Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Современные представления об этиопатогенезе артериальной гипертензии и метаболического синдрома 15
1.2. Значение оценки вариабельности АД и ЧСС при проведении СМАД 20
1.3. Формирование артериальной гипертензии в рамках МС 23
1.4. Полиморфизм генов, кодирующих РААС и их функциональная значимость при АГ и МС 24
1.4.1. Ген ангиотензиногена (AGT). 26
1.4.2. Ген ангиотензинпревращающего фермента (ACE) 29
1.4.3. Ген сосудистого рецептора I типа к ангиотензину II (AGTR1)
1.5. Функциональное значение гена, кодирующего агрегацию тромбоцитов при АГ и МС 35
1.6. Синергизм действия изучаемых генов з
Глава 2. Материал и методы исследования 38
2.1. Клиническая характеристика исследованных пациентов 38
2.2. Антропометрическое исследование пациентов 41
2.3. Исследование артериального давления 42
2.4. Исследование углеводного обмена 44
2.5. Исследование липидного обмена 46
2.6. Инструментальные методы обследования
2.6.1. Определение стандартных величин СМАД 46
2.6.2. Линейный и нелинейный методы анализа СМАД
2.7. Анализ стандартной ЭКГ 49
2.8. Генетическое исследование
2.8.1. Экстракция ДНК из периферической крови 50
2.8.2. Исследование полиморфизма генов РААС (АСЕ, AGTR1, AGT), гена ITGB3 51
2.9. Статистическая обработка данных 55
Глава 3. Результаты исследования 58
3.1. Результаты анализа анамнестических, клинических данных больных 58
3.2. Результаты анализа гемодинамических показателей по данным СМАД
3.2.1. Результаты определения стандартных величин СМАД 59
3.2.2. Результаты линейного анализа СМАД 61
3.2.3. Результаты нелинейного анализа СМАД
3.3. Результаты анализа стандартной ЭКГ в 12 отведениях 68
3.4. Результаты анализа частоты встречаемости полиморфизма генов
3.4.1. Результаты анализа клинического течения артериальной гипертензии в зависимости от генотипа по гену AGT 71
3.4.2. Результаты анализа клинического течения артериальной гипертензии в зависимости от генотипа по гену АСЕ 75
3.4.3. Результаты анализа клинического течения артериальной гипертензии в зависимости от генотипа по гену AGTR1 78
3.4.3. Результаты анализа клинического течения артериальной гипертензии в зависимости от генотипа по гену ITGB3 82
3.4.4. Анализ ассоциации генов РААС(AGT, AGTR1,ACE) и гена ITGB3. 85
Глава 4. Обсуждение результатов 87
Заключение 93
Практические рекомендации 96
Перспективы дальнейшей разработки темы 97
Список литературы
- Формирование артериальной гипертензии в рамках МС
- Исследование углеводного обмена
- Результаты определения стандартных величин СМАД
- Результаты анализа клинического течения артериальной гипертензии в зависимости от генотипа по гену AGTR1
Формирование артериальной гипертензии в рамках МС
Проблема АГ остается актуальной не только в связи с широким распространением, но и за счет длительного латентного развития, низкой приверженности пациентов к лечению [Nordfall K. et al.,, 2008]. Обращает внимание стремительное «омолаживание» АГ. По литературным данным, в РФ среди молодого населения частота повышения АД варьирует от 4,8 до 20% [Мамедов М.Н. и др., 2010]. Также отмечается более раннее развитие поражения органов- мишеней (ПОМ) и, как следствие, снижение качества и продолжительности жизни [Кисляк О.А. и др., 2004].
Диагноз АГ устанавливается при цифрах систолического АД выше 140 мм рт. ст. и/или диастолического АД выше 90 мм рт. ст. [ВНОК, 2013]. АГ является неинфекционным мультифакторным заболеванием и реализуется ри взаимодействии генных механизмов, особенностей окружающей среды и факторов риска (ФР). АГ - полиэтиологичное заболевание, для лечения которого необходимо понимание причин, формирующих данное заболевание. С развитием молекулярно- генетических методов исследования актуальность изучения генетической предрасположенности к АГ возрастает и возрастает число генов- кандидатов, ответственных за ее развитие. Несмотря на большое количество проведенных клинических исследований, достоверных данных о влиянии полиморфных вариантов генов, кодирующих развитие АГ на величины АД, не получено [Mondry A. et al., 2002].
В формировании АГ высока роль неправильного образа жизни, в том числе урение, злоупотребление алкоголем, ерациональное итание, хронический стресс, гиподинамия [ВНОК, 2011], что в совокупности с неблагоприятными факторами окружающей среды позволяет отнести АГ к «болезням цивилизации» [Фролов В.А., 2007]. Возможный комплексный подход к диагностике, выявлению и модификации ФР, своевременные меры профилактики адекватные мероприятия по лечению АГ могли бы способствовать замедлению прогрессирования АГ, предупреждению раннего развития ПОМ возникновению жизнеугрожающих ситуаций.
Если говорить о неправильном образе жизни, в том числе о гиподинамии и неправильном питании как о причине возможных ССО, нельзя не затронуть такое понятие, как метаболический синдром (МС). Mancia G. (2007), Lakka H.M.(2002) отмечают, что риск развития фатальных ССО у лиц с МС значительно выше, чем у лиц без него. Так, в исследованиях ARIC, KIHDRFS риск развития ИБС и ишемического инсульта у больных МС выше и составляет 2,9- 4,2 и 2 раза соответственно. Но у женщин более высокий риск кардиоваскулярной смертности при МС [Rosenzweig A. et al., 2008].
После выделения и описания в 1988 году МС как отдельного симптомокомплекса, включавшего в я гиперинсулинемию, гипертриглицеридемию, артериальную гипертензию, нарушение толерантности к глюкозе и дислипидемию, отмечается, его стремительный рост. По прогнозам некоторых специалистов распространенность данного заболевания к середине XXI века может достичь полмиллиарда больных, а согласно расчетам Zimmet P. (2012) увеличится на 50%.
Согласно современному представлению, МС включает в себя патогенетически связанные между собой артериальную гипертензию, абдоминальное ожирение, инсулинорезистентность, гиперинсулинемию, и, как следствие, нарушения обмена углеводов, липидов, пуринов. Кроме того, МС как нозологическая единица не включен в МКБ-10 [ВНОК, 2010].
Стойкие нарушения обменных процессов в совокупности с артериальной гипертензией приводят к серьезным осложнениям и, несмотря на уделяемое внимание к данной проблеме со стороны врачей разных специальностей, в странах с развитой экономикой распространенность МС в мире составляет около 20% у больных в возрасте более 30 лет [Бутрова С.А. и др., 2001]. А среди лиц старше 60 лет составляет 43,5%[Karasona К. et al., 2003; Testamariam B. et al., 1991]. По результатам Первого российского крупного исследования распространенность МС среди людей от 30 до 70 лет составила 20,6%, отмечена гендерная зависимость- у женщин до 2,4 раза чаще, чем у мужчин, в то время как по данным Бутровой С.А. (2012) МС выявлено нарастание частоты МС у мужчин, у женщин происходит рост данной патологии только после 50 лет. Среди женщин- представительниц африканской расы чаще встречается в 2,5 раза чаще, чем у мужской части. Распространенность МС у российских граждан отражена в работе Белякова Н.А. (2002).
До настоящего времени нет четкого понимания, является ли МС генетически детерминированным или о развитие провоцируется воздействиями окружающей среды. Но нельзя отрицать роль внешних факторов, таких как гиподинамия, неправильное питание с избыточным потреблением животных жиров и легкоусвояемых углеводов, что обычно приводит к развитию ожирения, поскольку происходит окисление не всех потребленных жиров. Инсулинорезистентность выявляется у 25% людей с низкой физической активностью [Reaven G.,1996]. В совокупности с малоподвижным образом жизни нерациональное питание вызывает инсулинорезистентность, поскольку происходит замедление липолиза и накопление триглицеридов [Грунди М.С. и др., 2007]. Инсулинорезистентность (ИР), в свою очередь, усугубляется часто сопутствующим МС синдромом обструктивного апноэ, так как вследствие хронической гипоксии во время сна не происходит выброс соматотропного гормона [Dahlof B. et al., 2005].
Исследование углеводного обмена
Перед проведением исследования с каждым пациентом отдельно была проведена разъяснительная беседа о сути методики СМАД. Каждый пациент самостоятельно вел специальный дневник, где отражались в соответствии со временем данные самочувствия, отмечал периоды физической и эмоциональной нагрузки, прием лекарств. Данные СМАД были обработаны с помощью компьютерных программ EZDoctor 2.7, ChronosFit (Германия). Измерения проводились в дневные часы (с 7.00 до 23.00) каждые 15 минут и с периодом в 30 минут- в ночные (с 23.15 до 6.45). Время ночного сна определялось по записям дневников больных. С учетом рекомендаций NBREP (США, 1990г.), анализ данных проводился в при наличии более 85% успешных измерений.
Аппаратом автоматически фиксировалось каждое измерение. Нами с использованием дневников самочувствия пациентов определялась реакция АД на психоэмоциональные стрессы и физическую активность, ответ на гипотензивную терапию.
Компьютерным программным обеспечением определялись средние, максимальные, минимальные значения систолического, диастолического АД за сутки, дневной и ночной периоды. Средние величины вычислялись программой как среднее арифметическое значение соответствующего показателя за заданный период. Средние величины отражают суточное колебание АД дают первое основное представление об уровне АД у больного и в соответствии с принятыми ВНОК (2008) нормами не должно превышать днем 140/80 мм рт.ст., ночью 125/80 мм рт.ст. При превышении указанных значений АД определялись индекс времени (ИВ) и индекс площади (ИП). Индекс времени отражает время превышения пороговых значений. При ИВ более 25% гипертоников отражает недостаточность гипотензивной терапии, при превышении 30% устанавливалась АГ у считавшихся здоровыми. ИП показывает истинную гипертоническую нагрузку. Степень ночного снижения (СИ) также отражает вариабельность АД и рассчитывается по формуле АД — АД СИ = 100% х АД д где АДд - среднее дневное АД, АДн - среднее ночное АД. В норме СИ находится в пределах 10-20%, тогда можно говорить о нормальном очном снижении АД пациенты относились к группе дипперов, при увеличении СИ более 20%- группа овердипперов, при СИ 0-10%- нон- дипперы, при устойчивом повышении АД (СИ менее 0%)-пациенты относились к группе найт- пикеров.
Для оценки хрноноструктуры АД и ЧСС данные СМАД были обработаны программой «Chronos-Fit» (Германия).
В структуре линейного анализа определялись средние значения АД и ЧСС в разные временные отрезки, и, кроме того, циркадианный индекс. Циркадианный индекс в норме составляет 1,22-1,22- 1,44.[Макаров Л.М.] и рассчитывается для ЧСС как отношение средненочного значения ЧСС к среднедневному значению ЧСС. Расчет для АДс и АДд проводился аналогично. Нелинейный анализ определяется как сочетание частичного Фурье-анализа и пошаговой регрессии [Благонравов М.Л., 2012].
Нелинейный анализ включал в себя автоматический расчет в программе «Chronos-Fit» для значений АД ЧСС минимальных максимальных величин за сутки; размах колебаний- рассчитывается как разница между Макс. и Мин. значениями анализируемого показателя; мезора- среднее значение АД или ЧСС в дневной и ночной период, магнитуды- максимального сдвига изучаемого показателя от мезора за сутки, мощности колебаний, отражающего количество колебательных процессов (%).
Все величины были представлены как M ± m, где M- среднее значение, m- ошибка среднего.
Были проанализированы ЭКГ пациентов, включенных в исследование, которые не имели жалоб на момент обследования, с отсутствием в анамнезе кардиальной патологии. Оценивались ЭКГ у 10 пациентов 1 группы и у 15 пациентов 2 группы. Запись ЭКГ проводилась в 12 стандартных отведениях при скорости записи 25 мм/час в течение 30 секунд.
Для верификации измененного метаболизма в анализируемых группах проведен анализ дисперсии QTd на основе определения корригированного QT.
Дисперсия QT интервала - это разница между максимальными (QTmax) и минимальными значениями QT (QTmin) интервала: QTd = QTmax - QTmin Для определения корригированного QT у пациентов с ЧСС от 60 до 100 ударов в минуту применяется Формула Базетта: от QT c=- =, где RR- величина интервала RR, значения интервалов рассчитываются в секундах. В норме интервал QT не превышает 0,44 с. В каждой группе определялись средние значения интервала RR, средние величины максимальной и минимальной длительности QT, средние значения корригированного QT.
Генотипирование по генам системы ренин- ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) (гены AGT, AGTR1, АСЕ, ITGB3) проводилось на базе лаборатории кафедры биологии и общей генетики РУДН, г.Москва. В качестве метода исследования генных полиморфизмов использована полимеразная цепная реакция с детекцией продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Материалом для исследования являлась ДНК, выделенная из образцов венозной крови с использованием реагентов «ДНК-экспресс-кровь» (НПФ «Литех»).
Забор рови осуществлялся на базе лаборатории ГП №31 с использованием вакуумной системы забора крови Vacutest с антикоагулянтом (в пробирках находилось 0,05М КЗ-ЭДТА). Полученная цельная кровь подвергалась центрифугированию в течение 4 минут при комнатной температуре со скоростью 3000 оборотов в минуту, после чего транспортировалась с соблюдением необходимых температурных условий (от +4С до +8С) в термосумке с хладэлементами в лабораторию кафедры биологии и общей генетики РУДН. В лаборатории разделенную на плазму и осадок из форменных элементов центрифугированную кровь подвергали дальнейшей обработке. В пробирке "Эппендорф" проводилось отделение пипеткой лейкоцитов с поверхности осадка и дальнейшее замораживание длительностью 60 минут до окончательного замораживания форменных элементов крови морозильной камере лаборатории, которой устанавливалась температура -20С. После последующего размораживания исследуемого материала в пробирку был добавлен реактив «ДНК-экспресс кровь», который был равен по объему содержимому пробирки. Далее, после последующего смешения содержимого пробирки с использованием вортекса и осаждения центрифугированием, пробирку помещали термостат, прогретый до 99С, и выдерживали 25 минут при температуре 99С. После этого в течение 1 минуты при обычной комнатной температуре проводилось повторное центрифугирование ри скорости 9000-14000 боротов мы получали супернатант, который впоследствии использовался как исследуемый образец ДНК.
Результаты определения стандартных величин СМАД
С учетом данных литературы [Шестакова М.Б. и др., 2005] о применении блокаторов РААС для снижения инсулинорезистентности и предупреждения развития сахарного диабета, а также учитывая возрастание частоты АГ у пациентов с ОКС частоты аллеля PLA2 гена ITGB3 [Назаренко Г.И. и др., 2009] представляется целесообразным изучение особенностей развития МС с учетом полиморфизма генов РААС и гена тромбоцитарного звена гемостаза ITGB3 у пациентов с АГ.
При анализе частотных характеристик в исследуемых группах отмечается тенденция к нарастанию полиморфных генотипов по 4 генам у больных с метаболическим синдромом, которая составила 31%, тогда как больных с изолированной АГ- 22%. В связи с этим далее проводилось определение частоты полиморфных аллелей в изучаемых группах (табл. 13).
Отмечается достоверное увеличение частоты встречаемости генотипа ID (р=0,001 мс-; р=0,004 мс+) по гену АСЕ и значимом снижении частот генотипа DD (р=0,0001 мс-; р=0,011мс+) в обеих группах.
У больных с МС достоверно снижалась частота генотипа АА по гену AGTR1 (р=0,003) и повышалась частота полиморфного генотипа АС (р=0,001) в сравнении с популяционными частотами. В первой группе нарастала частота генотипа АА гена AGTR1 в сравнении со второй (р=0,003), а во второй на уровне значимости 90% нарастала частота аллеля С гена AGTR1 в сравнении с первой группой и в сравнении с популяционными частотами (р=0,081). группа 1:пациенты без МС, мс-; группа 2: пациенты с МС, мс+. При сравнении частоты разных генотипов в двух группах с АГ установлено, что на 90% уровне значимости (р=0,1) во второй группе чаще встречается аллель Т гена AGT (OR=l,26, п=30), что позволяет высказать предположение о прогностическом значении данного аллеля при оценке риска развития метаболического синдрома у пациентов с артериальной гипертензией (п=30).
В соответствии с поставленной задачей определялись особенности реализации АГ в зависимости от полиморфизма изучаемых генов.
Пациенты были распределены на 2 группы в зависимости от наличия полиморфного аллеля: в первую группу вошли больные гомозиготы по нормальным аллелям, о вторую руппу- гомо и гетерозиготы полиморфным аллелем в генотипе.
По результатам анализа анамнестических данных отмечено статистически значимое нарастание частоты развития МС у пациентов с наличием полиморфного аллеля Т гена AGT в генотипе (р0,05), при этом по уровню гликемии натощак существенного отличия не выявлено (табл. 14).
Сравнительный анализ рекомендованного лечения пациентов показывает необходимость к применению большего количества препаратов для компенсации артериальной гипертензии. Так, по данным табл . 15 отмечается достоверно частое применение терапии 5 гипотензивными препаратами (р 0,05), тенденция к назначению 4 препаратов за счет более частого использования ингибиторов АПФ.
Тем не менее, в ходе проведенного нами исследования не отмечается прямого влияния полиморфизма гена AGT на степень АГ (табл. 16), однако, отмечается влияние на суточный профиль АД. Так, выявлено статистически значимое отсутствие нормального ночного снижения АД вследствие нарастания во второй группе пациентов количества найт- пикеров и нон -дипперов (р 0,05). Таблица 16.
Анализ анамнестических данных (табл. 17) показал достоверное увеличение частоты заболеваний щитовидной железы, рост встречаемости аллергических реакций и заболеваний ЦВБ при наличии полиморфного аллеля D гена АСЕ. Статистически значимые различия определены по показателю уровня гликемии, р0,05.
Примечание: ( ) - р 0,05 С целью выявления особенностей течения артериальной гипертензии в зависимости от генотипа у всех пациентов проведен анализ базовой терапии и число применяемых групп препаратов (табл. 18). В ходе исследования нами выявлена необходимость использования при терапии пациентов из 2 группы 4 и 5 групп гипотензивных препаратов. Особенности проводимой терапии в зависимости от генотипа гена ACE терапия Генотип II n=10 (группа1) Генотип ID+DD n= 40 (группа2) блокаторы РААС 48% 43% ингибиторы АПФ 47% 58% блокаторы Са+2 каналов 29% 35% -блокаторы 0% 39% терапия 3гипотензивнымипрепаратами 29 17 терапия 4гипотензивнымипрепаратами 29 35 терапия 5гипотензивнымипрепаратами 0 13 Примечание: ( ) - р 0,05 При анализе суточных изменений основных показателей АД в исследуемых группах выявлено достоверное увеличение офисного диастолического АД, максимального АД систолического в анамнезе и рабочего АД систолического во второй группе пациентов (табл. 19). Таблица 19.
Результаты анализа клинического течения артериальной гипертензии в зависимости от генотипа по гену AGTR1
Выявлено, что тучных людей уровень ренина, АПФ, ангиотензина II в 1,5-2 раза выше по сравнению с людьми с низким ИМТ [Whaley- Connel А., 2010].
Кроме тоо, известно влияние РААС на инсулиновые сигналы и чувствительность периферических рецепторов у инсулину и описывается гипотеза прямого воздействия РААС на работу -клеток поджелудочной железы [Lucius R. et al.,1999]. Данное предположение подтверждается описанием в экзокринных протоках поджелудочной железы компонентов РААС [Tahmasebi М. et al., 1999] и наличия АТГ, АПФ, рецепторов двух типов к ангиотензину II непосредственно в -клетках поджелудочной железы [Lam K.Y. et al., 2002].
Установлено профилактическое действие блокады ренин-ангиотензиновой системы при развитии СД [Шестакова М.Б., 2005].
Достоверная ассоциация со снижением чувствительности периферических клеток к инсулину известна для гена, кодирущего рецептор, активируемый пролифераторами пероксиса типа Р2 [Цветкова О.А. и др., 2009]. В ряде работ [Бирюкова Е.В., Маркин Н.В., Гарбузова М.А., 2007; TheodoreW. Kurtz, MichalPravenеs,2008] обсуждается возможность уменьшения инсулинорезистентности при воздействии на рецепторы ангиотензиногену счет стимуляции ядерных PPAR рецепторов, активируемых пролифераторами пероксиса, причем этот эффект сопоставим с действием гипогликемических препаратов [Цветкова О.А., Мустафина М.Х., 2009].
По результатам нашей работы отмечено, что аллель Т достоверно чаще встречается в группе больных с МС (р0,05), что позволило рассчитать отношение шансов развития МС. Установлено, то на 90% уровне значимости во второй группе чаще встречается аллель Т гена AGT (OR=\,26) и данный результат позволяет говорить о прогностическом значении данного аллеля при оценке риска развития метаболического синдрома у пациентов с артериальной гипертензией, что подтверждает данные литературы о значении данного аллеля в формировании метаболического синдрома [Нгуен Тхи Чанг., 2010; Fossum Е., Berge К.Е., Hieggen А., 2001].
При анализе гена АСЕ отмечается увеличение частоты развития МС у больных с генотипами ID и DD (53% среди пациентов второй группы и 42% среди пациентов первой группы). Согласно литературным данным [Ройтберг Г.Е., Дорош Ж.В., Аксенов Е.В., 2013; ChungO., StollM., UngerT., 1996; JohnstonC.L, RisvanisJ., 1997], существует взаимосвязь полиморфизма гена АСЕ и нарушения углеводного обмена посредством влияния на чувствительность периферических тканей к инсулину. Кроме того, была выдвинута теория о специфическом эффекте полиморфизма гена АСЕ на функцию -клеток поджелудочной железы [Ройтберг Г.Е., Дорош Ж.В., Аксенов Е.В., 2013]. В работе Маркозашвили Д.Т. (2005) высказано предположение, что уровень инсулина в крови у больных с МС ассоциирован с полиморфизмом гена ACE, наибольшая его концентрация выявлялась у гомозигот II по гену ACE.
На основании полученных нами данных (достоверно высокий уровень гликемии, тенденция к увеличению частоты аллеля D в группе пациентов с МС, во второй группе исследуемых отмечены более ранние углеводные нарушения), можно предположить наличие ассоциации аллеля D гена ACE с метаболическим синдромом. Однако необходимо отметить возможное влияние терапии -блокаторами, применяемых у данных пациентов, на реализацию метаболического синдрома у пациентов, у которых в генотипе присутствует полиморфный аллель D гена АСЕ, что подтверждается имеющимися данными литературы [Волков В.И., Серик С.А., 2008; Craickshank J.M., 2000].
Анализ проводимой гипотензивной терапии у больных при анализе влияния гена AGTR1 в совокупности с известными данными о возможности патогенетической связи между АГ и СД при одновременном воздействии на имидазолиевые рецепторы головного мозга поджелудочной железы [Штрыгаль С.Ю., 2003; Рrell G. et al., 2004], привело к пониманию патофизиологических особенностей в формировании АГ в зависимости от наличия аллеля С в генотипе обеих группах.
Так, у больных с аллелем С гена AGTR1 в генотипе отмечено достоверно олее частое сочетание АГ метаболическим синдромом, достоверно более частое назначение блокаторов имидазолиевых рецепторов, в связи с чем высказано предположение, что данный механизм может быть ведущим при реализации АГ именно у больных с генотипами АС и СС и состоит в одновременном формировании артериальной гипертензии и метаболического синдрома у пациентов с наличием в генотипе аллеля С гена AGTR1, что необходимо учитывать при выборе адекватной терапии обеих патологий.