессовых ситуациях, в том числе и при кровопотере, может определяться их универсальными функциями. Фосфолипиды являются важной частью клеточных мембран. Они обеспечивают текучие и пластические свойства мембран клеток и клеточных органоидов, в то время как холестерол обеспечивает жёсткость и стабильность мембран.
Помимо структурного компонента клеточных мембран, фосфолипиды могут выполнять якорные функции для прикрепления множества белков на клеточную поверхность, а также являются предшественниками вторичных посредников. Кроме того, показана роль ФЛ в регуляции пролиферации клеток.
В 90-х годах была обнаружена группа инозитолсодержащих фосфолипидов, у которых фосфат включен в 3-е положение инозитола. Это фосфатидилинозитол-3-монофосфат, фосфатидилинозитол-3,4-бисфосфат и фосфатидилинозитол-3,4,5-трисфосфат. Их синтез катализируется киназой фосфоинозитидов I типа, отличающейся от киназы фосфоинозитидов II типа, включающей фосфат в положение 4 [93]. Киназа I типа важна в регуляции клеточной полиферации. Это подтверждается данными о том, что фактор роста тромбоцитов (ФРТ) активирует киназу фосфоинозитидов I типа [68]. При этом ФРТ образует комплекс собственного рецептора и киназы фосфоинозитидов I типа. Оказалось, что мутантные рецепторы ФРТ, не обладающие способностью связываться с киназой I типа, не стимулируют клеточный рост.
В работе О.В. Павличенко и соавторов исследовалась роль ферментов фосфатидилинозитольного сигнального пути PI3K, РКВ, STAT-3 в регуляции ответа клеток на гипоксию и их значение в развитии резистентности опухолевых клеток к гипоксии [41]. Было продемонстрировано, что активация РІЗК зависимого сигнального пути может являться одним из факторов, обеспечивающих адаптацию опухолевых клеток к гипоксии in vitro. PI3K и такие эффекторы PI3K, как протеинкиназа В (РКВ), принимают участие в активации HIF-1 и VEGF (фактора роста эндотелия сосудов). Можно прийти к выводу, что срок кровопотери достоверно влияет как на уровень ТГ, так и на уровень ФЛ. Влияние кровопотери сильнее отражено на изменении уровня ФЛ – в среднем 39%, в то время как влияние на уровень ТГ – 25% (таблицы 2, 3).
Динамика изменения уровня липидов и свободнорадикального окисления при 2% кровопотере
Двухфакторный дисперсионный анализ показал высокое влияние суммы организованных факторов – 92% с очень небольшим размахом от 90% до 94%. Значение влияния степени кровопотери – 25,7%, срока постгеморрагического периода – 36,8%, взаимодействия срока и интенсивности кровопотери составило 29% (таблица 62).
Двухфакторный дисперсионный анализа влияния степени кровопотери и срока постгеморрагического периода на светосумму свечения Источник вариации Сумма квадратов Степень свободы Дисперсия F фактический Fтабличный-0,95. Влияние % Фактор А Степени кровопотери 47,63 2 23,81 127,23 ЗД 25,73 Фактор BСрокапостгеморрагическогопериода 68,09 3 22,69 121,26 2,7 36,78 Взаимодействие AB 55,18 6 9,19 49,14 2,2 29,8 Влияние вариантоввзаимодействия Х(А+В+АВ) 170,9 11 15,53 83,01 1,9 92,31 Влияние случайных факторов 14,22 76 0,18 - - 98 1. Наибольшее влияние оказывает сумма организованных факторов, сила влияния которых составляет 0,923+0,01, достоверно с вероятностью 0,95. Для всех объектов данной категории влияние суммы организованных факторов составляет 90%-94 %, в среднем 92 % от действия факторов. 2. Сила влияния фактора В составляет 0,368+0,023, достоверно с вероятностью 0,95. Для всех объектов данной категории влияние фактора В составляет 31%-43% от общего влияния всей суммы факторов, в среднем 37% . 3. Сила влияния сочетанного действия (АВ) составляет 0,298 + 0,05, достоверно с вероятностью 0,95. Для всех объектов данной категории влияние сочетанных факторов 19%- 41%, в среднем 30% от действия всех факторов. 4. Сила влияния фактора А составляет 0,257+0,018, достоверно с вероятностью 0,95. Для всех объектов данной категории влияние фактора А составляет 20%-32% от общего влияния всей суммы факторов, в среднем 26%. В научной литературе отмечено наличие прямой корреляции между степенью гипоксии, временем развития и интенсивностью СРО, но не в организме в целом, а на урове скелетных мышц [99].
Высказывается предположение, что АФК способствуют повышению резистентности организма к гипоксии, в частности, АФК способны увеличить экспрессию белка HIF-2 в хромофинных клетках человека [86]. Брунелла Дж. и др. указывают на то, что окислительного фосфорилирования не требуется для гипоксической стабилизации HIF-1, но митохондриальные АФК необходимы [87].
Стабилизации HIF-1 способствует супероксид (O2-) [171]. Более того, ингибирование свободнорадикальных процессов за счет избыточной экспрессии MnSOD приводит к супрессии HIF-1 и эндотелиального ростового фактора [283].
Относительно активации антиоксидантной системы, оцениваемой по латентному периоду, можно отметить следующее, что только 0,5% и 1% кровопотеря способствуют возрастанию мощности АОС, при 0,5% с 48 ч до 120 ч, а при 1% на 24-48 ч после кровопотери относительно контроля. Достоверные различия с учетом поправки Бонферрони между группами отсутствуют из-за большого разброса в выборках, то есть реакция АОС-системы индивидуальна. Процент разброса в группах относительно средних величин в сторону более высоких в среднем достигает 39-40%, в сторону более низких – около 20% (рисунок 19).
Отрицательная слабая связь (–0,49) между уровнем гемоглобина и латентным периодом обнаруживается лишь на 24 ч. после кровопотери (таблица 63), что подтверждается и однофакторным дисперсионным анализом. Достоверная сила влияния уровня кровопотери на величину латентного периода в этот срок составляет всего 30,6% при очень высоком разбросе от 8% до 54%, что также является доказательством неоднозначной реакции организма на кровопотерю (таблица 64).
В остальные сроки гипоксия, определяемая уровнем кровопотери, не влияет на величину латентного периода (таблицы 65, 66, 67).
Следует обратить внимание на несоответствие при 1% и 2% кровопотере между ЛП и ССС, снижение которой не обусловлено повышением латентного периода как интегрального показателя мощности АОС. Это может объясняться многими факторами, в том числе и их сочетанием. В литературе отмечается, что недостаток кислорода может быть причиной снижения СРО, а, следовательно, и активации АОС [158, 72]. Кроме того, в условиях дефицита кислорода могут быть ограничены синтетические процессы, в частности, синтез ферментов-антиоксидантов, либо может быть сочетание этих процессов.
Индексы окисления в гептановой фазе относительно первичных продуктов ПОЛ при 0,5% кровопотере выше, чем при других видах кровопотерь (рисунок 20); относительно вторичных продуктов ПОЛ их изменения весьма различны во времени, но следует отметить, что ИО наиболее высок при 2% кровопотере с резким снижением на 72 ч (рисунок 21). Тренд повышения ИО отмечен в гептановой фазе либо для всех продуктов (0,5% кровопотеря), либо для вторичных ПОЛ (1% кровопотеря). Для 2% кровопотери характерен тренд снижения ИО для всех продуктов ПОЛ.
В изопропанолой фазе интенсивность окисления и образования первичных продуктов ПОЛ, как и в гептановой фазе, выше при 0,5% кровопотере относительно других видов кровопотерь (рисунок 22); интенсивность окисления относительно образования вторичных продуктов ПОЛ не имеет различий между всеми типами кровопотерь и наиболее активно представлена на 48 ч после кровопотери (рисунок 23). В изопропаноловой фазе тренд повышения имеет место лишь при 0,5% кровопотере.
Итак, индексы окисления как в гептановой фазе, так и в изопропаноловой фазе относительно первичных продуктов ПОЛ при 0,5% кровопотере выше, чем при других кровопотерях; относительно индексов окисления и интенсивности образования вторичных продуктов ПОЛ такого соответствия нет. Более того, однонаправленные изменения индексов окисления для первичных и вторичных продуктов ПОЛ представлены лишь при 0,5% кровопотере. Анализ тренда ССС, индексов окисления выявил противоположные изменения при 0,5% кровопотере с перекрестом на 48 ч как в гептановой, так и в изопропаноловой фазе. Это связано с отложенной во времени реакцией АОС (на 48 ч после кровопотери) и постепенным возрастанием скорости свободнорадикальных процессов 48-120 ч (рисунок 24, 25).