Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Возможности использования наночастиц серебра в медицине (обзор литературы) 13
1.1. Исторические аспекты применения серебра в медицине 13
1.2. Нанотехнологические методы модификации физико-химических свойств серебра 19
1.3. Практическое значение и возможности использования наночастиц серебра при лечении патологических процессов 24
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 36
2.1. Физико-химические характеристики композиции на основе наночастиц серебра 36
2.2. Дизайн исследования
2.2.1. Методы исследований на этапе in vitro 37
2.2.2. Методы исследований на этапе in vivo 39
2.2.3. Характеристика экспериментальных моделей при изучении влияния раствора наносеребра на ткани интактных животных 42
2.2.4. Характеристика экспериментальных моделей при изучении влияния раствора наносеребра на ткани животных при патологии
2.3. Забор материала для исследований 45
2.4. Методы определения неспецифических протеиназ и их ингибиторов 46
2.5. Методы морфологических исследований 48
2.6. Методы статистической обработки результатов 49
ГЛАВА 3. Влияние раствора наночастиц серебра на развитие патогенных и люминесцентных бактерий 50
ГЛАВА 4. Реакции в тканях легких, брюшины и слизистой желудка интактных крыс при эндотрахеальном, интраперитонеальном введении и пероральном приеме раствора наночастиц серебра 58
4.1. Изменение показателей протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и бронхоальвеолярном смыве интактных животных при эндотрахеальном введении раствора наночастиц серебра 58
4.2. Изменение показателей протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и перитонеальном смыве интактных животных при интраперитонеальном введении раствора наночастиц серебра 62
4.3. Изменение показателей протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и супернатанте гомогената слизистой желудка интактных животных при пероральном применении раствора наночастиц серебра 66
ГЛАВА 5. Влияние раствора наночастиц серебра на показатели протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови, бронхоальвеолярном и перитонеальном смыве, супернатанте гомогената слизистой желудка при моделировании воспаления 70
5.1. Изменения показателей протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и бронхоальвеолярном смыве при моделировании острой пневмонии на фоне эндотрахеального введения раствора наночастиц серебра 70
5.2. Изменения показателей протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и перитонеальном смыве при моделировании острого перитонита на фоне внутрибрюшинного введения раствора наночастиц серебра 77
5.3. Изменение показателей протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и супернатанте гомогената слизистой желудка при профилактике острой язвы желудка перорально раствором наночастиц серебра 84
5.4. Изменение показателей протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и супернатанте гомогената слизистой желудка при лечении острой язвы желудка перорально раствором наночастиц серебра... 88
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов и заключение 94
Выводы 117
Практические рекомендации 119
Список сокращений и условных обозначений... 120
Список использованной литературы
- Практическое значение и возможности использования наночастиц серебра при лечении патологических процессов
- Характеристика экспериментальных моделей при изучении влияния раствора наносеребра на ткани интактных животных
- Изменение показателей протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и перитонеальном смыве интактных животных при интраперитонеальном введении раствора наночастиц серебра
- Изменения показателей протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и перитонеальном смыве при моделировании острого перитонита на фоне внутрибрюшинного введения раствора наночастиц серебра
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Изучение биологических свойств наночастиц металлов, связанное с интенсивным развитием наномедицины и нанофармакологии, является одним из приоритетных современных направлений [Е.М. Егорова, А.А. Кубатиев, В.И. Швец, 2014; A.J. Thorley, T.D. Tetley, 2013]. Наномедицина изучает возможность применения нанотехнологий в медицинской практике для профилактики, диагностики и лечения различных заболеваний [И.С. Чекман, 2009]. Особый интерес в этой связи привлекает разработка и изучение механизмов действия препаратов на основе наночастиц серебра [Т.М. Бойчук и соавт., 2012].
Следует отметить, что препараты серебра, такие как колларгол и протаргол,
в течение длительного времени широко применялись как антисептические и
противовоспалительные средства [И.С. Чекман и соавт., 2008]. С появлением
нанотехнологий появились новые возможности в плане разработки более
эффективных препаратов с использованием наночастиц серебра [G. Franci et al.,
2015]. Установлено, что серебро в наноразмерном диапазоне обладает более
выраженным бактерицидным, противовирусным, противогрибковым и
антисептическим действием и служит высокоэффективным обеззараживающим
средством в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов [А.В.
Рыбачук, И.С. Чекман, 2009; M. Amin, F. Anwar et al., 2012]. За счет большей
удельной поверхности наночастиц увеличиваются области контакта
наносеребра с бактериями или вирусами, что значительно повышает его
бактерицидные свойства. Соответственно применение серебра в виде
наночастиц позволяет в сотни раз снизить концентрацию металла при сохранении всех его бактерицидных свойств [А.И. Гусев, 2007].
Интенсивными исследованиями последних лет показаны
противовоспалительные эффекты наночастиц серебра. В частности,
выраженный противовоспалительный эффект наночастиц серебра отмечен в экспериментах при моделировании воспалительного процесса кожных покровов лабораторных животных, обработанных динитрохлорбензолом [P. Nadworny et al., 2010]. Установлена способность наносеребра снижать активность провоспалительных медиаторов при моделировании термического повреждения кожи [S. Prabhu, E. Poulose, 2012]. При моделировании аллергического ринита у сенсибилизированных мышей показано, что интраназальное введение раствора наносеребра также эффективно уменьшает проявления воспаления [S. Seung-Heon, Y. Mi-Kyung, 2012].
Кроме того, возможности использования наночастиц серебра требуют дальнейшего детального исследования ввиду недостаточно изученного их влияния на различные ткани и системы организма [Э.Г. Акопова, А.Х. Каде, Е.Ф. Курносенкова и соавт., 2007]. Так, выявленные в экспериментах факты повышения уровня аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы при длительном пероральном приеме наночастиц серебра свидетельствуют о
возможном провоспалительном и токсическом действии [J. Cheraghi et al.,
2013]. Также, было установлено, что лечение ожогов 2 степени у крыс
ежедневным наложением раневой повязки, импрегнированной наночастицами
серебра, хоть и приводит к значительной интенсификации репарационных и
регенерационных процессов, однако через 21 день было отмечено
существенное повышение плазменных трансаминаз и инфильтрация
полиморфоядерных лейкоцитов вокруг центральной печеночной вены [S. Bidgoli et al., 2013]. Эти результаты обосновывают необходимость дальнейшего изучения и выявления пороговой терапевтической дозировки наносеребра с минимальным токсикологическим эффектом [И.С. Чекман и соавт., 2010].
На данный момент проведены многочисленные исследования по изучению антимикробной активности наночастиц серебра, стабилизированных в растворе с помощью различных материалов, однако противовоспалительные эффекты наночастиц серебра, стабилизированные в растворе альгинатом натрия, мало изучены. [A.A. Babanin et al., 2014].
Таким образом, изучение перспектив применения наночастиц серебра при
лечении воспалительных процессов, исследование возможных
токсикологических эффектов и патогенетическое обоснование оптимальных подходов к использованию наночастиц серебра являются актуальными и требуют дальнейшего углубленного изучения.
Цель исследования – экспериментальное патогенетическое обоснование возможности применения наночастиц серебра, стабилизированных в растворе альгинатом натрия, при лечении воспалительных процессов.
Задачи исследования:
-
Изучить влияние наночастиц серебра, стабилизированных в растворе альгинатом натрия, на рост и развитие патогенных и люминесцентных бактерий в исследованиях in vitro.
-
Изучить реакции в организме интактных крыс при пероральном, интраперитонеальном и эндотрахеальном введении раствора наночастиц серебра с альгинатным стабилизатором.
-
Выявить особенности формирования воспалительного процесса в легких на фоне эндотрахеального введения наночастиц серебра.
-
Изучить влияние наночастиц серебра на реакцию компонентов протеиназ-ингибиторной системы при развитии экспериментального перитонита.
-
Установить особенности формирования экспериментальной язвы желудка крыс на фоне профилактического и лечебного действия раствора наночастиц серебра с альгинатом натрия.
Научная новизна исследования.
Установлены эффекты наночастиц серебра, стабилизированных в растворе
альгинатом натрия, по ингибированию экспериментальных штаммов бактерий,
включая антибиотико-резистентный штамм Pseudomonas aeruginosa в
минимальной ингибирующей концентрации 0,2-0,5 г/л. Впервые
продемонстрирована способность наночастиц серебра ингибировать
светящиеся бактерии Photobacterium leiognathi Sh1 при концентрации 0,05 – 0,2 мг/л.
На основании реакций компонентов протеиназ-ингибиторных систем на системном и локальном уровне и изучения морфологической структуры легких, брюшины и стенки желудка показаны минимальные провоспалительные эффекты раствора наночастиц серебра с альгинатом натрия при однократном эндотрахеальном, интраперитонеальном введении и длительном пероральном приеме интактными животными.
Впервые экспериментально показана эффективность применения
наночастиц серебра при лечении острого воспалительного процесса при
моделировании обтурационной пневмонии, калового перитонита и
индометациновой язвы желудка и установлено, что применение наночастиц
серебра при воспалении сопровождается снижением активации
неспецифических протеиназ, сохранением антипротеиназного потенциала и уменьшением выраженности морфологических признаков воспаления.
Впервые проведена сравнительная оценка противовоспалительных
эффектов наночастиц серебра при профилактике и лечении экспериментальной острой язвы желудка и установлено, что применение раствора наночастиц серебра с альгинатом натрия сопровождается уменьшением воспалительных изменений при моделировании язвенного поражения слизистой желудка при сохранении локального антипротеиназного потенциала.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Результаты исследования позволили расширить представление об антимикробных и противовоспалительных эффектах наночастиц серебра, стабилизированных в растворе альгинатом натрия. Результатом работы стало экспериментальное патогенетическое обоснование возможности применения наночастиц серебра при лечении воспалительных процессов.
Полученные результаты могут послужить основой для дальнейшего изучения, разработки и внедрения в клиническую практику фармакологических препаратов на основе наночастиц серебра с альгинатом натрия в качестве стабилизатора наночастиц для лечения воспалительной патологии.
Методология и методы исследования.
В работе использовались методы экспериментального моделирования
воспалительного процесса в легких, брюшной полости и слизистой оболочки
желудка, микробиологические методы (оценка чувствительности бактерий к
наночастицам серебра методом серийных разведений, биохимические методы
(изучение профиля неспецифических протеиназ и их ингибиторов в сыворотке
крови, бронхоальвеолярном и перитонеальном смывах, супернатанте
гомогената слизистой желудка), морфологические методы
(патогистологическое исследование легких, брюшины, ткани стенки желудка), статистические методы. Объект исследования - патогенетические механизмы противовоспалительного и антибактериального эффекта раствора наночастиц серебра с альгинатным стабилизатором при моделировании воспаления у лабораторных крыс линии “Wistar”. Предмет исследования - состояние систем
протеолиза в сыворотке крови и биологических жидкостях, морфологическая структура легких, брюшины и желудка у интактных животных и в условиях моделирования воспалительного процесса.
Положения, выносимые на защиту.
-
Наночастицы серебра, стабилизированные в растворе альгинатом натрия, подавляют in vitro рост и размножение выделенных экспериментальным путем патогенных бактерий Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Enterobacter cloacae, музейного антибиотико-резистентного штамма Pseudomonas aeruginosa, ингибируют биолюминесценцию бактерий Photobacterium leiognathi Sh1.
-
Эндотрахеальное и интраперитонеальное введение лабораторным крысам без моделирования патологии, а также пероральный прием раствора наночастиц серебра с альгинатом натрия интактными животными характеризуется минимальными провоспалительными эффектами.
-
Формирование воспаления в легких и брюшной полости на фоне введения раствора наночастиц серебра с альгинатным стабилизатором характеризуется существенно меньшей активацией неспецифических протеиназ с сохранением высокого уровня ингибиторного потенциала.
-
Профилактическое и лечебное пероральное использование раствора наночастиц серебра с альгинатом натрия характеризуется развитием менее выраженных проявлений язвенного повреждения слизистой при моделировании язвы желудка, интенсификацией репаративных процессов поврежденных тканей, снижением активации протеолитических ферментов и повышением уровня ингибиторов протеиназ.
Степень достоверности. О достоверности полученных результатов и обоснованности выводов свидетельствуют личное участие соискателя в получении и анализе экспериментальных данных, корректная постановка опытов с использованием необходимых контрольных групп, большое количество наблюдений, применение современных методов исследования и адекватной статистической оценки полученных данных.
Апробация результатов. Результаты исследований доложены на 7-м Международном конгрессе патофизиологов (г. Рабат, Марокко, 2014), VI Пленуме общества патофизиологов Украины и научно-практической конференции с участием международных специалистов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической патофизиологии» (г. Винница, 2014), «XIІІ– е чтения В.В. Подвысоцкого» (г. Одесса, 2014), 86-й международной научно-практической конференции молодых ученых и студентов «Теоретические и практические аспекты современной медицины» (г. Симферополь, 2014), 87-й международной научно-практической конференции молодых ученых и студентов «Теоретические и практические аспекты современной медицины» (г. Симферополь, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них: 4 – статьи в специализированных журналах и сборниках, 1 из которых –
моноавторская, 3 – в соавторстве, 5 – материалы и тезисы съездов и научных конференций, в том числе 1 в материалах зарубежных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа выполнена по общепринятому для научных работ плану и состоит из введения, обзора литературы, главы материал и методы исследования, раздела собственных исследований, анализа и обобщения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Библиографический перечень содержит 178 наименований работ, из них 105 кириллицей и 73 латиницей. Текст изложен на 139 страницах машинописного текста, иллюстрирован 17 таблицами, 15 графиками, 17 микрофотографиями.
Практическое значение и возможности использования наночастиц серебра при лечении патологических процессов
Новые возможности использования известных биологических свойств серебра появились в связи с внедрением нанотехнологий, которые развиваются в последние десятилетие интенсивными темпами. Так, впервые термин «нанотехнология» (с греческого: nanos – карлик, гномик, techno – мастерство, logos – наука) был предложен японским ученым, инженером из Токийского университета Норио Танигучи в 1974 году для описания объектов размерами 10-9 метра [Л.Г. Розенфельд, В.Ф. Москаленко, И.С. Чекман и др., 2008]. Новое направление в науке, изучающей физические, физико-химические, химические, биологические, фармакологические, токсикологические свойства наночастиц размером до 100 нм, а также их синтез с помощью современных нанотехнологий и применение в разных отраслях народного хозяйства объединено под общим термином – нанонаука [И.С. Чекман, 2009].
Существенный вклад в сфере нанотехнологий внесли швейцарские ученые Герд Биннинг и Гейнрих Рорер, сконструировавшие сканирующий туннельный микроскоп, который позволял проводить исследования по изучению структуры и физических свойств разных размеров наночастиц органических и неорганических соединений [K.E. Drexler, 1994].
Активное внедрение нанотехнологий в различных сферах народного хозяйства приходится на 2000-е года нынешнего века, когда интенсивные исследования и практические наработки в области нанотехнологий реализовались в производство различных наноматериалов. [А.И. Русанов, 2006; K.K. Jain, 2007; C.N. Lok, C.M. Ho, R. Chen et al., 2007; S. Laurent, D. Forge, M. Port et al., 2008]. Было отмечено, что в нанометровом диапазоне существенно изменяются физические, химические, физико-химические свойства веществ и материалов [Ч.П. Пул мл., Ф. Дж., 2006; Ю.И. Головин, 2007; А.И. Гусев, 2008; Н. Кобаяси , 2007; S.D. Caruthers, S.A. Wickline, G.M. Lanza, 2007; J.B. Elder, C.Y. Liu, M.L. Apuzzo, 2008].
Одним из важнейших направлений исследований в области нанобиотехнологий является применение наночастиц как субстанций для создания новых фармакологических средств [E. Levy-Nssenbaum, A.F. Radovic-Moreno, A.Z. Wang et al., 2008; I.I. Lim, Y. Pan, D. Mott et al., 2007; L.J. Peek, C.R. Middaugh, C. Berkland, 2008]. Этими вопросами занимается новое направление в медицине - наномедицина, исследующая целесообразность применения материалов нанотехнологий в медицинской практике для профилактики, диагностики и лечения заболеваний с контролем биологической активности, фармакологического и токсикологического действия полученных продуктов или медикаментов [Л.Г. Розенфельд, В.Ф. Москаленко, И.С. Чекман, Б.О.Мовчан, 2008]. В связи с интенсивными темпами развития наномедицины, появилась возможность использовать нанотехнологии в медицинской практике для модификации и разработки лекарственных средств, открывающие большие перспективы для решения важнейших задач в области медицины [Ж.С. Жарасова, И.Е. Кононец, 2011]. Одной из наиболее приоритетных и перспективных задач наномедицины в настоящее время является использование нанотехнологических подходов для трансформации структуры металлов, приобретающих в наноразмерном диапазоне выраженную биологическую активность [X. Chen, H.J. Schlusener, 2008; X. Chen, H.J. Schlusener, 2008]. В настоящее время специалисты по нанотехнологиям сосредоточили научные исследования на разработке технологии получения наночастиц из металлов, таких как серебро [D.H. Buchold, C. Feldmann, 2007; M.A. Garcia, J.M. Merino, Pinel Fernandez et al., 2007; C.N. Lok, C.M. Ho, R. Chen et al., 2007; K. Shankar, G.K. Mor, H.E. Prakasam et al., 2007; S. Laurent, D. Forge, M. Port et al., 2008; T.L. Chan, M.L. Tiago, E. Kaxiras, J.R. Chelikovsky, 2008; В.Ф. Москаленко, Л.Г. Розенфельд, Б.О. Мовчан, И.С. Чекман, 2008]. Установлено, что наночастицы металлов размером от 5 до 60 нм проявляют свойства, которые не характерны для частиц большего размера [А.И. Гусев, 2005; T.R. Pisanic 2nd, J.D. Blackwell, V.I. Shubayev et al. 2007; Z. Wang, B. Tan, I. Hussain et al. 2007; J.E. Martin, A.A. Herzing, W. Yan et al., 2008].
Серебро, среди металлов, обладает наиболее сильным бактерицидным действием, а модификация структуры серебра с помощью нанотехнологий позволит представить уникальные свойства этого металла в новом качестве [Э.Г. Акопова, А.X. Каде, Е.Ф. Курносенкова и др. 2007; Е.К. Баранова, А.А. Ревина, Л.И. Войно, 2003; Е.М. Благитко, В.А. Бурмистров, А.П. Колесников, Ю.И Михайлов, П.П. Родионов, 2004].
Применение серебра в наноразмерном диапазоне имеет ряд существенных преимуществ. Во-первых, это позволит в сотни раз снизить концентрацию металла при сохранении всех его бактерицидных свойств, а во-вторых, за счет большей удельной поверхности наночастиц увеличиваются области контакта наносеребра с бактериями или вирусами, что значительно повышает его бактерицидные свойства [А.И. Гусев, 2007; И.С. Чекман и соавт., 2008]. Новая форма серебра в виде наночастиц открывает широкие возможности и создает перспективную основу для создания эффективных фармакологических средств с высокой биологической активностью [Е.В. Гарасько, Р.Р. Шиляев, С.А. Чуловская, 2008; А.И. Арчаков, 2010; Л.Г. Коляда, О.В. Ершова, Ю.Ю. Ефимова, Е.В. Тарасюк, 2013]. Для синтеза наночастиц серебра используются физические, химические и биологические методы. Однако за последние несколько лет просматривается тенденция к вытеснению физических и химических методов синтеза биологическими, что связано с токсичностью процессов синтеза. Кроме того, не все методы синтеза позволяют использовать наночастицы металла для биомедицинских целей [V. Sarsar, K. K. Selwal, M. K. Selwal., 2014; W. Likus, G. Bajor, K. Siemianowicz, 2013; Ю.А. Крутяков, А.А. Кудринский, А.Ю. Оленин, Г.В. Лисичкин, 2008].
Независимо от метода синтеза наночастиц серебра, существует две проблемы, получение наночастиц определенного размера при создании определенного наноматериала, а также предупреждение агломерации наночастиц и создание стойких коллоидных систем. И если первая проблема решается с помощью современных технологий, то для решения второй задачи – поиска стабилизатора для наночастиц и по сегодняшний день предлагается множество способов [Е.М. Егорова, А.А. Кубатиев, В.И. Швец, 2014].
Для решения задач по устранению основных недостатков существующих композиций на основе наночастиц серебра, таких как низкая агрегативная стойкость, полидисперсность и окисление при длительном хранении, наиболее перспективным в синтезе наночастиц серебра является применение в качестве восстановителей-стабилизаторов наночастиц природных полимеров – структурных полисахаридов водорослей и растений, обладающих широким спектром биологической активности [А.Д. Помогайло, А.С. Розенберг, И.Е. Уфлянд, 2000]. Как показали исследования, полисахарид альгинат натрия, полученный из морских водорослей, является высокоэффективным стабилизатором наночастиц серебра, обеспечивающим высокую агрегационную устойчивость наночастиц [И.Н. Юркова, Э.П. Панова, В.И. Рябушко, Д.А. Панов, 2009].
Полученная нанобиокомпозиция на основе наночастиц серебра и стабилизатора наночастиц полисахарида морских водорослей альгината натрия обладает высокой стабильностью и совмещает два уникальных биологически активных компонента: высокостабильные наночастицы серебра и природный биополимер, который синергетически усиливает эффективность наносеребра, обеспечивая его высокую стабильность и существенно расширяя сферу его действия [Пат. №10539 Украина, 2005].
Однако механизм реализации эффектов наночастиц серебра до конца не раскрыт и остается предметом многочисленных дискуссий. В настоящее время, существуют несколько теорий, объясняющих антимикробный механизм действия наночастиц серебра. Наиболее распространенной является адсорбционная теория, согласно которой клетка теряет жизнеспособность в результате взаимодействия электростатических сил, возникающих между клетками бактерий, имеющих отрицательный заряд, и положительно заряженными ионами серебра при адсорбции последних бактериальной клеткой [В.Ф. Москаленко, Л.Г. Розенфельд, Б.О. Мовчан, 2008; Г.И. Нежинская, В.В. Копейкин, В.Е. Гмиро, 1995; Г.В. Одегова, В.А. Бурмистров, П.П. Родионов и др.,2004].
Существует предположение, что действие наночастиц серебра на клеточную мембрану грамотрицательных бактерий разновекторное и может осуществляться в трех направлениях: наночастицы преимущественно в диапазоне 1-10 нм прикрепляются к поверхности клеточной стенки бактерий, тем самым нарушая такие функции мембраны, как проницаемость и дыхание; наночастицы серебра проникают внутрь бактерий и вызывают дальнейшее повреждение, взаимодействуя с серо- и фосфорсодержащими соединениями, например ДНК; а также наночастицы при окислении способны высвобождать ионы серебра, которые вносят дополнительный вклад в бактерицидный эффект наночастиц серебра [M. Singh, S. Singh, S. Prasad, I.S. Gambhir, 2008].
Характеристика экспериментальных моделей при изучении влияния раствора наносеребра на ткани интактных животных
В сыворотке крови, бронхоальвеолярном смыве, перитонеальном смыве и супернатанте гомогената слизистой желудка изучали активность протеиназ и их ингибиторов, которые исследовали с использованием энзиматических методов [А.В. Кубышкин и др., 2012] с измерением на спектрофотометре «BioMate 5» (Великобритания).
Трипсиноподобную активность (ТПА) измеряли спектрофотометрическим методом, основанном на регистрации скорости отщепления N-бензоил-L-аргинина (БА) от синтетического субстрата N бензоил-L-аргинина этилового эфира (БАЭЭ). Для его осуществления 0,03 мл плазмы крови или 1,0 мл БАС разводили до 2 мл 0,05 М трис-НСl буфером (рН - 8,0) и после преинкубации в течение 5 минут добавляли 1 мл 1,5 мМ раствора БАЭЭ. Реакцию проводили в термостатированной кювете (25оС) спектрофотометра, регистрируя прирост оптической плотности при 253 нм с интервалом 2-3 минуты в течение 10-15 минут против контрольной пробы на спонтанный гидролиз БАЭЭ. Расчет активности проводили по приросту оптической плотности в пробе за 1 минуту и выражали в мкмолях БА, освобожденного 1 мл биологического материала за 1 мин. Трипсиноподобную активность выражали в мкмолях БА, освобожденного 1 мл биологического материала за 1 мин в расчете на 1 мл для сыворотки крови или на 1 мг общего белка, содержащегося в смывах.
Измерение эластазоподобной активности (ЭПА) проводили на основе регистрации скорости прироста оптической плотности пробы при длине волны 347,5 нм за счет ферментативного гидролиза синтетического субстрата N-BOC-аланил-p-нитрофинилового эфира (БАНФЭ). Для этого в термостатированной кювете спектрофотометра (25о С) смешивали 0,01 мл сыворотки или 0,1 - 1,0 мл другого биологического материала с 0,05 Nа-фосфатным буфером (рН - 6,5) до конечного объема пробы 2,9 мл. Через 15 минут к пробе добавляли 0,1 мл 0,01 М раствора БАНФЭ в ацетонитриле. Измеряли прирост оптической плотности и результаты выражали в мкмолях гидролизованного субстрата за 1 минуту в расчете на 1 мл для сыворотки крови или на 1 мг белка смыва.
Определение активности 1-ингибитора протеиназ (1-ИП), отражающей антитриптическую активность (АТА) сыворотки или смывов, проводили унифицированным методом В.Ф. Нартиковой и Т.С. Пасхиной (1979) [В.Ф. Нартикова, Т.С. Пасхина, 1979]. Метод основан на различном механизме взаимодействия этих ингибиторов с трипсином. 1-ИП образует с трипсином комплекс, не гидролизующий БАЭЭ, поэтому его активность определяют по торможению БАЭЭ - эстеразной активности трипсина сывороткой крови человека. Для определения 1-ИП сыворотку разводили в 50 раз. В термостатированных кюветах спектрофотометра (25оС) готовили 2 пробы - опытную и контрольную. Опытная проба содержала 1.8 мл 0,05 М трис-НСl буфера (рН - 8,0), 0,1 мл разведенной 1:50 плазмы крови (либо 0,1 – 1 мл смыва) и 0,1 мл раствора трипсина (10 мкг) в 1 мМ НСl, содержащей 10 ммоль СаСL2. Контрольная проба была представлена теми же компонентами, кроме сыворотки крови или смывов. Обе пробы выдерживали 5 минут при 25оС, затем добавляли в каждую по 1 мл 1,5 мМ раствора БАЭЭ, быстро перемешивали и прирост оптической плотности измеряли при 253 нм против пробы на спонтанный гидролиз субстрата. Отсчеты делали каждую минуту в течение 4-5 минут. Из линейного участка кривой зависимости прироста оптической плотности от времени реакции находили прирост оптической плотности за 1 минуту для опытной и контрольной проб. Разность между этими величинами использовали для вычисления АТА в ингибиторных единицах (ИЕ) на 1,0 мл сыворотки или на 1 мг белка смывов. Для определения кислотостабильных ингибиторов (КСИ) пробы предварительно обрабатывали для осаждения кислотолабильных белков: для этого 0,1 мл сыворотки крови, разведенной в 10 раз, смешивали с 0,1 мл 0,05 М Nа-ацетатного буфера (рН 4,1) и прогревали на водяной бане при 60С в течение 20 минут. После охлаждения пробу нейтрализовали 0,5 М раствором NаОН и объем доводили 0,05 М трис-НС1 буфером (рН 8,0) до 1,9 мл. Для определения уровня кислотостабильных ингибиторов в смывах 1 мл обрабатывали 0,112 мл 50% трихлоруксусной кислоты и осуществляли экспозицию на водяной бане при 60С. После охлаждения и нейтрализации раствором 3 М NаОН полученный 5%-ный ТХУ-экстракт центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 минут. Дальнейшее определение уровня кислотостабильных ингибиторов проводили по алгоритму, аналогичному методике определения антитриптической активности. Содержание кислотостабильных ингибиторов выражали в ингибиторных единицах, приходящихся 1 мл сыворотки крови или на 1 мг белка 5 % ТХУ-экстракта смывов. Полученные результаты определения показателей в смывах пересчитывали на 1г белка, который определяли методом Лоури [O. Lowry, U. Rosenbrough, 1951].
Оценку патоморфологических изменений у экспериментальных животных проводили в легких, брюшине и желудке. Для гистологического исследования вырезали фрагменты ткани размерами 1см х 1см х 1см с последующей фиксацией в 10% растворе нейтрального формалина. Минимальный срок фиксации составлял 10 дней, в течение которых фиксирующая жидкость сменялась дважды. Фиксатор отмывали в проточной водопроводной воде 24 часа. Ткань обезвоживали в батарее спиртов восходящей концентрации (50%, 60%, 70%, 80%, 96% и абсолютный спирт), просветляли в ксилоле, выдерживали в насыщенном при +37С растворе парафина в ксилоле, помещали в парафин при +56С, с последующей заливкой в смесь парафина и пчелиного воска и изготовлением парафиновых блоков. Из парафиновых блоков готовили серийные срезы толщиной 4-5 мкм. С целью обзорной окраски, гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Просмотр и цифровые фотографии микропрепаратов осуществляли с помощью светового микроскопа «Olympus CX-41».
Статистическая обработка полученных данных проведена методами вариационной статистики с использованием параметрических и непараметрических критериев в программном пакете STATISTICA 8. Количественные параметры величин представляли с помощью среднего выборочного значения с указанием стандартной ошибки средней величины. При нормальном гауссовском законе распределения статистическую гипотезу о равенстве средних величин проверяли с помощью параметрического критерия Стьюдента, а при отклонении распределения от нормального – с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни для независимых выборок. Тест на нормальность распределения проводили с помощью W-критерия Шапиро-Уилка. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез был равен 0,05. Все средние значения в таблицах представлены в виде М ± m. Все измерения и исследования осуществлялись на оборудовании, прошедшем метрологическую проверку и экспертизу.
Изменение показателей протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и перитонеальном смыве интактных животных при интраперитонеальном введении раствора наночастиц серебра
Вторая серия экспериментов in vivo включала моделирование острого воспалительного процесса в легких с последующим эндотрахеальным введением в легкие раствора наночастиц серебра с альгинатом натрия. Полученные результаты показали, что через 24 часа после моделирования обтурационной пневмонии в сыворотке крови уровень трипсиноподобной активности достоверно увеличивался в 2 раза по сравнению с контрольной группой (p 0,01), в том числе наблюдалась тенденция к увеличению эластазаподобной активности. Со стороны ингибиторов протеолитических ферментов наблюдалось достоверное увеличение уровня антитриптической активности на 34% (p 0,001) в сравнении с контролем (табл. 5.1).
Изменение показателей протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови через 24 часа после моделирования острой пневмонии при эндотрахеальном введении раствора наночастиц серебра Показатели Контроль Воспаление24 часа+физ.раствор Воспаление24 часа +Альгинатнатрия Воспаление24 часа + Наносеребро (n=8) (n=10) (n=10) (n=10)
Примечание: р1 – достоверность различий по отношению к контролю, р2 – достоверность различий по отношению к группе с использованием физ. раствора при моделировании обтурационной пневмонии, р3 - достоверность различий по отношению к группе с использованием альгината натрия при моделировании обтурационной пневмонии. Более существенные изменения компонентов протеиназ-ингибиторной системы при моделировании обтурационной пневмонии наблюдались в бронхоальвеолярном смыве, где статистически достоверно по сравнению с контрольной группой почти в 2 раза увеличился уровень эластазаподобной активности (p 0,001), трипсиноподобной активности на 59% (p 0,05), а уровень антитриптической активности на 16% был выше (p 0,05) по сравнению с группой контроля (табл. 5.2). Вышеописанная реакция компонентов протеиназ-ингибиторной системы, характерная для острого воспалительного процесса, подтверждалась данными морфологического исследования. Морфологические изменения легочной ткани при моделировании острой обтурационной пневмонии характеризовались стереотипной морфологической картиной острого воспалительного процесса. В частности, определялся выраженный отек, полнокровие сосудов различных калибров, обширные очаги дистелектазов (стрелка), скопление экссудата в просвете альвеол, перибронхиальные лимфолейкоцитарные инфильтраты (ЛЛИ) и очаговые кровоизлияния (рис. 5.1; рис. 5.2). Стенки бронхов инфильтрированы лейкоцитами, в просвете определялся слизисто-гнойный экссудат с наличием большого количества десквамированных эпителиоцитов.
Легкое крысы при моделировании обтурационной пневмонии. Окраска гематоксилин-эозин. Ув.400. Таблица 5.2 Изменение показателей протеиназ и их ингибиторов в бронхоальвеолярном смыве через 24 часа после моделирования острой пневмонии при эндотрахеальном введении раствора наночастиц серебра Показатели Контроль Воспаление24 часа+физ.раствор Воспаление24 часа +Альгинатнатрия Воспаление24 часа + Наносеребро
При изучении изменений показателей компонентов протеиназ-ингибиторной системы в сыворотке крови при эндотрахеальном введении раствора наночастиц серебра и раствора альгината натрия в условиях моделирования острого воспаления в легких существенного повышения уровня неспецифических протеиназ не выявлено, а отмечалась только лишь тенденция к увеличению эластазаподобной и трипсиноподобной активности. Со стороны ингибиторов протеиназ на фоне введения альгината натрия отмечалось достоверное увеличение антитриптической активности на 20% (p 0,001), тогда как активации кислотостабильных ингибиторов не наблюдалось.
Уровень антитриптической активности в сыворотке крови на фоне введения раствора наночастиц серебра характеризовался достоверным увеличением на 9% по сравнению с контролем (p 0,05), а уровень кислотостабильных ингибиторов увеличился на 28% по отношению к контрольной группе (p 0,01) и на 32% по отношению к группе с введением альгината натрия (p 0,01) (табл. 5.1).
Более существенные изменения уровней компонентов протеиназ-ингибиторной системы при введении растворов на фоне развития воспаления в легких отмечены на местном уровне. Так, на фоне введения альгината натрия при моделировании воспаления в легких наблюдалось существенное увеличение уровня эластазаподобной активности более чем в 2 раза (p 0,001), трипсиноподобной активности более чем в 1,5 раза по сравнению с контролем (p 0,01). В свою очередь уровень антитриптической активности на фоне введения альгината натрия не отличался от группы животных с введением физиологического раствора. Более существенной была заметна активация кислотостабильных ингибиторов, о чем свидетельствовало повышение уровня кислотостабильных инигибиторов на 11% по сравнению с контролем (p 0,001) и на 10% по сравнению с физиологическим раствором (p 0,01).
При эндотрахеальном введении раствора наночастиц серебра в матрице альгината натрия на фоне развития воспаления в легких в бронхоальвеолярном смыве также наблюдалось увеличение эластазаподобной активности, на 57% выше значений контрольной группы (p 0,05). Однако по сравнению с группой с введением физиологического раствора при воспалении достоверных изменений не обнаружено, а по отношению к альгинату натрия уровень эластазаподобной активности был достоверно ниже на 36% (p 0,01) . Уровень трипсиноподобной активности на фоне введения раствора наносеребра характеризовался лишь только тенденцией к повышению.
И в то же время при эндотрахеальном введении раствора наночастиц серебра с альгинатом натрия на фоне развития воспаления в легких наблюдалась существенная активация ингибиторов протеиназ, на что указывало достоверное увеличение антитриптической активности на 27% по отношению к контролю (p 0,001), на 10% по сравнению с физиологическим раствором (p 0,01) и на 7% по сравнению с альгинатом натрия (p 0,05). Уровень кислотостабильных ингибиторов характеризовался достоверным увеличением на 25% по сравнению с контрольной группой (p 0,001), на 24% по отношению к физиологическому раствору (p 0,001) и на 13% по сравнению с альгинатом натрия (p 0,01) (табл. 5.2).
Морфологическая картина легких крыс с введением альгината натрия при моделировании острого воспалительного процесса в легких характеризовалась стереотипными морфологическими проявлениями, характерными для воспалительного процесса в острой стадии, и соответствовала вышеописанным изменениям в легких при моделировании обтурационной пневмонии на фоне введения 0,9% раствора хлорида натрия. При микроскопическом исследовании легких крыс, которым эндотрахеально вводился раствор наночастиц серебра с альгинатным стабилизатором при моделировании обтурационной пневмонии, степень выраженности воспалительной реакции была существенно меньшей по сравнению с группой крыс, которым вводили 0,9% раствор хлорида натрия при моделировании обтурационной пневмонии. Так, очаги дистелектаза занимали меньшую площадь, в ряде альвеол обнаруживались крупные скопления альвеолярных макрофагов (АМ), перибронхиально и периваскулярно очаги лимфолейкоцитарной инфильтрации (стрелка), явления бронхита и бронхиолита (рис.5.3). Рисунок 5.3. Легкое крысы при моделировании обтурационной пневмонии на фоне эндотрахеального введения раствора наночастиц серебра. Ув. 400. Окраска гематоксилин-эозин.
Изменения показателей протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и перитонеальном смыве при моделировании острого перитонита на фоне внутрибрюшинного введения раствора наночастиц серебра
Параллельное с биохимическими методами изучение гистологической структуры легочной ткани крыс с моделированием обтурационной пневмонии показало, что морфологические изменения в легких характеризовались стереотипной картиной острого воспалительного процесса в легких с явлениями экссудации в просвете альвеол, выраженного отека, полнокровия сосудов различных калибров, лимфолейкоцитарного инфильтрата и т.д. Следует отметить, что если в группе животных с моделированием воспаления в легких без применения наночастиц серебра наблюдалась существенная активация компонентов протеиназ-ингибиторной системы, особенно выраженная на местном уровне, то в группе с использованием наночастиц серебра при воспалении, активация системы протеолиза была заметно меньше. Так, в группе лабораторных животных с применением раствора наночастиц серебра при моделировании воспаления в легких было установлено, что на уровне бронхиального смыва эндотрахеальное введение наночастиц серебра блокирует активацию протеиназ и способствует сохранению высокого антипротеиназного потенциала.
Проведенные биохимические методы исследований выявили статистически достоверное повышение уровня эластазаподобной активности (p 0,05) с одновременным увеличением уровней антитриптической активности (p 0,001) и кислотостабильных ингибиторов (p 0,001) на фоне введения наночастиц серебра при воспалении по сравнению с контрольной группой, при этом уровень трипсиноподобной активности находился в пределах контрольной группы (рис. 6.5). Вместе с тем, сравнение с группами крыс, которым вводили физиологический раствор и альгинат натрия при моделировании воспаления, выявило существенно меньшую активацию протеолитических ферментов и сохранение высокого уровня антипротеиназного потенциала в бронхоальвеолярном смыве. При микроскопическом исследовании легких крыс, которым эндотрахеально вводили наночастицы серебра при моделировании обтурационной пневмонии такие специфические признаки острого воспалительного процесса, как макрофагальная и лимфолейкоцитарная инфильтрация, очаги дистелектаза, отек тканей, явления бронхита и бронхиолита, характеризовались существенно меньшей выраженностью.
Примечание: , , - значения р, отражающие уровни статистической значимости различий по сравнению с группами крыс контрольной группы, с использованием физиологического раствора при моделировании обтурационной пневмонии и с использованием альгината натрия при моделировании обтурационной пневмонии, соответственно. Таким образом, снижение степени активации неспецифических протеиназ, сохранение антипротеиназного потенциала, уменьшение выраженности специфических признаков воспалительного процесса на морфологическом уровне при эндотрахеальном введении наночастиц серебра на фоне моделирования воспаления в легких в совокупности дают основание говорить о наличии существенных противовоспалительных эффектах у исследуемого раствора. Характер и степень выраженности системных и локальных изменений неспецифических протеиназ является одним из диагностических и прогностических маркеров повреждения ткани легкого при развитии воспаления [Л.В. Анисимова, 2014].
В том числе, применение раствора наночастиц серебра при моделировании острого перитонита также уменьшало степень проявления воспалительного процесса. Было показано, что через 24 часа после моделирования острого экспериментального перитонита происходят как классические морфологические изменения, характерные для острого перитонита, так и развивается системная и локальная острофазная реакция компонентов системы протеолиза. Так, при моделировании перитонита в сыворотке крови была отмечена существенная активация протеолитических ферментов, о чем свидетельствовало статистически достоверное увеличение уровня эластазаподобной активности, которое превышало в три раза среднее значение эластазаподобной активности в группе контроля (p 0,001).
Более существенные изменения компонентов протеиназ-ингибиторной системы при моделировании острого перитонита наблюдались в бронхоальвеолярном смыве, где было отмечено статистически достоверное повышение эластаза и трипсиноподобной активности (p 0,001) по сравнению с контрольной группой, уровень кислотостабильных ингибиторов был выше контрольной группы на 84% (p 0,001) (рис. 6.6). При этом морфологическая картина брюшины крыс, которым моделировали острый перитонит, характеризовалась классическими признаками островоспалительного процесса, такие как лейкоцитарная инфильтрация, отек, скопление на поверхности брюшины фибрина и т.д.
Тем не менее, в группе крыс с интраперитонеальным введением раствора наночастиц серебра развитие острого перитонита сопровождалось более слабой активацией протеолитичеких ферментов в сыворотке крови и бронхоальвеолярном смыве, одновременно с этим антипротеиназный потенциал сохранялся на высоком уровне. В частности внутрибрюшинное введение наночастиц серебра при перитоните характеризовалось статистически достоверным снижением уровня эластазаподобной активности на 46% (p 0,001) по сравнению с группой животных с введением физиологического раствора и на 50% (p 0,001) по сравнению с группой с введением альгината натрия. Уровень трипсиноподобной активности, при этом, характеризовался снижением на 38% (p 0,001) по сравнению с группой с введением физиологического раствора и на 34% (p 0,05) с введением альгината натрия (рис. 6.7).
Одновременно с этим, помимо существенного уменьшения степени активации неспецифических протеиназ на фоне введения наночастиц серебра, наблюдалось сохранение высокого уровня антипротеиназного потенциала (p 0,01; p 0,001).