Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 9
1.1 Строение роговицы 9
1.1.1 Передний эпителий роговицы 11
1.1.2 Строма 12
1.1.3 Задний эпителий 21
1.2 Создание искусственной роговицы 23
1.2.1 Характеристика клеток 23
1.2.2 Полимерные материалы 27
1.2.3 Биосинтетические материалы 29
1.2.4 Фиброин шелка 30
Глава 2 Материалы и методы экспериментальных исследований 32
2.1 Первый этап. Выделение первичной клеточной культуры кератоцитов и клеток заднего эпителия 33
2.1.1 Выделение первичной клеточной культуры кератоцитов 34
2.1.2 Выделение клеток заднего эпителия роговицы 35
2.2 Второй этап. Подбор питательной среды для клеточных культур 35
2.2.1 Подбор питательной среды для 2D культуры кератоцитов 36
2.2.2 Подбор питательной среды для 2D культуры клеток заднего эпителия роговицы 37
2.2.3 2D культивирование полученных клеточных культур 37
2.2.4 Криоконсервация/Дефростация клеточных культур кератоцитов и клеток заднего эпителия роговицы 38
2.3 Третий этап. 3D клеточное культивирование 38
2.3.1 Определение жизнеспособности полученных 2D и 3D клеточных культур 40
2.3.2 Проведение иммуноцитологического исследования полученных 2D и 3D клеточных культур 40
2.4 Четвертый этап. 2D культивирование кератоцитов на полимерных материалах 43
2.5 Пятый этап. 2D и 3D культивирование кератоцитов на фиброине шелка 45
2.5.1 Метод «ДНК-комет» 45
2.5.2 Определение раннего апоптоза 46
2.6 Обработка количественных данных 46
2.7 Перечень используемого лабораторного оборудования и расходных материалов 47
Глава 3. Результаты 50
3.1 Получение первичной клеточной культуры 50
3.1.1 Кератоциты 50
3.1.2 Клетки заднего эпителия роговицы 53
3.2 Подбор питательной среды для клеточных культур 53
3.2.1 2D культивирование кератоцитов 53
3.2.2 2D культивирование клеток заднего эпителия роговицы 68
3.3 3D культивирование 76
3.3.1 3D культивирование кератоцитов 76
3.3.2 3D культивирование сфероидов клеток заднего эпителия роговицы 96
3.4 2D культивирование кератоцитов на полимерных материалах 100
3.5 Культивирование кератоцитов на фиброине шелка 102
Заключение 107
Выводы 116
Основные обозначения и сокращения 118
Библиография 119
- Строма
- 2D культивирование кератоцитов
- 3D культивирование кератоцитов
- Культивирование кератоцитов на фиброине шелка
Строма
Более 90% роговицы составляет строма. Имеющиеся на сегодня данные убедительно демонстрируют высокую значимость создания стромальной части в связи с тем, что она обеспечивает большинство основных функций ткани роговицы.
Известно, что строма имеет толщину приблизительно 500 мкм и представляет собой относительно бесклеточную структуру, содержащую коллагеновые фибриллы 1 и 5 типа (Meek K.M., Leonard D.W. 1993); гликозаминогликаны, такие как: кератансульфат и дерматансульфат (Anseth A. 1961); различные протеогликановые белки: кератокан, люмикан, декорин, мимекан и другие белковые составляющие, включающие фибронектин, ламинин и коллаген 3 и 6 типов (Axelsson I., Heinegard D. 1978).
Прозрачность стромы роговицы в значительной степени обеспечивается тонким взаимодействием между компонентами межклеточного матрикса и кератоцитами (Вит В.В. 2003; Joyce N. C., Meklir, B. et al., 1996; Michelacci Y. M. 2003; Guarnieri F.A. 2015). Последние представляют собой популяцию мезенхимальных клеток роговицы, которые располагаются между слоями коллагеновых волокон, морфологически напоминающие дендритные клетки с множеством отростков, которые, соединяясь друг с другом, образуют трехмерную сеть (Вит В.В. 2003; Zieske J. D. 2004; Guarnieri F.A. 2015).
Кроме того, прозрачность стромы зависит от высокоорганизованного коллагена (1, 3, 5, 6 типов), образующего фибриллы с равномерными промежутками и размерами, что играет одну из ключевых ролей в поддержании прозрачности роговицы. Среднее межфибриллярное расстояние составляет 41,5 нм, а диаметр коллагеновых фибрилл варьирует от 22,5 до 35 нм, в зависимости от типа коллагена (Sayers Z., Koch M.H., Whitburn S.B. 1982). Фибриллы образуют около 200 слоев ламелл, каждая из которых ориентирована в направлении, ортогональном соседним ламеллам, для обеспечения прочности, упругости и прозрачности роговицы (Рис. 2) (Maurice D.M. 1957). Верхние ламеллы переплетаются и заканчиваются в боуменовой мембране, значительно увеличивая жесткость передней стромы в отличие от задних двух третей. Эта специфическая архитектура также отвечает за поддержание кривизны роговицы (Muller L.J., Pels E., Vrensen G.F. 2001).
Основные направления изучения формирования стромы, в настоящее время сосредоточены на воспроизведение ее уникальной архитектоники (Orwin E.L., Borene M.L., Hubel A. 2003; Crabb R.A., Chau E.P., Evans M.C. et al., 2006 ), а также сохранения фенотипа кератоцитов (Minami Y., Sugihara H., Oono S. 1993; Zieske J.D., Mason V.S., Wasson M.E. et al., 1994; Germain L., Auger F.A., Grandbois E., et al., 1999; Griffith M., Hakim M., Shimmura S., et al., 2002; Li F., Carlsson D., Lohmann C., et al., 2003). При этом следует отметить, что успешное воспроизведение архитектуры роговицы требует детального изучения технологий создания послойной слоистой структуры роговицы путем сборки in vivo / in vitro различных материалов и клеток (кератоцитов).
В норме кератоциты находятся в роговице в стадии G0 (стадия покоя) клеточного цикла (Вит В.В. 2003; West-Mays J.A., Dwivedi D.J. 2006). При травматических или инфекционных повреждениях роговицы под действием цитокинов происходит активация окружающих раневую поверхность кератоцитов с последующей их дифференцировкой в фибробласты, которые принимают активное участие в регенерации поврежденной структуры (Вит В.В. 2003; West-Mays J.A., Dwivedi D.J. 2006). Однако, при некоторых повреждениях возможно образование в зоне повреждения трансформирующего фактора роста (TGF), что способствует дальнейшей дифференцировке фибробластов в миофибробласты (Le Roux S., Borbely G., Soniecka M. et al., 2015). Основным характерным отличием миофибробластов является экспрессия -гладкомышечного актина и синтез неорганизованного фиброзного внеклеточного матрикса, приводящего к образованию рубцовой ткани (Zieske J.D., Francesconi C.M., Guo X. 2004; West Mays J.A., Dwivedi D.J. 2006; Wilson S.E. 2012). Фиброзное заживление уменьшает прозрачность роговицы из-за новообразованного неукомпактизованного внеклеточного матрикса и снижения синтеза основных протеогликанов и кристаллина (Michelacci Y.M. 2003; Jester J.V. 2008; Mc Intosh Ambrose W., Schein O., Elisseeff J. 2010). Кроме того, данный процесс может изменять форму роговицы как путем новообразующейся ткани, так и путем перераспределения механической нагрузки и натяжения стромы.
Таким образом, лучшее понимание основных клеточных и молекулярных механизмов, которые регулируют биомеханическую активацию кератоцитов роговицы, может в конечном итоге привести к более эффективным подходам в создании искусственного эквивалента роговицы (Mc Intosh Ambrose W., Schein O., Elisseeff J. 2010).
В этой связи крайне актуальным является изучение онтогенеза кератоцитов. Известно, что на третьей неделе внутриутробного развития из нервной трубки в сторону покровной эктодермы выпячиваются глазные бороздки, которые после смыкания нервной пластинки превращаются в первичные глазные пузыри (Карлсон Б. 1983; Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005). В начале пятой недели дистальная часть глазного пузыря начинает впячиваться (инвагинирует) и образуется двуслойный незамкнутый глазной бокал. Перед началом инвагинации глазной бокал вступает в плотный контакт с поверхностной эктодермой и индуцирует выпячивание зачатка хрусталика в сторону глазного бокала (Карлсон Б. 1983; Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005). После отделения хрусталика от зачатка роговичного эпителия происходит миграция клеток из нервного гребня в пространство между хрусталиком и эпителием формируя слой эндотелиальных клеток, которые синтезируют первичную строму, состоящую из коллагеновых фибрилл. Вторая волна мезенхимальных клеток из нервного гребня наполняет первичную строму и они становятся кератоцитами (Карлсон Б. 1983; Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005). После миграции кератоциты начинают синтезировать внеклеточный матрикс, состоящий, в основном, из коллагенов 1, 3, 5 и 6 типа и гликозааминогликанов, тем самым увеличивая объем первичной стромы. После слияния век примитивный эпителий роговицы уменьшается до нескольких слоев и остается неизменным до момента открытия век (Карлсон Б. 1983; Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005; Miron-Mendoza M., Graham E., Kivanany P., et al., 2015). Ряд изменений происходит и с кератоцитами - после наполнения первичной стромы клетки постепенно снижают свою пролиферативную активность, и, к моменту открытия век, прекращают пролиферацию и останавливаются в стадии G0 клеточного цикла (Карлсон Б. 1983; Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005; West-Mays J.A., Dwivedi D.J. 2006; Lynch A.P., O Sullivan F., Ahearne M. 2016). При повреждении роговицы кератоциты могут перейти в дивергентный фенотип, который зависит от конкретных клеточных сигналов. Поскольку кератоциты происходят из популяции клеток нервного гребня, было установлено, что их регенеративные возможности схожи с таковыми стволовых клеток (Funderburgh J.L., Mann M.M., Funderburgh M.L., 2003; Nishida T. 2010). Недавно были проведены экспериментальные работы над перепелами по пересадке меченых стромальных кератоцитов в зону ранних миграционных путей нервного гребня с отслеживанием их дальнейшей судьбы во времени (Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005; Lynch A.P., O Sullivan F., Ahearne M. 2016). Было показано, что данные клетки мигрировали, но не смешивались с зарождающимися клетками нервного гребня (Yam G. H., Williams G.P., Setiawan M., et al. 2017). Кроме того, стромальные кератоциты подавляли экспрессию кератансульфата и дифференцировались в мультипотентные предшественники, способные формировать некоторые производные нервного гребня, такие как гладкие мышцы и миофибриллы, в дополнение к кератоцитам роговицы и эндотелиальным клеткам (Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005). Однако, они не смогли образовать все производные нервного гребня и не приводили к появлению тканей другого происхождения. Результаты показывают, что кератоциты роговицы сохраняют пластичность даже после своей конечной дифференцировки, что проявляется в их реакции на повреждение роговицы (Funderburgh J.L., Mann M.M., Funderburgh M.L., et al., 2003; Lwigale P.Y., Cressy, P.A., Bronner-Fraser M. 2005; Nishida T. 2010).
Одним из первых наблюдаемых изменений в строме роговицы после травмы является гибель субпопуляции кератоцитов (Nishida T., 2010). В случае эпителиальных повреждений роговицы, при которых эпителий соскабливается, обнажая боуменову мембрану, кератоциты непосредственно под мембраной подвергаются апоптозу. Вскоре погибшие клетки заменяются новыми в результате митоза соседних клеток, и, следовательно, не происходит дальнейшего ответа кератоцитов (Covre J.L., Cristovam P.C., Loureiro R.R., et al. 2016). Эта первоначальная гибель клеток кератоцитов является доброкачественным ответом, развивающимся для ограничения воспаления и потери прозрачности (Jeste J.V, Petroll W.M., Cavanagh H.D. 1999; Guarnieri F.A. 2015). Область и степень гибели клеток в строме роговицы, по-видимому, зависят от типа и вида травмы. Так, при фоторефрактивной керактэктомии (корректирующая хирургическая процедура, при которой с поверхности деэпителизированной роговицы точечно при помощи лазера испаряют (аблируют) участки боуменовой мембраны и стромы), апоптоз кератоцитов обычно наблюдается в поверхностной строме роговицы (до 85 мкм от поверхности). Лазерный in situ кератомилез (LASIK) представляет собой более новую корректирующую процедуру, при которой лоскут эпителия и базальной мембраны сначала отсекают параллельно поверхности роговицы микрокератомом, и затем лазерная абляция выполняется на нижележащей строме. В LASIK смерть кератоцитов обнаруживается глубже в строме и обычно ограничивается передней и задней пластинчатой поверхностью, созданной микрокератомом (Miron-Mendoza M., Graham E., Kivanany P., et al., 2015; Sidney L.E., Hopkinson A. 2018).
2D культивирование кератоцитов
Проблема выделения и культивирования кератоцитов до сих пор остается крайне актуальной в современной регенеративной медицине. 2D культивирование кератоцитов неизбежно приводит к их дифференцировке в фибробласты (Dreier B., Thomasy S.M., Mendonsa R., et al. 2013; Guo X., Sriram S., Tran J.A., et al. 2018; Thomasy S.M., Raghunathan V.N., Miyagi H., et al. 2018). Известно, что при благоприятных условиях фибробласты способны возвращаться к состоянию покоя и приобретать фенотип кератоцитов. Однако, при увеличении сроков 2Dкультивирования возможен переход фибробластов в миофибробласты, которые не способны к возврату в исходное состояние. Важно отметить, что миофибробласты секретируют неорганизованный внеклеточный матрикс, характеризующийся потерей прозрачности - являющейся одной из ключевых функций стромы роговицы (Chen T.C., Chang S.W., Wang T.Y. 2013). Таким образом, на данном этапе работы нами осуществлялся подбор оптимальных условий культивирования кератоцитов, способствующих сохранению их уникальных характеристик.
Подбор оптимальной питательной среды для культивирования кератоцитов проводили в 2 этапа. На первом этапе осуществляли подбор базовой среды для культивирования первично выделенной клеточной культуры кератоцитов.
Было проведено сравнение наиболее распространенных базовых сред, используемых для культивирования кератоцитов, представленных в доступной литературе: DMEM с низким содержанием глюкозы, MEM, MEM, DMEM/F12 (Таблица 2), при этом была изучена адгезия клеток и изменение их морфологии. Полученные результаты оценивали на 1-е и 3-е сутки культивирования.
Полученные результаты показали, что в базовой среде DMEM с низким содержанием глюкозы наблюдалась адгезия клеток небольшими конгломератами уже на первые сутки культивирования, но уже к концу вторых суток прослеживалось открепление клеток и их деструкция в среде (Рис. 6 А). На 3-и сутки в культуре детектировались единичные прикрепленные клетки с большим количеством дебриса в среде (Рис. 6 Б).
При культивировании в базовых средах MEMи MEM были получены схожие результаты, на 1-е сутки культивирования отмечалась адгезия клеток к поверхности культурального пластика в виде небольших конгломератов (Рис. 6 В, Д). На 3-и сутки морфология клеток изменялась, клетки приобретали фибробластоподобную морфологию, что являлось косвенным свидетельством потери фенотипа кератоцитов (Рис. 6 Г, Е).
Наилучшие результаты были получены при использовании среды DMEM/F12. На 1-е сутки культивирования наблюдалась адгезия большого количества выделенных клеток (Рис. 6 Ж). На 3-и сутки была получена 90% 55 конфлуэнтность в культуре, при этом полученные клетки имели морфологию характерную для кератоцитов (Рис. 6 З).
Таким образом, в качестве базовой среды была определена среда DMEM/F12, дальнейший подбор дополнительных компонентов проводили с использованием данной среды.
На втором этапе было проведено исследование влияния дополнительных компонентов на культивирование кератоцитов. Изучалось влияние ЭТС и ФРФ (таблица 3). Использование ЭТС обусловлено содержанием в ней большого количество различных факторов роста, необходимых для адгезии и пролиферации клеток. Однако, отсутствие стандартизации сред, а также возможность передачи прионных инфекций, диктует необходимость разработки бессывороточных сред. Вместе с тем, имеющиеся в настоящее время бессывороточные среды не способны в полной мере поддерживать фенотип клеток (Фрешни). В этой связи нами было изучено влияние сред с отсутствием и малой концентрацией ЭТС на 2D клеточную культуру кератоцитов. Выбор ФРФ был обусловлен его способностью стимулировать синтез малых лейцинбогатых протеогликанов, а именно: кератокана, кератансульфата и люмикана, являющихся характерными для кератоцитов.
Оценку результатов подбора (4-й пассаж клеточной культуры) проводили по следующим критериям: количество полученных клеток и сохранность фенотипа кератоцитов.
Полученные результаты показали, что адгезия клеток наблюдалась на всех типах сред на 1-е сутки культивирования. По достижению 90%-конфлуэнтности проводили пассирование клеточной культуры раствором Трипсин-Версена и его последующей инактивацией питательной средой, содержащей 10% ЭТС. Дальнейшее культивирование проводили в полной питательной среде в соответствии с группой исследования (таблица 3).
На среде № 4.1, в состав которой не входили ЭТС и ФРФ, на 2 сутки после пассирования наблюдали адгезию клеток к культуральному пластику, но спустя 5 суток клетки откреплялись и плавали в растворе (Рис. 7). Однако, после замены среды, адгезия клеток отсутствовала, при дальнейшем культивировании отмечали полную потерю клеток. Срок культивирования составил 17 суток. Данные изменения могут свидетельствовать о необходимости замены среды или о неадекватности ее компонентов, требующихся для культивирования кератоцитов.
В среде № 4.2, содержащей дополнительный компонент ФРФ, после пассирования наблюдали формирование свободно плавающих клеточных агрегатов, адгезия отсутствовала. На 7-е сутки культивирования отмечали постепенное разрушение агрегатов до единичных клеток (Рис. 8). При дальнейшем культивировании была обнаружена полная потеря клеток. Срок культивирования составил 21 день. Таким образом, нами было показано, что изолированное использование ФРФ, не приводит к каким-либо значимым изменения по сравнению с культивированием на бессывороточной среде № 4.1
В среде № 4.3, в состав которой входила 2% ЭТС и отсутствовал ФРФ, адгезия клеток наблюдалась на протяжении всего периода культивирования (39 суток). При пассировании клеток наблюдалось изменение морфологии, клетки уменьшались в объеме и вытягивались. На 2-м пассаже клетки были слабо вытянутые, увеличения количества клеток не наблюдалось, они практически не подвергались митозу (Рис. 9). Данные изменения полностью соответствуют условиям культивирования, а именно низкому содержанию ЭТС, которая была оптимальна для адгезии клеток, однако для поддержания пролиферативной активности используемая концентрация была недостаточной.
3D культивирование кератоцитов
Для получения сфероидов из кератоцитов было использовано 4 разные по составу среды, 2 из которых были отобранных на этапе 2D клеточного культивирования и те же по составу среды, но с добавлением L-аскорбиновой кислоты.
Было показано, что формирование сфероидов из 500 клеток в сфероиде (Рис. 27 А-Г) во всех анализируемых средах имело общую тенденцию. После 5-ти часов культивирования клетки формировали рыхлые агрегаты, а к 7-м суткам были сформированы компактные сфероиды с постепенным уменьшением их размеров (таблица 16). Дальнейшее культивирование в течение 35 суток, каких-либо значимых изменений не выявило. Также было показано, что в течении всего периода культивирования полученные сфероиды сохраняли свою жизнеспособность (Рис. 28 А, Б).
Имуноцитологическое исследование показало, что уже в первые сутки культивирования в 3D клеточных сфероидах детектировались характерные маркеры кератоцитов кератокан (красный) и кератансульфат (зеленый) (Рис. 31-32). Сравнительную оценку экспрессии указанных маркеров проводили на основании средней интенсивности свечения с использованием программного обеспечения Cell Profiler. Из представленных графиков видно, что достоверной разницы между группами и сроками культивирования в экспрессии данных маркеров выявлено не было. При этом, в каждой группе отмечалось постепенное увеличение экспрессии кератансульфата к 35 суткам наблюдения. Экспрессия кератокана была стабильной или немного снижалась (Рис. 33).
После первых суток культивирования было показано достоверное снижение экспрессии люмикана - белка богатого лейцином протеогликан, основная функция которого заключается в поддержании прозрачности роговицы путем высокой организации и регуляции коллагеновых фибрилл во всех группах культивирования (Рис 34-35). Мы считаем, что данный факт связан не с уменьшением синтеза данного белка, а с уменьшением размеров клеток формирующих сфероид в процессе его компактизации, поскольку известно, что люмикан экспрессируется в цитоплазме клеток. Наибольшая экспрессия люмикана наблюдалась в группах содержащих L-аскорбиновую кислоту, при этом было показано, что в группе с посевной концентрацией 1000 клеток на сфероид уровень экспрессии достоверно больше (р 0,005), чем в группе с посевной концентрацией 500 клеток на сфероид (Рис. 36).
Характерный белок миофибробластов а-гладкомышечный актин при культивировании 3Dсфероидов детектировался в малом количестве, и к 35-м суткам его экспрессия достоверно (р 0,05) снижалась (Рис. 37-39)
Иммуноцитологическое исследование промежуточного филамента мезенхимальных клеток виментина так же показало достоверное (р 0,005) снижение к 35-м суткам культивирования (Рис. 37-39). По нашему мнению, данный факт снижения мезенхимальных маркеров свидетельствует о переходе кератоцитов из активного состояния, характеризующегося приобретением фибробластоподобной морфологии и способностью к активному митозу, к состоянию покоя и восстановлению исходного фенотипа кератоцитов.
При изучении динамики изменения экспрессии коллагена 1 и 3 типа (Рис. 40-41), в течение всего периода культивирования было выявлено, что максимальная экспрессия выше указаных маркеров наблюдалась в группах с добавлением L-аскорбиновой кислоты, при этом достоверной разницы между группой сфероидов из 1000 клеток и 500 клеток, выявлено не было (Рис. 42).
При изучении динамики изменения экспрессии коллагена 5 и 6 типов в течение всего периода культивирования отмечалось аналогичное с коллагеном 1 и 3 типов. Так же, максимальная экспрессия коллагенов 5 и 6 типов отмечалась в группах с добавлением L-аскорбиновой кислоты (Рис. 43-45), при этом достоверной разницы между группами из 500 и 1000 клеток в сфероиде, выявлено не было.
Таким образом, наиболее оптимальной средой для культивирования сфероидов из кератоцитов является среда, содержащая DMEM/F12, 5% ЭТС, ФРФ и L-аскорбиновую кислоту, срок культивирования 35 суток, 1000 клеток в сфероиде. Данные условия, на наш взгляд, способствуют максимальному накоплению внеклеточного матрикса коллагена 1, 3, 5 и 6 типов, а так же, увеличению основных белков малых лейцинбогатых протеогликанов (кератоканссульфата и люмикана) и снижению экспрессии нехарактерных белков (а-гладкомыщечного актина и виментина). Дальнейшее исследование осуществлялось с использованием сфероидов, полученных при указанных условиях.
Культивирование кератоцитов на фиброине шелка
Для создания слоистой структуры стромальной части роговицы использовали пленки фиброина шелка. Общий вид пленок и схема подготовительного этапа представлен на рисунке 50.
Исследование пленок проводили в 2 этапа: на 1-м этапе проверяли токсичность материала и характер распространения 2D и 3D клеточных культур, пассируемых на материале. После 7-ми суток культивирования проводили анализ жизнеспособности клеточных культур, однако стандартный метод определения, при использовании флуоресцентного красителя, не дал ожидаемых результатов, это связано с тем, что пленки фиброина шелка хорошо впитывали краситель и детекция на конфокальном микроскопе была невозможна из-за сильного фонового окрашивания. В связи с этим, нами был использован метод «ДНК комет», который позволяет детектировать повреждение ДНК, которое может привезти к запуску апоптоза или некроза (Рис. 51).
При анализе полученных данных «ДНК-комет» было показано, что материал не является токсичным. Для сравнения использовали культуру клеток, культивируемую на пластике, а положительным контролем - клетки после 10 минут экспозиции под ультрафиолетом. Достоверное различие было в опытных группах с положительным контролем, это позволяет сделать вывод о том, что материал не является токсичным (Рис. 52).
При анализе характера клеточного роста с помощью световой микроскопии, было показано, что использование 3D клеточных сфероидов сопровождается более равномерным распространением клеток по материалу, в отличие от 2D культуры.
На 2-м этапе работы использовали 3 пленки с клеточными сфероидами и 4-я пустая для создания слоистой структуры (Рис. 53), срок культивирования составил 7 суток (Рис. 54). Была показана возможность создания слоистой структуры используя пленки из фиброина шелка и 3Dклеточных сфероидов, при этом, отмечалось прикрепление и распределение клеток между пленками, оценку жизнеспособности клеток проводили, используя метод ДНК-комет на каждом уровне в отдельности. Анализируя полученные результаты, было показано, что жизнеспособность клеток в различных слоях достоверно меняется, однако был отмечен более высокий уровень индекса ДНК-комет на среднем уровне (Рис. 55). Возможно данный факт связан с тем, что для конструирования стромальной части роговицы необходимо использовать перфорированные пленки фиброина шелка для лучшей диффузии питательных веществ.
Вопрос создания искусственной роговицы остается крайне актуальным до настоящего времени. В доступной литературе представлено большое количество разнообразных подходов для решения данной проблемы. Одним из наиболее перспективных направлений является создание слоистой структуры роговицы с использованием клеточных культур, полученных из каждого слоя роговицы в комбинации с матриксом. Однако данный подход имеет ряд проблем, включающих в себя отсутствие стандартизации методов выделения и культивирования клеточных культур, оптимального материала или комбинации материалов, пригодных для создания оптических, механических и биологических свойств искусственной роговицы, а так же метода конструирования искусственной роговицы на основе матриксов в совокупности с клеточными культурами.
В связи с этим была сформулирована цель нашего исследования - разработка методологических подходов к конструированию искусственной роговицы на основе культивированных клеток трупной донорской роговицы в виде 3Dклеточных сфероидов и полимерных материалов.
Для достижения поставленной цели, работа была разделена на 5 этапов, которые включали в себя разработку протокола выделения и культивирования клеточных культур кератоцитов и заднего эпителия роговицы, подбор питательной среды, изучение сфероидообразования из полученных клеточных культур кератоцитов и заднего эпителия роговицы, подбор полимерного материала пригодного для конструирования искусственной роговицы, а так же, создание слоистой структуры на основе отобранного полимерного материала.
На первом этапе осуществляли подбор оптимальных условий для выделения и культивирования кератоцитов. Для этого был разработан оригинальный протокол и проведен сравнительный анализ с методикой, предложенной FunderburghM.L. с соавт. (Funderburgh M.L., Du Y., Mann M.M., et al. 2005), которая является широко используемой для выделения кератоцитов.
Суть методики, предложенной FunderburghM.L. заключается в том, что после механического удаления клеток переднего и заднего эпителия роговицы, производят выкраивание центральной зоны с последующей механической и 2-х этапной ферментативной дезагрегацией фрагмента роговицы, полученную суспензию клеток переносят в полную питательную среду (Funderburgh, J.L., Funderburgh, M. L., Mann, M. M., et al., 2009). Однако данный протокол имеет ряд недостатков, таких как малая жизнеспособность получаемых клеток и запуск дифференцировки кератоцитов в фибробласты (Funderburgh JL, Funderburgh ML, Du Y. 2016).
Разработанный протокол оригинального метода выделения включает схожие этапы с протоколом FunderburghM.L., такие как механическое удаление клеток переднего и заднего эпителия роговицы и выкраивание центральной зоны. Однако имеет и существенные отличия, такие как более щадящую механическую и ферментативную дезагрегацию, что не вызывает выраженного клеточного ответа на повреждение и способствует тем самым сохранению жизнеспособности клеток. Проведенное исследование показало, что оригинальный метод выделения способствует увеличению количество получаемых клеток и их жизнеспособности, а так же, уменьшает время получения первичной культуры клеток, сократив этапы ферментативной дезагрегации.