Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов и моделированных эффектов микрогравитации Комиссарова Светлана Владимировна

Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации
<
Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов  и моделированных эффектов микрогравитации
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Комиссарова Светлана Владимировна. Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте : влияние тромбоцитов и моделированных эффектов микрогравитации: диссертация ... кандидата Биологических наук: 14.03.03 / Комиссарова Светлана Владимировна;[Место защиты: Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии].- Москва, 2015.- 142 с.

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 12 стр

1. Регенерация нейронов 12 стр

1.1 Ранние наблюдения. Отсутствие пролиферации 12 стр

1.2 Нейрогенез у взрослых млекопитающих 13 стр

1.3 Регенерация нейронов в коре 18 стр

1.4 Теория внутриклеточной регенерации Д.С. Саркисова 20 стр

1.5 Методологические проблемы в исследовании нейрогенеза 21 стр

1.6 Ранние работы НИИ ОПП 31 стр

2. Нейровоспаление. Роль тромбоцитов. Инсульт 35 стр

3. Микрогравитация 42 стр

4. Резюме обзора литературы 45 стр

Глава 2. Материалы и методы 47 стр

1. Модель геморрагического инсульта 47 стр

1.1 Приготовление трансплантата 48 стр

1.2 Оценка локомоторной активности животных 49 стр

2. Моделирование микрогравитации 51 стр

3. Экспериментальные группы 52 стр

4. Приготовление гистологических препаратов 54 стр 4.1 Световая микроскопия 54 стр

4.2 Иммуноцитохимическое исследование 60 стр

4.3 Авторадиография 61 стр

5.Статистический анализ 61 стр

Глава 3. Результаты исследования 62 стр

1. Различие групп по смертности и состоянию функции 62 стр

2. Морфологические особенности очагов инсульта 63 стр

2.1 Первая группа 63 стр

2.2 Вторая группа 68 стр

2.3 Третья группа 74 стр

2.4 Четвертая группа 83 стр

2.5 Пятая группа 87 стр

3. Исследование двухъядерных нейронов 91 стр

Глава 4. Обсуждение результатов 100 стр

Выводы 112 стр

Список литературы

Введение к работе

Актуальность темы. О социальном и медицинском значении

цереброваскулярных заболеваний можно судить по следующим фактам. Смертность от цереброваскулярных заболеваний уступает лишь смертности от заболеваний сердца и смертности от опухолей всех локализаций. Она достигает в экономически развитых странах 11–12%. Многие миллионы людей становятся инвалидами [Гусев и др. 2003; Green, 2008; Donnan et al. 2008].

Распространенность инсультов в мире возрастает. В 2004 г. ВОЗ объявила инсульт глобальной эпидемией. Статистика 2005 года определила число первичных случаев инсульта -16 миллионов; число перенесших инсульт – 62 миллиона, число смертей – 5,5 миллиона. Прогноз на 2030 год: первичных инсультов – 23 миллиона, смертей -7,8 миллиона [Mukherjee and Patil, 2011].

Социальный масштаб проблемы выражается в том, что

цереброваскулярные заболевания наносят огромный ущерб экономике
расходами на лечение, медицинскую реабилитацию, потерями в сфере
производства. В нашей стране расчетная сумма прямых и непрямых затрат
только на проблему инсульта колеблется от 16,5 до 22 миллиардов долларов
в год [Гусев и др. 2003]. Медицинская и социальная значимость
цереброваскулярных заболеваний определяют актуальность изучения их
патогенеза в эксперименте. В патогенетическом аспекте

цереброваскулярные и нейродегенеративные заболевания тесно связаны. Те и
другие являются нейровоспалительными болезнями, имеют важную общую
особенность развития - деятельность микроглиальных клеток, их
структурно-функциональные изменения, обусловленные патогенными

факторами, и обусловливающее, в свою очередь, состояние специфических
клеток мозга (нервных, макроглиальных) и исход патологического процесса
[Prinz et al. 2011; Hesske et al. 2010].
Патогенетически близко к указанным выше болезням стоит черепно-

мозговая травма, не уступающая по распространенности инсульту. По данным института им. Н.В.Склифосовского в России частота черепно-мозговой травмы составляет 4,5 на 1000 населения в год [Официальный сайт НИИСП им. Скл. 2009-2010 отделение неотложной нейрохирургии НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Черепно-мозговая травма].

Столь важное место локальных воспалений мозга в медицине и экономике подвигло ученых на значительное число исследований таких состояний. В самой общей форме результат этих исследований выразился в современном убеждении, что главными взаимосвязанными факторами, определяющими патогенез и исход локальных нейровоспалений, являются: степень повреждения и регенерации нервной ткани, а также влияющие на состояние нервной ткани васкуляризация и активность микроглиоцитов-макрофагов. Опыт мировой медицины свидетельствует, что высокий уровень инвалидизации и смертности при инсультах и травмах мозга, в первую очередь (конечно после таких факторов как локализация и объем поражения), обусловлен недостаточной эффективностью нейропротективной терапии

[Ginsberg, 2009; Green, 2008; Jain, 2008; Arai et al. 2009; Xiong et al. 2010]. Для прогресса в этом направлении нужны знания механизмов физиологической и репаративной регенерации мозга.

Будучи уверенными, что успешность терапии определяется степенью её соответствия природному ходу заживления, мы в выборе темы данного исследования руководствовались одним мотивом: изучать естественные механизмы заживления воспалительного очага. Рассматривая патогенез инсульта, следует, на наш взгляд, попытаться определить роль в этом процессе тромбоцитов. В литературе сообщений на эту тему мы не нашли. А, между тем, скопление и, конечно, активация тромбоцитов постоянный элемент патогенеза как ишемического, так и геморрагического инсульта. На все процессы тканевых повреждений, воспалений, регенерации тромбоциты оказывают существенное влияние, будучи естественным источником множества ростовых факторов. Отсутствие сообщений о влиянии тромбоцитов на развитие инсульта при заведомо понятной значительности этого влияния побудило нас провести данную работу.

При инсультах и при травмах мозга нарушается циркуляция в поврежденном участке и динамика циркуляторных изменений в большой степени определяет развитие последующих событий. В качестве рычагов влияния на циркуляцию мы избрали действие микрогравитации. Гравитационная нагрузка - первичный фундаментальный фактор любого события в природе. Мы обратились к микрогравитации как к способу более простому, более однозначному, чем все другие повлиять на гидростатическое давление в сосудистой системе и таким образом исследовать изменения циркуляции при нарушенном оттоке.

Главная характеристика исхода нейровоспаления – уровень

восстановления функции. В данном исследовании состояние функции
сопоставляли с объективными количественными морфологическими
показателями развития регенераторного процесса в поврежденном участке
мозга. Это позволило судить о клеточном механизме восстановления
функции. Показателем регенерации нейронов был феномен слияния
олигодендроцитов с нейронами и пронейрональное репрограммирование
ядер олигодендроцитов в цитоплазме нейронов. Результатом этого процесса
становится появление в нейроне второго нейронального ядра, второго
генома. Появляются структуры, обеспечивающие поддержание и

восстановление нарушенной функции мозга, т.е. физиологическую и репаративную регенерацию.

Цель исследования. Изучить морфологические и функциональные проявления репаративной регенерации нейронов при экспериментальном кровоизлиянии в мозг. Определить влияние тромбоцитов и микрогравитации на ангиогенез и особенности микроглиально-макрофагальной реакции в этом патологическом процессе.

Задачи исследования.

1.Создать модель кровоизлияния в кору мозга (геморрагического инсульта), предусматривающую введение в очаг повреждения испытуемого материала и обеспечивающую постоянное по воспроизводимости и стандартное по выраженности нарушение двигательной функции животного.

2.Определить морфологические критерии развития ангиогенеза и активации микроглиоцитов-макрофагов (воспалительной клеточной реакции) в очаге локального повреждения мозга.

3.Установить, как влияет на ангиогенез, воспалительную клеточную реакцию и скорость восстановления двигательной функции изменение содержания тромбоцитов в очаге.

4.Изучить влияние различных режимов микрогравитации на ангиогенез, воспалительную клеточную реакцию и восстановление функциональной активности при локальном воспалении мозга.

5.Провести морфологический и цитохимический анализ изменений нейронов в нейровоспалительном очаге.

6.Исследовать зависимость скорости образования двухъядерных нейронов от содержания в очаге тромбоцитов и режима микрогравитации.

Научная новизна исследования. При локальном воспалении мозга
проведен морфологический и цитохимический анализ клеток с двумя
различными ядрами – гетерокарионов, образовавшихся после слияния
нейронов и олигодендроцитов. Доказано, что ядро олигодендроцита
подвергается в гетерокарионе нейрон-специфическому

репрограммированию, в результате которого гетерокарион превращается в
нейрон с двумя одинаковыми ядрами. В одном из самых актуальных
направлений современной биологии - репрограммировании соматических
клеток наша работа занимает особое положение. Репрограммирование
воспринимается научным сообществом как процесс, индуцируемый
человеком путем трансплантации ядер или действия транскрипционных
факторов в культуре. А наша работа открывает пример естественного
репрограммирования, совершающегося в природе уже на протяжении
миллионов лет. Появление в популяции нейронов некоторого числа

двухъядерных увеличивает суммарный геномный фонд этой популяции, что
позволяет компенсировать функцию при утрате части нейронов в

нормальном онтогенезе или при болезни. Установлено, что повреждение
увеличивает число двухъядерных клеток в окружающей очаг повреждения
коре. Иными словами, получено свидетельство осуществления путем
слияния региональных клеток репаративной регенерации мозга. Получены
данные о положительном влиянии тромбоцитов на ангиогенез и активацию
тромбоцитами микроглиоцитов-макрофагов в очаге воспаления мозга.
Изучено влияние микрогравитации на течение экспериментального

геморрагического инсульта. Впервые обнаружено благотворное

тренировочное воздействие микрогравитации при локальном воспалении мозга.

Теоретическая и практическая значимость. Получено знание того,
как регенерируют нейроны ЦНС. Это отнюдь не «стабильная клеточная
популяция», как думали в ХХ веке. Пирамидные нейроны коры оказались
лабильной клеточной популяцией, которая может отзываться на патогенное
воздействие не только гибелью, но и регенерацией. Показана

несостоятельность идеологически вредной формулы: «нервные клетки не
восстанавливаются». Оказалось, что нейроны коры реагируют на
повреждение не пролиферацией, тщетно искавшейся в течение полутора
веков, и искомой до сих пор, а ускорением постоянно протекающего
процесса физиологической регенерации путем слияния нейронов с
олигодендроцитами. В результате такого слияния и последующего нейрон-
специфического репрограммирования ядра олигодендроцита нейрон
становится двухъядерным, что повышает его функциональный потенциал и
документируется в настоящей работе восстановлением полноты движения
конечности. Обозначилась пока не очень отчетливая, но правдоподобная
положительная связь ускорения слияний с ускорением ангиогенеза. То и
другое усиливается тромбоцитами. Дальнейшая экспериментальная

разработка этих данных представляется перспективной в теоретическом и
практическом плане. Такие исследования определят факторы, регулирующие
слияния нервных клеток. Терапевтическое применение комплекса

тромбоцитарных факторов сегодня кажется задачей выполнимой.

Подтверждение нашим исследованием регенераторной роли слияния нервных клеток увеличивает практическую значимость подсчета числа слияний в анализируемом образце как объективного количественного метода определения интенсивности регенерации мозга. Метод позволяет надежно, количественно оценивать действие патогенных и терапевтических факторов. Данные о том, что микрогравитация, предшествующая повреждению, благотворно действует на развитие очага воспаления могут быть использованы для разработки приемов терапевтической и профилактической физкультуры.

Положения, выносимые на защиту.

1. Физиологическая и репаративная регенерация нейронов коры
выражается увеличением числа нейрональных геномов в популяции этих
клеток. Увеличение достигается путем слияния нейронов с
олигодендроцитами, пронейронального репрограммирования ядра
олигодендроцита в цитоплазме нейрона и превращения этого ядра во второе
ядро нейрона.

2. Увеличение содержания тромбоцитов в очаге локального воспаления
коры мозга уменьшает объем разрушенных тканей, увеличивает скорость
ангиогенеза, ускоряет восстановление нарушенной двигательной функции и
частоту слияний нервных клеток.

3. Помещение животного с очагом нейровоспаления в условия
микрогравитации ухудшает отток крови, увеличивает распространенность и

степень деструкции в очаге, замедляет рост кровеносных сосудов и восстановление нарушенной травмой двигательной активности. Применение микрогравитации перед нанесением травмы создает эффект тренировки; улучшает отток крови, уменьшает распространенность и степень деструкции в очаге, ускоряет рост кровеносных сосудов и восстановление нарушенной травмой двигательной активности.

Апробация работы.

Результаты работы были доложены на:

III конференции молодых ученых, посвященной 80-летию со дня рождения профессора В.В. Гаврюшина в виде устного доклада. Конференция была организована РМАПО (2012г., Москва).

Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (2011г., Москва).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 6 - в изданиях, рецензируемых ВАК РФ, и 3 - в иностранных журналах.

Структура и объем диссертации.

Ранние наблюдения. Отсутствие пролиферации

Превращение стволовой клетки в нейроны наблюдали и in vivo [Snyder et al. 1992]. Открытие нейральной стволовой клетки вызвало несоизмеримое с прежними годами увеличение числа попыток найти постнатальный нейрогенез. Вторым следствием открытия стало исчезновение предвзято отрицательного отношения к находкам. Открытие не только нейральной, но и всех остальных стволовых клеток породило романтические надежды на их скорое терапевтическое использование. В ослеплении увлеченности многие (профессионалы) решили, что стволовые клетки это готовый или почти готовый препарат, введением которого можно вылечить многие тяжелые болезни. Найти нейрогенез очень хотелось, и журналы запестрели описаниями удач. В двух зонах мозга (как раз тех, о которых писали первооткрыватели Altman и Kaplan) постнатальный нейрогенез находили наиболее часто, количество новых нейронов было максимальным, а количество опровергающих сообщений минимальным. Эти зоны – субвентрикулярная боковых желудочков мозга [Johansson et al. 1999; Doetsch et al. 1999; Lois et al. 1994] и субгранулярная зубчатой фасции гиппокампа [Kempermann et al. 1997а; Kempermann et al. 1997b; Kempermann et al. 1998; Gould et al. 1999; Kornack et al. 1999].

В 1998 году появилось сообщение о нейрогенезе в гиппокампе человека [Eriksson et al. 1998]. В 90-х годах ХХ века клеточное размножение определяли, как и раньше, по включению низкомолекулярного предшественника в ДНК нейронов. Однако в противоположность предыдущим десятилетиям тимидин заменили его аналогом – бромдиоксиуридином (BrdU) [Miller et al. 1988]. Многие достоинства тимидина (меньшая токсичность, отсутствие необходимости денатурировать ДНК и тем повреждать ткань [Wojtowicz and Kee, 2006], возможность получать количественные данные, меньшая вероятность, даже невозможность, перекрывания в срезе меченого ядра немеченым) были пожертвованы двум преимуществам BrdU. 1. Флуоресцентную метку BrdU можно совмещать с флуоресцентно-меченными маркерами нейронов [Richard et al. 1992] или предшественников нейронов и по присутствию маркера судить о том, какая клетка новообразовалась (пометилась BrdU). 2. Результат эксперимента с тимидином приходится ждать 2-6 недель для накопления в фотослое метки, а результат с BrdU можно узнать в день фиксации материала по связыванию клеткой антител к BrdU, меченных ферментом или флуорохромом.

BrdU иногда вводится человеку для определения по результатам анализа биопсий скорости пролиферации опухолей. Именно эти ситуации и были изучены Eriksson с соавторами. Они описали данные исследования мозга у 5 больных, умерших через 15 дней – 2 года после введения BrdU. У всех был обнаружен нейрогенез в гиппокампе.

Нейрогенез в гиппокампе подвергся особо тщательному и многостороннему исследованию. Был не просто доказан факт новообразования нейронов в гиппокампе взрослых млекопитающих, но морфологически прослежена интеграция новообразованных нейронов в местную нейронную сеть [Zhao et al. 2006; Toni et al. 2008; Toni et al. 2007]. Обнаружена связь нейрогенеза с обучением и памятью [Shors et al. 2001; Winocur et al. 2006; Squire and Bayley, 2007; Wiltgen et al. 2004; Neves, 2008; Kitamura et al. 2009], с поведением и локомоторными способностями животных [Hayashi et all. 2008]. Показана зависимость нейрогенеза от действия повреждающих факторов среды [Mirescu, et all. 2006; Mirescu , Peters, 2006]. Выяснилось, что благотворное действие физической нагрузки на функции гиппокампа реализуется через нейрогенез [Pereira et al. 2007]. При лечении моделированной болезни Альцгеймера наблюдали синхронное повышение нейрогенеза и улучшение когнитивной функции [Wang et al. 2010].

Таким образом, сегодня не нужно доказывать существование нейрогенеза в гиппокампе. Журналы несут многочисленные сообщения о влиянии нейрогенеза на функции гиппокампа. Столь же несомненен нейрогенез в субвентрикулярном слое боковых желудочков и миграция нейробластов в обонятельные луковицы. [Lois et al. 1994]. Установлена связь субвентрикулярного нейрогенеза с обонятельной функцией [Corotto et al. 1994]. Нейрогенез в обонятельных луковицах, подобно гиппокампу, обнаружен не только у грызунов, но и у человека [Curtis et al. 2007].

После открытия и окончательного доказательства нейрогенеза в гиппокампе и в окружности боковых желудочков в нейробиологии утвердился термин «нейрогенные», обозначающий зоны собственно нейрогенеза: субгранулярный и субвентрикулярный слой, а также зоны, куда приходят нейробластами вновь образованные нейроны: гранулярный слой зубчатой извилины и обонятельные луковицы. Все остальные отделы мозга называют «не нейрогенными». Были заявления и даже неоднократные о нейрогенезе в коре, стриатуме, амигдале, гипоталамусе, черной субстанции, стволе мозга. [Gould, 2007]. Но всё же определение «не нейрогенные» за перечисленными отделами сохранилось. Причина простая: последующие исследования не подтвердили первичных заявлений [Lichtenwalner et al. 2006]. Последнее предложение относится ко всем перечисленным участкам мозга. Однако, в нашем обзоре на вопрос о нейрогенезе в коре нельзя ответить одним предложением, его следует рассмотреть подробнее. Причин для подробности несколько. Кора – область особого интереса нейробиологии. Это отразилось и в количестве исследований нейрогенеза в коре, несоизмеримым с другими зонами мозга. Неоднократно объектом изучения был мозг человека, но не было сообщений об обнаружении нейрогенеза в коре. Упорство сторонников нейрогенеза в коре намного больше, чем сторонников нейрогенеза других локализаций. Если другие согласились с возражениями, то некоторые «корьеристы» продолжают публиковать свои данные.

Ранние работы НИИ ОПП

Микроглиоциты активируются при нарушениях гомеостаза [Nimmerjahn et al. 2005] и становятся главным элементом нейровоспаления [Jander et al. 1998]. Слово «активируются» общепринято. Мы его используем не только, чтобы оставаться в границах привычной терминологии, но, главным образом, потому, что активация имеет структурное выражение. Конечно помня при этом, что обеспечение микроглией стабильности здорового мозга не пассивность и не соответствует слову англоязычной литературы «resting». В воспалительный очаг привлекаются и моноциты крови. Пока не решен вопрос о том, одинаковы ли свойства и судьба мононуклеарных фагоцитов, прибывших из костного мозга, и их местных «двойников», микроглиоцитов [Prinz and Mildner, 2011]. Активированные микроглиоциты и активированные моноциты имеют вид макрофагов и сегодня по структуре и цитохимии не различаются. Главный сенсор и главный эффектор нейровоспаления макрофаг. В этом специфика нейровоспаления [Giulian, 1987; Giulian et al. 1989; Garden and Moller, 2006]. Классические же клетки воспаления – нейтрофилы редко вмешиваются в судьбу нейровоспаления. Вопрос о том какова среди структурно охарактеризованных «макрофагов» доля обычных макрофагов, т.е. клеток, пришедших из крови, и какова доля местных активированных микроглиоцитов, оживленно обсуждается [Ito et al. 2001; Smirkin et al. 2009; Schilling et al. 2003; Denker et al. 2007]. Но до сих пор не решен из-за отсутствия цитохимических маркеров, позволяющих различить эти клетки [Schilling et al. 2003]. В нижеследующем тексте мы будем называть обсуждаемые клетки макрофагами, поскольку идентифицируем их по структуре. Но, конечно, нельзя снять предположения, что это активированные микроглиоциты, а, вернее всего, сообщество макрофагов и микроглиоцитов. На модели инсульта спинного мозга у крыс Tatsuhiro Nakata et al. (2011) показали в трансгенном эксперименте, что соотношение макрофаги (меченые GFP) – микроглия меняется при разной степени повреждения мозга.

Сам факт присутствия и количество присутствующих макрофагов в поврежденной ткани мозга не может ассоциироваться ни с полезным, ни с вредным влиянием на течение воспалительного процесса. Роль этих клеток не поддается упрощенной трактовке, поскольку их участие в воспалении сложно и разнообразно: секреция нейротрофических факторов, и элиминация остатков мертвых клеток; продукция оксидантов и провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF [Giulian and Baker, 1986; Matsumoto et al. 2003; Mildner et al. 2007; Ito et al., 2001]. Welser et. al. [Welser et al. 2010] исследовали in vitro влияние кондиционной среды микроглиоцитов на культуру эндотелиальных клеток мозга. Обнаружили: среда неактивированных микроглиоцитов ингибировала пролиферацию эндотелиальных клеток, а среда, активированных микроглиоцитов стимулировала пролиферацию эндотелиоцитов. Первое действие опосредовалось TGF-b1, а второе – TNF. Отмечены и другие признаки связи макрофагов с ангиогенезом: Manoonkitiwongsa P.S. с сотр. [Manoonkitiwongsa et al. 2001] описали увеличение удельной площади микрососудов соответственно увеличению числа макрофагов при инсульте. За пределами инфильтрата избытка сосудов не находили. Уменьшение числа макрофагов в зоне инсульта происходит согласовано с уменьшением плотности расположения микрососудов [Yu et al., 2007].

Роль макрофагов в развитии инсульта длительно обсуждалась в понятиях польза-вред [Bessis et al. 2007; Stoll et al. 2002]. Изначально ясна ограниченность этих понятий, их непригодность к объяснению любых защитных реакций организма и макрофагальной инфильтрации в том числе. Задача науки сложнее: понять, как соотносятся отдельные моменты действия макрофагов на нейровоспаление на различных его этапах. Использовать полученное знание, прежде всего, чтобы не вредить естественному процессу, а в идеале сделать опекаемое медициной заживление успешнее стихийного. Как уже отмечалось, макрофаги (активированная микроглия) выделяют разрушающие факторы: активные формы кислорода, цитотоксические цитокины. Они могут усиливать первичное повреждение нервной ткани [Lippoldt et al. 2005]. Но, конечно, есть свидетельства регенераторной роли макрофагального инфильтрата. Так, в исследовании большой группы японских ученых [Smirkin et al. 2010] при инсульте у крыс, вызванном транзиторной (90 минут) окклюзией средней мозговой артерии, было испытано действие инъекции 5-флуороурацила (5FU) на второй день после реперфузии. В этот срок происходит интенсивная пролиферация макрофаго подобных клеток, чувствительных к проапоптозному действию 5FU. Уменьшение содержания макрофаго-подобных клеток увеличивало зону некроза и часто приводило к смерти крыс. В контроле животные не умирали. Трансплантация макрофаго-подобных клеток в зону инсульта на 5й день реперфузии уменьшала объем повреждения и предотвращала гибель животных. Путем ПЦР с обратной транскрипцией авторы обнаружили, что макрофаго-подобные клетки экспрессируют мРНК, кодирующую FGF, морфогенетические белки кости (BMP): BMP2, BMP4, BMP7; GDNF (глиальный нейротрофический фактор), HGF (фактор роста гепатоцитов), IGF, PDGF и VEGF. Такое обилие ростовых факторов и эффективность трансплантации макрофаго-подобных клеток на 5 день, когда нейроны и глиоциты в зоне ишемии уже погибли, дали основание авторам заключить, что макрофаго-подобные клетки эффективно препятствуют распространению ишемической зоны и смерти крыс. Они предотвращают продолжение совершившейся в первичном очаге дегенерации. Удаление фагоцитами детрита обеспечивает условия для роста аксонов [Tanaka et al. 2009]. Есть экспериментальные результаты, указывающие на участие микроглии в компенсации нанесенных инсультом повреждений. Торможение активации микроглии инъекцией 3-аминобензамида сопровождалось долговременным снижением экспрессии двух белков нейрональной пластичности: синаптофизина (маркер синаптогенеза) и GAP-43 (маркер нейритогенеза). Значительно уменьшалась продукция BDNF [Madinier et al. 2009].

Оценка локомоторной активности животных

Полутонкие и электронно-микроскопические (50nm) срезы изготовляли на ультрамикротоме фирмы Leica EM UC6 (Австрия). Полутонкие срезы просматривали в световом микроскопе BX51фирмы Olympus (Япония), снабженным фотокамерой Color View II и программой компьютерного анализа изображений Cell F. Срезы для электронной микроскопии срезы контрастировали в приборе Leica EM АС20 (Австрия), растворами уранилацетата и лимоннокислого свинца. Просматривали и фотографировали в электронном микроскопе Leo 912AB Omega (Германия).

Реакцию проводили с двумя типа антител: к белку зрелых нейронов NeuN и к белку микротрубочек МАР2. NeuN позволяет выявлять взрослые нормальные синтетически активные нейроны головного мозга. Для таких же нейронов характерно и наличие особы структур в цитоплазме, образованных микротрубочками. Для выявления этих структур использовали антитела к МАР2.

Использовали вибратомные срезы (10m) мозга, фиксированного в течение 2 суток в 4% растворе параформальдегида на РBS. Срезы обрабатывали 0,1% раствором TRITON X-100 в PBS в течение 10-15 мин. при комнатной температуре. Блокировали раствором ChemiBLOCKER (Millipore) в течение 30мин. Первую инкубацию с антителами – к NeuN (MAB377, Millipore) mouse anti-neuronal nuclei в концентрации 1:500 проводили в течение часа при комнатной температуре. После инкубации с первичными антителами в течение 30мин инкубировали с Image-iT FX signal enchancer (Invitrogen). Вторичными антителами - Alexa Fluor 488 goat anti-mouse (Invitrogen) в концентрации 1:1000 обрабатывали в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Отмывали PBS и инкубировали с флуорохромом DAPI (Sigma) в концентрации 1:105 в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Заключали срезы в среду Fluoromount (Sigma). Для контроля окраски использовали такой же протокол, но без первичных антител. Готовые препараты просматривали под микроскопом Olympus BX51(Япония). Методика определения MAP2 повторяла методику определения NeuN во всем, за исключением концентрации антител. Первичное антитело – Chk pAb to MAP2 (Abcam), концентрация – 1:1000. Вторичное антитело – Goat pAb to Chk Ig (DyLight 488) (Abcam), концентрация – 1:1000.

Данный метод применялся для выявления уровня транскрипции в клетках мозга. Радиоактивный предшественник РНК – уридин-Н вводили в левый боковой желудочек мозга в дозе 100 мкКи, в объеме 20мкл. Время присутствия предшественника в организме – 2 часа. Полученные с помощью вибратома срезы покрывали эмульсией Amersham EM-1 и, после экспозиции в темноте в течении 10 дней, проявляли проявителем D-19. Срезы окрашивали флуорохромом DAPI. Это позволяло по структуре ядра в эпифлуоресценции различать нейроны и олигодендроциты. Чтобы стали видны зерна серебра, препарат освещали одновременно с эпифлуоресценцией проходящим через конденсор светом. Предшественник неравномерно распределялся в коре. Поэтому из многих срезов выбирали для фотографии те, в которых зернами серебра были мечены только нейроны, а олигодендроциты оставались немечеными. Сделать это нетрудно, поскольку в нейронах РНК синтезируется с гораздо большей скоростью, чем в олигодендроцитах.

У каждого животного из участков коры, указанных на Рис. 3 вырезали по 3 кусочка ткани. Каждый кусочек резали так, чтобы получить не менее 3-х полутонких несерийных срезов. В полутонких срезах, в области III – V слоев коры считали количество двухъядерных нейронов (ди- и гетерокарионов). Затем с помощью программы Cell F измеряли площадь такого участка среза. Разделив число двухъядерных клеток на площадь, в которой они были обнаружены, устанавливали плотность расположения двухъядерных нейронов на мм2 среза. Результаты сравнивали по критерию Вилкоксона.

В первой экспериментальной группе из 9 оперированных животных в первую ночь после операции погибли 3 крысы, во второй из 12 – 4, в третьей из 24 – 18. В четвертой группе было прооперировано 12 животных, из которых погибло 5, в пятой – 8 животных, из которых погибла 1 крыса. На вскрытии обнаруживали обширные эпидуральные и субдуральные кровоизлияния в левом полушарии головного мозга. При морфологическом анализе фронтальных срезов головного мозга погибших крыс установили, что кровоизлияния распространялись только на кору полушария, не проникая в белое вещество и в желудочки.

Вторая группа

По структуре второго ядра, как показано в результатах нашей работы гетерокарионы могут быть распределены в последовательность, представляющую собой возрастающую степень сходства второго ядра с ядром нейрона. Такой «палитре» гетерокарионов можно предложить два объяснения. Первое объяснение - нейроны сливаются с разными клетками. В самом деле, если предположить, что нейрон может сливаться с любыми, присутствующими в мозге клетками, то слияние с олигодендроцитом или микроглиоцитом обусловит максимальное отличие второго ядра от ядра нейрона. Слияние же с предшественником олигодендроцита (NG2+ клетка) или астроцитом выразится гораздо большим сходством второго ядра с ядром нейрона. Однако такое объяснение разнообразия вторых ядер гетерокарионов отвергается цитохимическим и радиоавтографическим исследованиями. Второе ядро не только морфологически бывает сходно с ядром нейрона, но в нем обнаруживаются маркеры нейронов и сходное с нейроном увеличение скорости транскрипции. Ни микроглиоцит, ни предшественник олигодендроцита, ни астроцит такими способностями не обладают. Поэтому мы объяснили разнообразие вторых ядер в гетерокарионах тем, что гетерокарион образование развивающееся. Дифференцировка клеток не является раз и навсегда заданным состоянием. Такое состояние постоянно поддерживается в определенном динамичном положении равновесием регулирующих дифференцировку факторов или, иными словами, определенную схему транскрипции [Blau and Baltimore, 1991]. После слияния, т.е. образования гетерокариона, маленький олигодендроцит попадает в большой нейрон. Давними опытами по слиянию клеток разной величины в культуре установлено, что среди прочих причин, влияние партнера по слиянию тем сильнее, чем больше объем его цитоплазмы [Ringertz and Savage, 1976]. Концентрация транскрипционных факторов олигодендроцита резко снижается и теперь схему транскрипции ядра олигодендроцита определяют нейральные факторы. В этих условиях бывшее ядро олигодендроцита неизбежно становится вторым ядром нейрона. Действие одинаковых причин не может дать различные результаты.

Таким образом, нами получены доказательства того, что ядро олигодендроцита попадает путем слияния клеток в цитоплазму нейрона и в ней подвергается пронейрональному репрограммированию. Репрограммирование соматических клеток сегодня привлекает большое внимание, интенсивно исследуется. Начало этому разделу биологии положили эксперименты Gurdon с сотрудниками [Gurdon et al. 1958] по переносу ядра соматической клетки в цитоплазму яйцеклетки у амфибий. При удачном выполнении трансплантации ядра из такой яйцеклетки могло развиться взрослое нормальное животное. Иными словами они доказали что дифференцированное состояние обратимо, что возможен возврат к более ранним этапам дифференцировки и даже к плюрипотентности. Актуальность проблеме перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентные придает надежда создать аутологичный для пациента и в то же время соответствующий его болезни материал для клеточной терапии. В 2006 году Takahashi и Yamanaka [Takahashi and Yamanaka, 2006] удалось путем культивирования фибробластов эмбриона или взрослой мыши в присутствии четырех транскрипционных факторов создать индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки. Эти клетки не отличались от естественных эмбриональных стволовых клеток по морфологии, культуральным свойствам и маркерам. Через год группа японских исследователей под руководством Yamanaka получила iPS культивированием с теми же факторами фибробласт взрослого человека [Takahashi et al. 2007]. В 2012 году Gurdon и Yamanaka получили Нобелевскую премию за исследования по репрограммированию соматических клеток.

Известное сегодня репрограммирование соматических клеток это процесс, обусловленный специальными действиями человека и протекающий в экспериментальных условиях. Наши данные показывают, что репрограммирование ядер происходит и без вмешательства человека. Происходит это очень сходно с вариантом предложенным Gurdon et al. [1958]. Обнаруженное нами естественное репрограммирование включается, как и у Gurdon et al. [1958] перемещением ядра в чужую цитоплазму. Как и у тысяч других замечательных изобретений человека – у репрограммирования ядер соматических клеток есть естественный, природный прототип – репрограммирование ядра олигодендроцита в цитоплазме нейрона. Оказывается, природа стала трансплантировать ядра в чужую цитоплазму за миллионы лет до Gurdon а. Понятно, что у природы нет цели, она действует не для чего-то, а почему-то. Однако, если ради образности встать на антропоморфическую точку зрения, приписать природе цель, то получается, что «цель природы» и современного искусственного репрограммирования соматических клеток одна и та же – регенерация. Мы считаем, что регенеративная роль естественного репрограммирования, конечно, не как цель, а как результат отчетливо проявилась в наших экспериментах. Постоянно протекающие у нормальных животных слияния с последующим репрограммированием слившихся ядер обеспечивают «на выходе» появление новых нейрональных геномов. Структура и функция это частные проявления философских категорий материя и движение. Они неразделимы. Структура не может быть без функции. Следовательно, появление дополнительных нейрональных геномов обеспечивает дополнительную нейрональную функцию или восстановление её до прежнего уровня в случае произошедшего снижения. На этом основании мы расцениваем постоянно совершающиеся слияния у нормальных животных как проявления процесса физиологической регенерации. Такая точка зрения подтверждается данными, полученными на модели геморрагического инсульта. Почему мы данные, полученные при изучении патологического процесса, привлекаем для подтверждения процесса физиологической регенерации? Потому, что «в каждом из органов физиологическая и репаративная регенерация всегда выражаются в одной и той же форме» [Д.С.Саркисов, 1993, стр. 126]. Эти два проявления регенерации различаются лишь количественно. Таким образом, увеличение числа слияний после инсульта не только доказывает, что таким путем происходит восстановление разрушенной инсультом ткани мозга, но и подтверждает, что менее частые слияния у нормальных животных есть проявление постоянно протекающего воспроизведения утрачиваемых с возрастом структур в нормальных физиологических условиях.