Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Регулируемая клеточная гибель в реализации механизмов ремоделирования миокарда (обзор литературы) 15
1.1. Особенности ремоделирования миокарда в процессе адаптации к экстремальным воздействиям 15
1.2. Современные представления о механизмах клеточной гибели 18
1.2.1. Роль аутофагии в развитии ремоделирования миокарда 22
1.2.2. Роль апоптоза в развитии ремоделирования миокарда 28
1.3 Цитопротективная терапия как инновационный метод регулирования клеточной гибели 32
Глава 2. Материал и методы исследования 36
2.1. Характеристика групп экспериментальных животных 36
2.2. Экспериментальная модель очагового ишемического повреждения миокарда левого желудочка 37
2.3. Экспериментальная модель острой гемодинамической перегрузки левого желудочка 38
2.4. Экспериментальная модель диффузного поражения миокарда 39
2.5. Морфологические методы исследования
2.5.1. Методика морфологического исследования гистологических срезов миокарда левого желудочка 39
2.5.2. Методика иммуногистохимического исследования аутофагии и апоптоза кардиомиоцитов левого желудочка 40
2.6. Статистическая обработка данных 41
Глава 3. Влияние острой очаговой ишемии на морфологическое состояние миокарда левого желудочка и экспрессию белков BECN1, BAX, BCL-2 42
3.1. Морфологическая характеристика миокарда левого желудочка на различных сроках острой очаговой ишемии 44
3.2. Экспрессия белка BECN1 в миокарде левого желудочка при острой очаговой ишемии. 48
3.3. Экспрессия белка BAX в миокарде левого желудочка при острой очаговой ишемии 52
3.4. Экспрессия белка BCL-2 в миокарде левого желудочка при острой очаговой ишемии 55
Глава 4. Влияние острой гемодинамической перегрузки на морфологическое состояние миокарда левого желудочка и экспрессию белков becn1 и bax 60
4.1. Морфологическая характеристика миокарда левого желудочка на различных сроках его острой гемодинамической перегрузки 61
4.2. Экспрессия белка BECN1 в миокарде левого желудочка при его острой гемодинамической перегрузке 65
4.3. Экспрессия белка BAX в миокарде левого желудочка при его острой гемодинамической перегрузке 68
Глава 5. Особенности морфофункционального состояния миокарда, оценка экспрессии белка becn1 при острой дифтерийной интоксикации 74
5.1. Морфологическое состояние миокарда левого желудочка при острой дифтерийной интоксикации. 75
5.2. Интенсивность экспрессии белка BECN1 в миокарде левого желудочка при острой дифтерийной интоксикации 80
Глава 6. О роли механизмов реализации аутофагии и апоптоза в структурных изменениях миокарда при альтерации сердца различного генеза 83
6.1. Особенности механизмов аутофагии и апоптоза при очаговом ишемическом повреждении миокарда левого желудочка 83
6.2. Об особенностях влияния острой гемодинамической перегрузки левого желудочка на некоторые механизмы, опосредующие аутофагию и апоптоз кандиомиоцитов 90
6.3. Аутофагия в патогенезе структурно-функциональных изменений миокарда при токсическом повреждении сердца 93
Заключение 98
Практические рекомендации 99
Перспективы дальнейшей разработки темы 100
Список литературы
- Современные представления о механизмах клеточной гибели
- Экспериментальная модель диффузного поражения миокарда
- Экспрессия белка BCL-2 в миокарде левого желудочка при острой очаговой ишемии
- Экспрессия белка BECN1 в миокарде левого желудочка при его острой гемодинамической перегрузке
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение изменений тканевого гомеостаза
миокарда при различных патологических процессах на протяжении многих
десятилетий ляется одним из самых приоритетных направлений
экспериментальных исследований области патофизиологии сердечно-
сосудистой системы. Острая заинтересованность данной проблемой обусловлена тем, то кардиологические заболевания занимают ведущие позиции среди причин смерти от неинфекционных заболеваний с постоянной тенденцией осту уровня заболеваемости, по данным статистических исследований ВОЗ [ВОЗ, 2015]. В то же время методы консервативного лечения, используемые в современной кардиологической практике, направлены преимущественно на замедление прогрессирования заболевания, но чаще всего они не обеспечивают полноценного восстановления морфо-функциональных свойств измененного миокарда. В связи с этим очевидна необходимость более детального изучения молекулярных и клеточных основ патогенеза различных по своей природе заболеваний миокарда.
На сегодняшний день описано уже более десятка различных типов клеточной гибели, которые, согласно современной классификации, подразделяются на две основные группы: «возникшая в результате несчастного случая» (от англ. accidental cell death, ACD) и генетически запрограммированная «регулируемая» клеточная смерть (от англ. regulated cell death, RCD). При этом под «программированной клеточной гибелью» (от англ. programmed cell death, PCD) подразумевается исключительно физиологические случаи RCD, возникающие без нарушения функционального состояния клетки, например, при эмбриональном развитии [L. Galluzzi et al., 2015].
В физиологических условиях существенную роль в поддержании гомеостаза миокарда играют процессы ак апоптоза, ак и аутофагии. Структура и функции кардиомиоцитов (КМЦ) тесно связаны с феноменом аутофагии, представляющей собой один из механизмов внутриклеточной регенерации, а также способ регулируемой клеточной гибели. При крайне ограниченном регенераторном потенциале миокарда существует непрерывный процесс обновления клеток в сердце взрослого организма, включающий в себя ликвидацию и замещение отдельных элементов поврежденной ткани сердца. Во время эмбриогенеза апоптоз участвует развитии сердечных клапанов, проводящей системы и коронарных артерий [D. Qi et al., 2012]. В патологических условиях изменение активности механизмов, участвующих в реализации аутофагии и апоптоза КМЦ, наблюдается при некоторых видах повреждения сердца, возникающих, например, при ишемической болезни сердца, гемодинамической перегрузке и диффузных поражениях различного генеза [M. Li et al., 2016]. Одним из ключевых клеточных механизмов, который
опосредует стресс-индуцированную адаптацию, является аутофагия, имеющая характер функционально-резервного механизма компенсации энергетического потенциала клетки, восприимчивого к фармакологическому или генетическому регулированию [B. Loos et al., 2013]. Несмотря на то , что аутофагия может сопровождать регулируемую клеточную гибель [E. White, 2012; G. Marino et al., 2014], не во всех случаях она способствует её реализации [M. Elgendy et al., 2011; S.Y. Chen et al., 2011; D. Denton et al., 2012, 2013; Y. Liu et al., 2013; H. Varma et al., 2013; K. Nihira et al., 2014]. При этом механизмы, с помощью которых терапевтически индуцированная аутофагия может вызвать гибель клеток, остались в значительной степени не изучены [L. Kohli et al., 2013].
Согласно результатам ряда исследований, апоптоз КМЦ играет важную роль в патогенезе сердечной недостаточности при хронической перегрузке миокарда левого желудочка (ЛЖ) [А.П. Хлапов и др., 2008; Е.Н. Березикова, 2014]. Однако большое внимание уделяется также механизмам регулируемой клеточной гибели при остром повреждении миокарда [А.В. Ушаков и др ., 2006].
Определенные патологические процессы в сердечно-сосудистой системе сопровождаются явлениями регулируемой клеточной гибели КМЦ, в частности, апоптозом или аутофагией. Последние по своей природе являются защитными механизмами, обеспечивающими сохранение нормального метаболизма как на клеточном, так и на тканевом уровне, однако, процессы регулируемой клеточной гибели могут участвовать в патогенезе хронической сердечной недостаточности на фоне первичной альтерации миокарда. Роль механизмов клеточной гибели в реализации компесаторно-приспособительных процессов при остром повреждении сердца по -прежнему до конца не определена, что требует дальнейшего исследования.
Степень разработанности темы. На сегодняшний день накоплено значительное число данных о механизмах активации и реализации регулируемой клеточной гибели в процессе ремоделирования миокарда при различных заболеваниях сердечно-сосудистой системы. Разработана новая классификация клеточной гибели, учитывающая возможность управления механизмами гибели клеток, а также методы генетической и молекулярной терапии, направленной на сохранение функционально-активных структурных элементов миокарда.
Выявлена значимая роль клеточной гибели в сохранении нормальной функции миокарда на ранних стадиях ремоделирования сердца. При этом по-прежнему в ис следованиях компесаторно-приспособительных реакций с участием процессов гибели КМЦ преимущество отдается изучению хронических поражений сердечной мышцы.
Цель исследования. Изучить в эксперименте особенности отдельных видов регулируемой гибели КМЦ, а также патоморфологические изменения миокарда при очаговой ишемии ЛЖ, острой гемодинамической перегрузке ЛЖ и диффузном токсическом повреждении миокарда.
Задачи исследования
-
Дать качественную и количественную оценку морфологическому состоянию миокарда при острой очаговой ишемии ЛЖ и оценить активность процессов инициации BECN1-опосредованной аутофагии КМЦ пренекротической зоны.
-
Изучить механизмы внутриклеточной сигнализации апоптотических процессов в КМЦ ЛЖ на фоне ишемического повреждения.
-
Провести анализ собенностей индукции BECN1-индуцированной аутофагии КМЦ, а также оценить патоморфологические изменения сердечной мышцы при острой гемодинамической перегрузке миокарда ЛЖ.
-
Исследовать особенности активации внутреннего (митохондриального) апоптогенного пути клеточной гибели при острой перегрузке ЛЖ.
-
Оценить морфологическое состояние миокарда и процессы BECN1-зависимой аутофагии в КМЦ ЛЖ при диффузном токсическом поражении сердца.
Научная новизна. Впервые проведено исследование процессов индукции BECN1-опосредованной аутофагии при остром повреждении сердечной мышцы (очаговой ишемии ЛЖ, острой гемодинамической перегрузке ЛЖ и диффузной интоксикации сердца).
Получены принципиально новые данные о механизмах BECN1-зависимой аутофагии и митохондриального пути активации апоптотической гибели КМЦ при острой очаговой ишемии ЛЖ и острой гемодинамической перегрузке ЛЖ.
Определены пути инициации данных типов регулируемой клеточной гибели КМЦ. Данные иммуногистохимического исследования показали, что при моделировании инфаркта миокарда апоптоз КМЦ пренекротической зоны происходит в большей степени по внутреннему (митохондриальному) пути, в то время как при гемодинамической перегрузке ЛЖ для КМЦ характерно угнетение данного сигнального пути активации апоптоза.
Впервые установлено, что в отличие от очагового повреждения миокарда при распространенном патологическом процессе токсического и гемодинамического генеза индуцирование BECN1-ассоциированной аутофагии снижается.
Теоретическая и практическая значимость. На основе проведённого исследования внутриклеточных механизмов реализации аутофагии и апоптоза КМЦ ЛЖ при различных патологических процессах выработан новый взгляд на
реализацию внутриклеточных механизмов на ранних стадиях ремоделирования миокарда. Полученные данные могут быть использованы ля поиска и разработки лечебно-профилактических мероприятий, направленных на управление процессами клеточной гибели КМЦ с целью восстановления морфофункционального состояния поврежденного миокарда. Полученные результаты открывают нвые перспективы для понимания молекулярных механизмов развития и прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний.
Методология и методы диссертационного исследования. Особенности
развития процессов аутофагии и апоптоза КМЦ и морфологических изменений
миокарда ЛЖ исследованы на экспериментальных моделях острой очаговой
ишемии, гемодинамической перегрузки ЛЖ диффузного токсического
поражения сердечной мышцы. Механизмы реализации аутофагии и апоптоза
изучались методом иммуногистохимии с применением первичных козьих
поликлональных антител и системы детекции с использованием вторичных
козьих антител «ImmunoCruz goat LSAB Staining System»
(«SantaCruzBiotechnology Inc.», США). Световая микроскопия гистологических
срезов проводилась помощью микроскопа «Nikon Eclipse Е400» и
видеосистемы «ТаиVideo» с программой «Тау Морфология» на основе камеры «Watec 221s».
Автор диссертационного исследования выражает благодарность д.м.н. Н.В. Ягловой, заведующей лабораторией развития эндокринной системы Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт морфологии человека», за помощь в проведении иммуногистохимического исследования.
Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы внедрены учебный процесс на кафедре общей патологии и патологической физиологии имени В.А. Фролова медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки РФ.
Положения, выносимые на защиту
-
При острой ишемии ЛЖ очаговые нарушения архитектоники миокарда сопровождаются активацией процессов инициации BECN1-зависимой аутофагии КМЦ. Апоптогенная сигнальная трансдукция в КМЦ пренекротической зоны ЛЖ осуществляется за счет внутреннего (митохондриального) пути.
-
Острая гемодинамическая перегрузка ЛЖ, вызванная стенозированием восходящей аорты, приводит к развитию распространенных деструктивных изменений миокарда, а также угнетению BECN1-опосредованной аутофагии КМЦ ЛЖ и подавлению экспрессии белка ВАХ с последующей супрессией внутреннего пути индукции апоптоза.
3. Диффузное токсическое поражение сердца вызывает угнетение BECN1-индуцированной аутофагии КМЦ ЛЖ на фоне выраженного воспалительного ответа.
Степень достоверности. Данное экспериментальное исследование выполнено на животных, полученных из питомника «Манихино», при достаточном объёме выборки. Качество животных подтверждено сертификатом качества и сертификатом ровья, выданными поставщиком. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование проводили на оборудовании, сертифицированном ля данного вида работ. акже применялись методы статистической обработки, полностью соответствующие поставленным задачам.
Апробация результатов работы. Работа апробирована на III
международной студенческой научно-практической конференции с участием
молодых ученых «Клинические еоретические аспекты современной
медицины», г. Москва, 2011 г.; Semmelweis International Students' Conference, Budapest, 2012 г.; на международной научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», г. Москва, 2014 г.; The 61-st annual conference of the Israel Heart Society in association with the Israel Society of Cardiothoracic Surgery, Tel Aviv, 2014 г.; на VI международной научной конференции «Science4Health», г. Москва, 2015 г.; на Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», г. Москва, 2016 г.; на совместном заседании кафедры общей патологии и патологической физиологии имени В.А. Фролова и кафедры патологической анатомии медицинского института РУДН, 2016 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том
числе 3 татьи журналах, входящих перечень, утверждённый ВАК
Министерства образования и науки РФ.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, 4-х глав, которых изложены результаты собственного исследования и их обсуждения, заключения и списка литературы. Диссертация изложена на 141 странице машинописного екста, содержит 4 таблицы и 25 рисунков. Библиография включает 262 источника российской и зарубежной литературы.
Современные представления о механизмах клеточной гибели
Впервые термин ремоделирование был использован в качестве характеристики замещения рубцовой тканью миокарда при острой очаговой ишемии в эксперименте J.S. Hockman и B.H. Bulkley в 1982 году, а в последующие годы – для описания различных клинических случаев и патологических изменений сердечной мышцы [J.S. Hockman et al., 1982; P.S. Azevedo et al., 2016]. В этой связи, в 2000 г. на Международном форуме по ремоделированию сердца в США понятие ремоделирование сердца было расширено и определено как генетически запрограммированный комплекс молекулярных, клеточных и интерстициальных процессов, возникающих при повышенной нагрузке или непосредственной альтерации сердечной мышцы, клинически проявляющийся изменением размера, формы и функции сердца, и зависящий от гемодинамической нагрузки, нейрогормональной активации и других факторов [J.N. Cohn et al., 2000; Г.Р. Клочкова, 2011; М.В. Данилишина, 2012].
Ремоделирование сердца может развиваться как при физиологических (в качестве компенсаторно-ремоделирующих изменений в пропорциях и функции сердца при повышенных физических нагрузках), так и при патологических состояниях, в частности, при инфаркте миокарда, перегрузке давлением (аортальный стеноз, гипертония), воспалительных заболеваниях сердечной мышцы (миокардит), идиопатической дилатационной кардиомиопатии или объмной перегрузке (клапанной регургитации). Хотя этиология этих заболеваний различна, их объединяет ряд общих молекулярных, биохимических и механических процессов, развивающихся на ранней стадии и являющихся механизмом развития сердечной недостаточности.
Одной из важнейших детерминант ремоделирования сердца является гибель КМЦ, приводящее к потере функционально-активных единиц миокарда и прогрессированию заболевания [Е.Ю. Москалева и др., 2006].
Окислительный стресс является одним из ключевых факторов в развитии ремоделирования сердца и характеризуется повышенной биодоступностью активных форм кислорода (АФК) из-за дисбаланса между их образованием различными прооксидантными ферментными системами и устранением с помощью механизмов эндогенной антиоксидантной защиты [M. Narasimhan et al., 2015; Л.В. Селина и др., 2013; Л.Г. Прошина и др., 2010]. Белок Nrf2 (nuclear factor erythroid-2 related factor 2) является одним из ключевых транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию кластера антиоксидантных и дезинтоксикационных генов [V.R. Muthusamy et al., 2012; J. Zhang et al., 2012]. Роль фактора транскрипции Nrf2 определена как при остром повреждении миокарда, так и при развитии сердечной недостаточности [V.R. Muthusamy et al., 2012; N.S. Rajasekaran et al., 2011; R. Erkens et al., 2015]. Непосредственно белок Nrf2 не ингибирует апоптоз, однако, подавляет протеотоксический некроз КМЦ путем усиления аутофагического клиренса убихинон-связанных токсичных белков [S.E. Purdom-Dickinson et al., 2007]. Установлено, что экспрессия Nrf2 в КМЦ подавляет дезадаптивное сердечное ремоделирование в ответ на перегрузку давлением [W. Wang et al., 2014]. При этом дефицит Nrf2 сопровождается ранним началом ремоделирования и последующим развитием сердечной недостаточности [Y. Tan et al., 2011; Y. Xing et al., 2012]. Особую роль в развитии компесаторно-приспособительных реакций миокарда играют фибробласты. У грызунов пик числа сердечных фибробластов достигается в течение 3-х дней после реперфузионного повреждения, однако, через четыре недели после травмы снижается на 90% по сравнению с его пиком, демонстрируя динамичный характер популяции фибробластов в области альтерации [P. Christia et al., 2013]. Активированные фибробласты секретируют сократительные белки, такие как альфа-актин гладких мышц (миофибробластов) и белки внеклеточного матрикса (в основном коллаген), а также экспрессируют ряд генов паракринных кардиопротективных и ангиогенных факторов (HGF, VEGF, PDGFb, ANG1, ANG2, IGF1, TGFb) [A. Deb et al., 2014; С.В Павлова и др., 2015; П.М. Губская и др., 2013]. Ранняя фиброзная реакция имеет решающее значение для поддержания сердечной структурной целостности и производительности миокарда после повреждения.
Также получены данные, продемонстрировавшие способность фибробластов к прямой трансформации в «кардиомиоцитоподобные» клетки in vivo и in vitro под воздействием микроРНК, белков Mesp1 и Myocardin [T.M. Jayawardena et al., 2012; R. Wada et al., 2013]. Кроме того, недавние исследования показали определенную связь между FGF (fibroblast growth factor) и аутофагией через взаимодействие c mTOR (mammalian target rapamycin), который положительно регулируется клеточным сигнальным путем PI3K/Akt [J. Zhang et al., 2012; X. Lin et al., 2011]. Активация последнего имеет важное значение для выживаемости клеток миокарда. В частности, имеются данные, согласно которым фосфорилированый mTOR проявляет кардиопротекторые свойства за счет угнетения аутофагии и активации восстановительных процессов ишемизированного миокарда [S. Sciarretta et al., 2014].
Экспериментальная модель диффузного поражения миокарда
Острая гемодинамическая перегрузка ЛЖ сердца моделировалась у кроликов посредством операции путем сужения просвета восходящей аорты на 1/3 с использованием металлической спирали меньшего диаметра в соответствии со следующей методикой. Вначале, до оперативного вмешательства, выполнялась фиксация животного в станке спиной книзу. Далее, в стерильных условиях под внутривенным наркозом (2% рометар 2 – 2,5 мл) и местной анестезией (0,5% новокаин 2 – 2,5 мл в 3 межреберье слева) производилось послойное вскрытие грудной клетки в 3-м межреберье слева. Предварительно в полость плевры вводился 1,0 мл 0,5% раствора новокаина. Животное переводилось на искусственную вентиляцию лгких. С помощью ранорасширителя обеспечивалась экспозиция. В полость перикарда вводился 0,5 мл 0,5% раствора новокаина и производилось широкое рассечение перикарда. Далее выделялся восходящий отдел аорты с помощью лигатуры. Проводилось измерение диаметра аорты и наложение с помощью зажима на аорту спирали, внутренний диаметр витка которой составлял 2/3 от диаметра просвета аорты. В результате просвет восходящей аорты оказывался уменьшенным на 1/3 от исходного. Лигатура извлекалась и в грудную полость вводился бициллин-5 в дозе 250000 ЕД. Операционная рана послойно зашивалась. Из плевральной полости откачивался воздух.
Моделирование диффузного поражения сердечной мышцы производилось у кроликов путм однократного внутривенного введения 0,3 DLM/1 кг (DLM – минимальная летальная доза) нативного дифтерийного токсина, который предварительно оттитровывался на морских свинках. 1 DLM токсина соответствовала такому его количеству, которое при внутрибрюшинном введении морской свинке вызвало гибель более 50% животных в течение 3 суток [В.А. Фролов, М.В. Далин, 1996].
С помощью морфологических методов изучали структурные особенности миокарда, механизмы аутофагии и апоптоза КМЦ ЛЖ. У животных под общим наркозом (см. выше) вскрывалась грудная клетка, выполнялась экстирпация сердца и перфузия его через восходящую аорту 0,9% раствором NaCl. Из свободной стенки ЛЖ иссекали фрагменты миокарда размером 5х5 мм и фиксировали в течение 72 часов в 4% нейтральном параформальдегиде. Затем материал обрабатывали в заливали в парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы толщиной 5 мкм изготавливали на микротоме Slidt-2003 (Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические срезы исследовались с помощью светового микроскопа «Nikon Eclipse E400» при увеличении 400х и видеосистемы «TauVideo» с программой «Тау Морфология» на основе камеры «Watec 221s». При этом анализировали 90 полей в каждой серии эксперимента. Морфометрический анализ проводили в каждом поле зрения: определяли в объмных процентах (об.%) относительное содержание в миокарде миофибрилл, ядер, сосудов, участков деструкции и межклеточных пространств с помощью сетки Автандилова [Г.Г. Автандилов, 1990]. Также рассчитывали «ядерно-цитоплазматическое отношение»: процентное отношение площади ядер КМЦ к площади мышечных волокон.
Используя блоки препаратов (п. 2.5.1.), изготавливали гистологические срезы толщиной 5 мкм на микротоме «Slidt-2003» (Германия) и наносили на сткла с поли-L-лизиновым адгезивным покрытием «Superfrost Ultra Plus» («Mentzel Glasser», Германия). Срезы депарафинировали ксилолом и проводили по спиртам нисходящей концентрации.
Иммуногистохимическое исследование процессов, опосредующих явления аутофагии и апоптоза в КМЦ, проводилось методом оценки экспрессии белков BECN1, BCL-2 и BAX.
Белок BECN1 является одним из важнейших в сигнализации интерактома аутофагии и рекомендован руководством по использованию и интерпретации анализов для мониторинга аутофагии (3-е издание, 2016) [D.J. Klionsky et al., 2016]. К тому же ранее было установлено, что BECN1 находится в связанном состоянии с антиапоптическим белком BCL-2, что предполагает тесную взаимосвязь между механизмами инициации аутофагии и апоптоза [S. Pattingre et al., 2005]. Белок BAX относится к проапоптозным белкам и совместно с белком BCL-2 участвует в реализации митохондриального пути инициации апоптоза. В настоящем исследовании для иммуногистохимического выявления экспрессии вышеуказанных белков использовались первичные козьи поликлональные антитела («SantaCruzBiotechnology Inc.», США). Результаты реакции визуализировали при помощи системы детекции с использованием биотинилированных вторичных козьих анти-кроличьих антител «ImmunoCruzTM goat LSAB Staining System» («SantaCruzBiotechnology Inc.», США). Препараты докрашивали гематоксилином Майера («Биовитрум», Россия). Иммуногистохимическая реакция считалась положительной при появлении коричневой окраски в цитоплазме КМЦ с неповрежденной плазматической мембраной. Микроскопия срезов миокарда проводилась в 120 полях зрения в каждой серии эксперимента при 200-кратном увеличении с использованием сетки Автандилова . При этом определяли отношение количества равноудаленных точек, приходящихся на позитивно окрашенную цитоплазму КМЦ, к общему количеству точек , занимаемых цитоплазмои миофибрилл (в процентах).
Все числовые данные подвергались статистической обработке с использованием программного обеспечения «Google Sheets» (Google Inc., 2014), программы «Biostat» (McGraw-Hill, Inc., 1993). Вычислялась величина среднего значения, ошибки среднего, среднего квадратического отклонения. При этом использовали t критерий Стьюдента (за достоверную принималась разность средних при p0.05).
Экспрессия белка BCL-2 в миокарде левого желудочка при острой очаговой ишемии
Резюмируя изложенное в данной главе, можно сказать, что, во-первых, при острой гемодинамической перегрузке, в отличие от ишемического повреждения ЛЖ, не происходит активации механизмов, ответственных за аутофагию КМЦ, о чм свидетельствуют результаты оценки экспрессии BECN1. Более того, на всех сроках исследования данный показатель достоверно ниже по сравнению с контролем (рис. 19). Следует предположить, что в миокарде ЛЖ интактных кроликов аутофагия на уровне 3% вероятнее всего является механизмом мобилизации внутриклеточных ресурсов, а не проявлением регулируемой клеточной гибели. Соответственно, данный поддерживающий КМЦ механизм лишь угнетается при острой перегрузке, что, по-видимому, связано с глубоким дефицитом энергии в клетках сердечной мышцы в результате внезапного повышения сопротивления сердечному выбросу. Казалось бы, при сравнении результатов морфологического исследования миокарда на разных моделях альтерации можно сделать вывод о том, что при острой перегрузке ЛЖ патоморфологические изменения менее выражены, чем при очаговой ишемии. Однако следует принять во внимание, что в первом случае моделируемый патологический процесс распространяется практически на весь миокард ЛЖ, а во втором – только на ту его ограниченную область, которая примыкает к очагу некроза.
Что касается апоптотических механизмов, то, согласно, нашим данным, экспрессия проапоптозного фактора BAX также не увеличивается в КМЦ ЛЖ при острой гемодинамической перегрузке последнего, а, напротив, даже достоверно ниже контроля на 1-х и 5-х сутках процесса и имеет тенденцию к снижению на 3-и сутках. Однако при сопоставлении полученных данных с результатами исследования маркеров апоптоза, выполненного ранее на той же модели, можно сделать вывод о том, что интенсивность апоптоза КМЦ вс же увеличивается, но его механизмы реализуются не через митохондриальный (внутренний) путь, а посредством рецепторного (внешнего) пути. Так, при острой гемодинамической перегрузке ЛЖ достоверно увеличивается индекс апоптоза (рассчитанный на основании определения содержания фрагментированной ДНК методом TUNEL), а также увеличивается активность каспазы-8, являющейся ключевым ферментом, ответственным за передачу апоптогенного сигнала по рецепторному (внешнему) пути [М.Л. Благонравов, 2011].
Содержание белка BECN1 и BAX в КМЦ ЛЖ миокарда кроликов в контроле и на 1, 3 и 5 сутки острой гемодинамической перегрузки миокарда ЛЖ. Примечание: ( ) – значения, достоверно отличающиеся от контроля при p0.05. По сравнению с ишемической моделью повреждения миокарда, острое гемодинамически значимое стенозирование восходящего отдела аорты приводит к более обширным (но менее глубоким) патоморфологическим изменениям. В связи с этим развивающиеся в ответ компенсаторно-приспособительные реакции миокарда, по-видимому, в большей степени направлены на стабилизацию системных гемодинамических нарушений и увеличению функционально-активных единиц миокарда, чем на сохранение нормальной структуры.
С одной стороны, можно предположить отрицательную роль угнетения процессов аутофагии, рассматривая ее как некий патогенетический механизм сохранения клеточного гомеостаза при экстремальных воздействиях, с позитивной стороны, ингибирование аутофагии может препятствовать развитию аутофагической гибели, сохраняя жизнеспособные КМЦ при острой перегрузке ЛЖ.
Ввиду угнетения аутофагии, предполагающей главным образом самоподдреживающий механизм КМЦ при резком нарастании сопротивления сердечному выбросу, не оставляет сомнений важность снижения постнагрузки при некоторых формах гипертонического криза с целью предотвращения развития таких осложнений, как острая левожелудочковая недостаточность, расслоение аорты, недостаточности коронарного кровоснабжения и других.
Экспрессия белка BECN1 в миокарде левого желудочка при его острой гемодинамической перегрузке
Наиболее существенные изменения при исследовании диффузного поражения миокарда были обнаружены в митохондриях, особенно в белках, участвующих в окислительном фосфорилировании, антиоксидантной защите и реактивации митохондриального стресса. Также было установлено, что происходит увеличение числа шаперонов и белков, участвующих в шаперон-опосредованной аутофагии [M. Strba et al., 2011]. Интересно отметить, что Dox-индуцированная аутофагическая реакции может быть специфична в зависимости от видовой принадлежности. Так, было показано, что применение Dox стимулирует аутофагию в моделях крыс, но подавляет у мышей [A.J. Dirks-Naylor, 2013].
В другом исследовании было установлено, что Dox-индуцированная кардиомиопатия сопровождается устойчивым резким повышением уровня LC3-II на начальных стадиях интоксикации [Y. Ding et al., 2011].
При изучении животных с пониженной аутофагической активностью вследствие недостаточности BECN1 (+/-), подверженных воздействию доксорубицина, структурные и функциональные изменения в миокарда были значительно меньше по сравнению с животными, экспресирующими BECN1, у которых развивался усиленный кардиотоксический ответ. На основе данные результатов можно предположить, что снижение инициации аутофагии защищает от Dox-индуцированной кардиотоксичности [D.L. Li et al., 2016].
Также показано, что ингибирование чрезмерной ROS- и mTOR-индукции аутофагии посредством подавления активности AMPK и стимулирование активности р38-МАРК эффективно повышает выживание КМЦ и сохраняет структуру миокарда при интоксикации доксициклином [X. Wang et al., 2014].
Механизмы реализации ремоделирвоания были также рассмотрены при диффузном токсическом воздействии адреналина на миокард. Отмечено, что содержание ядерного белка p53 в процессе нарастания интоксикации увеличивается [Т.В. Шканд и др., 2014], что способствует развитию не только апоптоза, но и, как сообщается в некоторых исследованиях, аутофагии. В ядре белок р53, транскрипционный фактор, способствует экспрессии проапоптотических белков (таких как ВAX, BID, PUMA и Noxa) и ингибированию экспрессии BCL-2, что инициирует внутренний путь апоптоза. В цитоплазме р53 активирует рецептор TRAIL и рецептор Fas, вызывая инициирование апоптоза по внешнему пути [J.S. Fridmanet al., 2003]. В последнее время все большее число исследований показывают, что р53 также участвует в регуляции аутофагии. Сообщается, что генотоксический стресс вызывает аутофагию с участием контролируемого р53 гена DRAM (damage-regulated autophagy modulator), сигнальный каскад которого способствует образованию аутолизосом [D. Crighton et al., 2006]. Другое исследование показало угнетающее действие р53 на аутофагию путем дезактивазии AMPK, а затем индукции сигнального пути mTOR [E. Tasdemir et al., 2008]. Кроме того, было показано, что в условиях недостаточного поступления питательных веществ р53 подавляет LC3, контролируя аутофагический каскад и предотвращая аутофагическую гибель клетки [R. Scherz-Shouval et al., 2010].
Также нельзя исключить нарушение внутриклеточного обмена Ca2+ в инициации аутофагии [M.R. Kandadi et al., 2012a]. Как показали результаты исследования миокарда при токсическом воздействии токсина сибирской язвы, летальная сердечная недостаточность опосредована индукцией аутофагии на фоне нарушения функции эндоплазматического ретикулума и сопутствующего обмена Ca2+ [M.R. Kandadi et al., 2012b].
При кардиомиопатии различной этиологии происходит накопление большого числа дефектных митохондрий, приводящее к энергетическому дисбалансу и возможному нарушению процессов реализации аутофагии [В.Г. Цыпленкова, 2014; Н.Г. Мальцева и др., 2015]. Учитывая вышеизложенное, можно сделать вывод о том, что при диффузном токсическом поражении миокарда ингибирование процессов аутофагии носит скорее защитный характер, либо снижение экспрессии белка BECN1 вызвано непосредственным влиянием дифтерийного токсина на механизмы реализации аутофагии.
Повышение ядерно-цитоплазматического индекса указывает на явления гипертрофии КМЦ. Однако на ранних срока он остается практически неизменным во всех моделях альтерации миокарда. Согласно исследованиям М.М. Азовой и соавт. (2012), можно предположить, что явления гипертрофии миокарда развиваются на более поздних сроках ремоделирования сердца. Аутофагия является фундаментальным лизосомально-опосредованным процессом катаболизма, который участвует в поддержании таких внутриклеточных структур, как долгоживущие белки и органеллы. В определенной степени аутофагия является эндогенным защитным механизмом, участвующим в адаптивном иммунном ответе. Недостаточная или избыточная интенсивность аутофагии нарушает гомеостаз клетки, а также может способствовать гибели клеток или вызывать е.
Многочисленные исследования подтверждают значимое увеличение активности аутофагии клеток в миокарде при широком спектре заболеваний сердца, а также как ответ на воздействие различных патологических факторов. В последнее время, несмотря на понимание двойственного характера аутофагии, широко дискутируется возможность управления данным явлением в качестве терапевтического метода при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, включая сердечную недостаточность.