Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Кирова Юлия Игоревна

Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии
<
Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Кирова Юлия Игоревна. Регуляторная роль сукцинат-зависимых сигнальных систем (HIF-1 и GPR91) при адаптации к гипоксии: диссертация ... доктора Биологических наук: 14.03.03 / Кирова Юлия Игоревна;[Место защиты: ФГБНУ Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии], 2016.- 280 с.

Содержание к диссертации

Введение

I. Обзор литературы 17

1.1. Молекулярные механизмы адаптации к гипоксии 17

1.1.1. Роль митохондрий в регуляции кислородного гомеостаза организма 17

1.1.2. Репрограммирование работы дыхательной цепи в условиях гипоксии 20

1.1.3. Роль митохондрий в формировании резистентности организма к гипоксии 29

1.1.4. Сигнальная роль сукцината при адаптации к гипоксии 35

1.2. Сигнальная роль транскрипционного, индуцируемого гипоксией фактора HIF-1 в формировании адаптации к гипоксии 43

1.2.1. HIF-1: молекулярная структура и транскрипционная активность 43

1.2.2. Механизмы гипоксической стабилизации и активации HIF-loc 46

1.2.3. Роль митохондрий в гипоксической стабилизации HIF-la 49

1.2.4. Роль HSP90 в гипоксической стабилизации HIF-la 50

1.2.5. Ог-независимый синтез HIF-la 53

1.2.6. Роль HIF-1 в развитии адаптивных и патологических процессов 55

1.3. Сигнальная система сукцинат-ОРК91 и ее роль в формировании адаптивных механизмов 57

1.3.1. GPR91: молекулярная структура и сигнальные пути 57

1.3.2. Физиологические и патологические эффекты активации GPR91 в разных тканях 61

1.4. Роль редокс-статуса клеток при гипоксии. Продукция активных форм кислорода как механизм формирования адаптивных реакций 67

1.4.1. Клеточные системы генерации активных форм кислорода в условиях гипоксии 67

1.4.2. Регуляторная роль системы глутатиона и сопряженных редокс-процессов при адаптации мозга к гипоксии

1.5. Заключение 78

Материалы и методы исследования 79

2.1. Типирование животных по чувствительности к гипоксии 79

2.2. Применяемые режимы гипобарической гипоксии 79

2.3. Иммуноблоттинг (Вестерн-блот анализ) 80

2.4. Гистологические методы

2.4.1. Гистологическая обработка ткани мозга 82

2.4.2. Окрашивание поНисслю

2.5. Иммуноцитохимия 83

2.6. Методы исследования антиоксидантной системы клетки

2.6.1. Активность глутатионпероксидазы 84

2.6.2. Активность глутатионредуктазы 84

2.6.3. Активность Си,7п-супероксиддисмутазы 85

2.6.4. Активность каталазы 85

2.6.5. Содержание компонентов пула глутатиона 86

2.7. Методы определения содержания продуктов перекисного окисления липидов 87

2.7.1. Содержание гидроперекисных метаболитов 87

2.7.2. Содержание диеновых коньюгатов 87

2.7.3. Содержание продуктов, реагирующих

с тиобарбитуровой кислотой 88

2.8. Определение активности сукцинатдегидрогеназы 88

2.8.1. Выделение митохондриальной фракции ткани мозга 88

2.8.2. Активность сукцинатдегидрогеназы 89

2.9. Определение содержания сукцината 89

2.9.1. Определение содержания сукцината в тканях 89

2.9.2. Определение содержания сукцината в сыворотке крови

2.10. Использованные в исследовании сукцинатсодержащие препараты 91

2.11. Статистический анализ данных 92

III. Результаты экспериментальных исследований 94

3.1. Роль HIF-loc в ответной реакции организма на гипоксию

и формировании адаптивных процессов 94

3.1.1. Базовое содержание HIF-loc в тканях НУ и ВУ крыс 94

3.1.2. Влияние однократного воздействия гипоксии разной тяжести

и продолжительности на срочную экспрессию HIF-loc 99

3.1.3. Динамика содержания HIF-loc в тканях в постгипоксическом

периоде (после однократного одночасового

воздействия разных гипоксических режимов) 104

3.1.4. Влияние многократного применения разных режимов ГБГ

на экспрессию HIF-loc в КГМ, сердце и печени

ВУ и НУ крыс 106

3.1.5. Роль сукцината и активности МФК II в формировании срочной экспрессии HIF-la при гипоксии 109

3.1.6. Роль ГАМК-шунта в регуляции экспрессии HIF-la в КГМ при гипоксии 115

3.1.7. Взаимодействие HIF-la и белков теплового шока HSP90

и HSP70 при гипоксии 117

3.1.8. Влияние блокады Р-адренорецепторов на экспрессию HIF-la в условиях нормоксии и гипоксии 123

3.1.9. Взаимодействие HIF-la и VEGF при гипоксии 125

3.1.10. Заключение 131

3.2. Роль сукцинатного рецептора GPR91 в формировании механизмов адаптации к гипоксии 134

3.2.1. Базовая (нормоксическая) экспрессия GPR91 в тканях НУ и В У кры с 134

3.2.2. Иммуногистохимический анализ содержания GPR91 в КГМ НУ и ВУ крыс в нормоксических условиях 138

3.2.3. Влияние однократного воздействия разных режимов ГБГ на плотность GPR91 в КГМ, сердце и печени НУ и ВУ крыс.. 140

3.2.4. Влияние многократного (курсового) воздействия разных режимов ГБГ на экспрессию GPR91 в КГМ, сердце и печени НУ и ВУ крыс 144

3.2.5. Иммуногистохимический анализ содержания GPR91

в КГМ НУ и ВУ крыс при многократном действии гипоксии... 147

3.2.6. Динамика содержания сукцината в КГМ и сыворотке крови НУ и ВУ крыс при курсовом применении ГБГ средней тяжести 151

3.2.7. Особенности взаимодействия GPR91 и сукцината в КГМ

при гипоксии 153

3.2.8. Влияние блокады Рі/2-адренорецепторов на уровень GPR91

и содержание сукцинатав КГМ при гипоксии 157

3.2.9. Взаимодействие GPR91 и фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) при однократном воздействии разных режимов гипоксии 158

3.2.10. Роль GPR91 в экспрессии VEGF при многократном (курсовом) применении разных режимов гипоксии 161

3.2.11. Заключение 164

3.3. Действие разных режимов гипоксии на состояние системы глутатиона и сопряженных окислительно-восстановительных процессов в коре головного мозга крыс 168

3.3.1. Содержание компонентов пула глутатиона, гидроперекисных метаболитов, продуктов ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов в КГМ в условиях нормоксии 169

3.3.2. Влияние разных режимов ГБГ на содержание компонентов пула глутатиона, продуктов ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов в КГМ 172

3.3.3. Роль окислительно-восстановительного статуса КГМ в регуляции сукцинатзависимых процессов, контролируемых HIF-la и GPR91 при разных режимах гипоксии 181

3.3.4. Заключение 184

3.4. Влияние разных режимов ГБГ на резистентность НУ и ВУ крыс к ОГБГ 187

IV. Обсуждение результатов 191

Заключение 218

Выводы 221

Список литературы

Введение к работе

Актуальность проблемы. Гипоксия - одно из самых распространенных патологических состояний, связанных с дефицитом кислорода в окружающей клетку среде и являющихся причиной широкого спектра функционально-метаболических нарушений в организме. Она может иметь самостоятельную этиологию, но может выступать в качестве сопутствующего фактора как при заболеваниях, связанных с нарушением функции дыхательной и сердечно-сосудистой систем, так и при подавляющем большинстве других патологий и усугублять их течение.

Распространенность патологий, включающих гипоксическую компоненту, определяет исключительную важность и необходимость понимания механизмов гипоксии, а также социальную значимость проблемы защиты организма от кислородной недостаточности и сопутствующего энергодефицита.

Мишенью гипоксии является аэробный энергетический обмен. Это имеет принципиальное значение для жизнедеятельности клетки в условиях дефицита кислорода. Нарушение синтеза энергии в этих условиях, приводящее к снижению уровня внутриклеточного АТФ ниже физиологической нормы и сопутствующему подавлению энергозависимых процессов, лежит в основе мультисистемности и полиорганности функционально-метаболических нарушений, характерных для гипоксии. Митохондриальная дыхательная цепь, ответственная за аэробный синтез энергии, является сенсором кислорода, регулятором и модулятором потребления кислорода и скорости его поступления из внеклеточной среды в клетку, т.е. участвует в поддержании кислородного гомеостаза (Лукьянова Л.Д., 1981-2011; Chandel N.S., Schumacker Р.Т., 2000; Devin A., Rigoulet М., 2007; Duchen М. et al., 2003; Lukyanova L.D., 1988-2013; Wheaton W., Chandel N., 2011). Митохондриальная дыхательная цепь не только принимает непосредственное участие в сложнейшей системе внутриклеточной и межклеточной сигнализации, но в условиях гипоксии участвует в формировании как ранних, так и поздних адаптивных признаков, благодаря чему обеспечивается формирование системного ответа организма на дефицит кислорода (Лукьянова Л.Д., 1997, 2011; Acker Н., 1994; Lukyanova L.D., 2013, 2014; Lutz P.L., Prentis Н.М., 2002; Michiels С, 2004; Wenger R., 2000; Seppet E. et al., 2009). Все это делает проблему регуляции энергетического обмена, поддержания и сохранения энергетического гомеостаза в клетке и на уровне организма исключительно актуальной и требует изучения и понимания механизмов его нарушения.

Согласно современным представлениям, увеличение резистентности к гипоксии сопряжено с регуляторным переключением потоков электронов в дыхательной цепи, направленным на активацию энергетически более эффективного в условиях гипоксии сукцинатоксидазного пути окисления субстратов (Кондрашова М.Н. и др., 1973; Кондрашова М.Н., Маевский Е.И., 1978; Лукьянова Л.Д., 1975 а,б, 1981, 1987, 2001, 2011). При отсутствии такого переключения срочные механизмы адаптации не формируются. Таким образом, сукцинат - субстрат цикла Кребса и

фермента дыхательной цепи сукцинатдегидрогеназы (СДГ; митохондриальный ферментный комплекс II - МФК II) - выполняет роль сигнальной молекулы, включающейся при гипоксии в поддержание жизненно важных метаболических процессов, т.е. в регуляторный процесс митохондриально-клеточно-системных взаимодействий, обеспечивающих формирование срочных механизмов адаптации к дефициту кислорода (Лукьянова Л.Д. и др., 2012).

Список исследований, посвященных вовлечению сукцината в регуляторные метаболические процессы, непрерывно расширяется. В последнее десятилетие было установлено, что две активно изучаемые системы - гипоксический транскрипционный фактор HIF-la (Semenza G.L., 2004) и рецептор GPR91 (Не W. et al., 2004) - являются сукцинатзависимыми. Это позволяет предполагать не только их участие в механизмах адаптации к гипоксии, но и вовлечение митохондриальной дыхательной цепи в их регуляцию и ее участие во внутриклеточном сигналинге при кислород-дефицитных состояниях, сопровождающихся нарушением функции и метаболизма клеток и развитием различных патологий.

Однако систематические исследования этого вопроса отсутствуют, что и определило проведение данной работы.

Цель диссертационной работы. Проведение комплексных исследований роли транскрипционного фактора HIF-la и сукцинатного рецептора GPR91 в формировании срочных и отсроченных, молекулярных и системных механизмов адаптации к гипоксии, их взаимодействия с дыхательной цепью и некоторыми другими сигнальными системами. Разработка способов предупреждения постгипоксических нарушений и оптимизации гипоксических воздействий на организм и усиления защитно-адаптивных механизмов в условиях дефицита кислорода.

Задачи диссертационной работы:

  1. Изучить фенотипические и тканеспецифические особенности индукции транскрипционного фактора HIF-la и сукцинатного рецептора GPR91 при разных режимах гипоксических воздействий и их связь с формированием молекулярных механизмов адаптации к гипоксическому стрессу и увеличением резистентности организма; выявить оптимальные условия для экспрессии этих факторов.

  2. Изучить зависимость гипоксической индукции HIF-la и GPR91 в коре головного мозга (КГМ) - мишени для гипоксии - от эндогенного и экзогенного сукцината и их взаимодействие с различными сигнальными системами.

  3. Изучить особенности генерации активных форм кислорода и активности системы глутатиона в КГМ при разных режимах гипоксических воздействий и их регуляторную роль в качестве индукторов активности HIF-la и GPR91 и адаптогенов.

  1. Исследовать возможность модулирования работы сукцинатзависимых систем - HIF-la и GPR91 - с помощью фармакологических средств.

  2. Дать оценку возможности терапевтического использования разных режимов гипоксических воздействий для оптимизации формирования адаптации к дефициту кислорода с учетом индивидуальных различий в устойчивости организма к гипоксии; предложить способы оптимизации реакции мозга на гипоксические воздействия и усиления защитно-адаптивных механизмов организма в условиях дефицита кислорода.

Научная новизна исследования

Впервые обосновывается существование сукцинатзависимой сигнальной регуляции, реализующейся при гипоксии через активацию транскрипционного фактора HIF-la и рецептора GPR91, направленной на формирование срочных и отсроченных молекулярных механизмов адаптации и увеличение резистентности организма к дефициту кислорода.

Впервые показано, что индуцируемая гипоксией срочная экспрессия транскрипционного фактора HIF-la и рецептора GPR91 тканеспецифичны, фенотипичны, дозозависимы, сукцинатзависимы, имеют короткий латентный период (при разных режимах: менее 15-30 мин) и сопровождаются формированием срочной и отсроченной защитно-адаптивной резистентности животных к дефициту кислорода.

Впервые установлено существование в КГМ прямой зависимости между срочной гипоксической экспрессией HIF-la, внутриклеточным содержанием сукцината и активностью СДГ, а также обратной зависимости между экспрессией HIF-la и толерантностью организма к гипоксии. Доказано, что в КГМ HIF-la играет ключевую роль в формировании адаптации к гипоксии только у низкорезистентных животных.

Впервые получены сравнительные данные об особенностях распределения в тканях сукцинатного рецептора GPR91 и его корреляции с внутриклеточным содержанием сукцината и СДГ, особенностях динамики его гипоксической индукции, которая при любых использованных режимах гипоксии наиболее выражена в КГМ, и его вовлеченности в формирование срочных и отсроченных механизмов адаптации к гипоксии.

Доказано, что в условиях in vivo срочная гипоксическая сукцинатзависимая экспрессия HIF-la контролируется в КГМ двумя различными механизмами образования эндогенного сукцината: а) в цикле Кребса при активации СДГ и б) за счет функционирования специфического для мозга ГАМК-шунта.

Впервые показано, что при щадящих режимах гипоксии в механизм срочной гипоксической экспрессии HIF-la вовлекается белок теплового шока HSP90, защитное действие которого более выражено в КГМ неустойчивых к гипоксии крыс, но отсутствует влияние на этот процесс белка теплового шока HSP70. Таким образом,

установлено, что при гипоксии в условиях in vivo в нейронах КГМ реализуется сложная, многокомпанентная система срочного регулирования стабильности HIF-la, обеспечивающая оптимальные условия для экспрессии HIF-la и HIF-la-зависимых адаптивных генов.

В противоположность существующей в литературе точке зрения показано, что роль HIF-la как индуктора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) наблюдается в очень ограниченном диапазоне неповреждающих сниженных концентраций Ог во вдыхаемом воздухе и преимущественно в КГМ.

Впервые получены данные о положительной модуляции системы сукцинат-GPR91 в КГМ неустойчивых (НУ) и высокоустойчивых (ВУ) к гипоксии крыс при активации (3-адренергических рецепторов.

Показано, что экзогенный сукцинат (мексидол; 40 мг/кг; в/б), введенный животным in vivo, способствует: 1) активации экспрессии HIF-la в КГМ в гипоксических условиях и не влияет на этот процесс в нормоксических условиях; 2) увеличению плотности GPR91 в КГМ крыс, т.е. выполняет роль лиганда этого рецептора как в нормоксических, так и гипоксических условиях. Для достижения максимально высокой плотности GPR91 в нормоксических условиях необходимо от 3-х до 8 ежедневных инъекций мексидола.

Установлено, что индукция GPR91 может быть связана с увеличением экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в КГМ НУ и ВУ крыс лишь в ограниченном диапазоне концентраций кислорода (при умеренных гипоксических воздействиях).

Впервые получены данные, свидетельствующие о различиях в работе системы глутатиона в КГМ двух фенотипов крыс, проявляющихся как в нормоксических, так и в гипоксических условиях. Доказано, что регуляторные свойства этой системы более сбалансированы в КГМ НУ крыс, нежели у ВУ, что подтверждается достоверно более низким содержанием окисленного глутатиона, гидроперекисных метаболитов и меньшей активностью ферментов цикла глутатиона в сравнении с ВУ и обеспечивает в условиях гипоксии лучшую антиоксидантную защиту мозга НУ особей сравнительно с ВУ.

Усиление свободнорадикальной активности и нарушение регуляторной функции системы глутатиона выявляются в КГМ при тяжелых гипоксических воздействиях и, следовательно, не являются индукторами экспрессии HIF-la и GPR91 при более мягких режимах гипоксических воздействий в условиях максимальной аккумуляции этих белковых факторов, т.е. не являются в этом случае триггерным механизмом.

Теоретическая и практическая значимость диссертационной работы

Настоящее исследование относится к мало разработанному и приоритетному для России биомедицинскому направлению - изучению молекулярных таргетных

механизмов адаптации организма к гипоксии. Впервые проведенное многопараметрическое сравнительное исследование активности двух сукцинатзависимых систем (HIF-la и GPR91) в широком диапазоне сниженных концентраций кислорода позволило доказать их вовлеченность в формирование срочных и отсроченных защитных механизмов адаптации и обосновать существование сукцинатзависимой сигнальной регуляции при гипоксии, реализующейся по принципу аутокринного сигнала.

Результаты являются инновационными, существенно расширяют и модифицируют современные представления о молекулярно-клеточных механизмах индивидуальной толерантности организма к гипоксии. Показано, что низкая базовая устойчивость к гипоксии сопряжена с высокими уровнями экспрессии HIF-la во всех тканях организма и, в особенности, в КГМ. HIF-la играет ключевую роль в формировании адаптации к гипоксии у НУ животных. Таким образом, проведенные исследования позволили выявить обратную зависимость между толерантностью организма к гипоксии и экспрессией HIF-la.

Полученные в работе данные позволили определить оптимальные для индукции HIF-la и GPR91 режимы однократного и курсового применения гипобарической гипоксии в условиях in vivo с учетом индивидуальной толерантности животных к дефициту кислорода, а также обосновать правомочность применения в гипоксических условиях экзогенного сукцината в качестве активатора этого процесса, ускоряющего формирование толерантности организма к гипоксии. Все это, в свою очередь, доказывает важность и необходимость специальной разработки режимов гипоксических воздействий (гипокситерапии) в спортивной и клинической медицине, методов мониторирования про-, дезадаптивных состояний, индуцируемых гипоксией, и при формировании терапевтических схем применения сукцинатсодержащих препаратов.

Тот факт, что экспрессия GPR91 развивается в КГМ НУ и ВУ крыс не только в условиях умеренной, но и тяжелой гипоксии при активации процессов свободнорадикального окисления и под контролем адренергической системы, позволяет рассматривать экспрессию сукцинатного рецептора как нейропротекторный механизм, реализующийся в условиях тяжелых гипоксических воздействий, сопряженных с развитием окислительного стресса.

Полученные данные позволили обосновать возможность клинического применения сукцинатсодержащих препаратов для направленного модулирования процессов адаптации к гипоксии, а также для защиты организма, в особенности головного мозга, в условиях гипоксии, ишемии, нейротоксических воздействий. Выводы диссертационной работы могут быть использованы при разработке индивидуальных режимов гипоксических воздействий в тех областях медицины, в которых традиционно используется гипокситерапия и гипоксические тренировки - в

спортивной, авиационной, космической, профилактической и реабилитационной медицине, кардиологии, неврологии, акушерстве.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Индуцируемая гипоксией срочная экспрессия транскрипционного фактора HIF-la тканеспецифична, фенотипична, дозозависима и сукцинатзависима. Гипоксическая активация этой системы в КГМ - мишени для HIF-la - характерна для НУ к острой гипоксии крыс, выявляется при сниженных, но неповреждающих концентрациях кислорода во вдыхаемом воздухе, подавляется при тяжелых повреждающих режимах гипоксии и сопровождается формированием срочной защитно-адаптивной резистентности этих животных к дефициту кислорода.

  2. Срочная гипоксическая экспрессия HIF-la в КГМ преимущественно НУ крыс зависит как от активности сукцинатоксидазного окисления (МФК II), так и от активности ГАМК-шунта и индуцируется сукцинатсодержащими препаратами, т.е. регулируется сукцинатом эндогенного и экзогенного происхождения.

  3. Срочная гипоксическая индукция GPR91 - тканеспецифичный процесс, наиболее выраженный в КГМ (ткань-мишень) НУ к гипоксии животных. Она связана преимущественно с активностью ГАМК-шунта, являющегося в этих условиях главным источником эндогенного сукцината для рецептора, и регулируется сукцинатом экзогенного происхождения.

  4. Усиление свободнорадикальной активности и нарушение регуляторной функции системы глутатиона, контролирующей антиоксидантную защиту в КГМ, выявляются при тяжелых гипоксических воздействиях, но отсутствуют при более мягких режимах гипоксии, в условиях максимальной индукции и аккумуляции HIF-la и GPR91 и, следовательно, не являются в этом случае триггерным механизмом их гипоксической экспрессии.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 642 источника, в том числе 105 на русском и 537 на английском языках. Работа иллюстрирована 55 рисунками и 16 таблицами.

Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 34 работы на русском и английском языках, в том числе 12 статей в журналах, соответствующих критериям и из списка ВАК.

Апробация работы. Материалы исследования были представлены на: IX Всемирном конгрессе Международного общества по адаптационной медицине (ISAM) (Тайпей, Тайвань, 2-5 августа 2009); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня основания института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды» (Санкт-Петербург-Колтуши, 7-10 декабря 2010); XXI Съезде Физиологического общества имени И.П. Павлова (Калуга, 19-25 сентября 2010); Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 24-26 мая 2011); VI Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 11-13 октября 2011); XV Всероссийском симпозиуме, посвященном 50-летию кафедры нормальной физиологии РУДН «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 6-9 июня 2012); II Международной научной конференции «Высокогорная гипоксия и геном» (Кабардино-Балкария, Приэльбрусье, Терскол, 14-17 августа 2012); X Всемирном конгрессе Международного общества по адаптационной медицине (ISAM) (Будапешт, Румыния, 7-10 июня 2012); III Российской конференции с международным участием «Проблемы нарушения клеточной энергетики (Митохондриальная патология)» (Москва, 23-25 октября 2012); IV Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 18-21 июня 2013); Всероссийской конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург-Колтуши, 24-26 июня 2014); IV Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 8-12 октября 2014); XI Всемирном конгрессе Международного общества по адаптационной медицине (Ионаго, Япония, 27-30 мая 2015); Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 25-28 мая 2015).

Личный вклад автора. Разработка общего плана исследования, выбор методических подходов и схем экспериментов, интерпретация данных были выполнены автором совместно с научным консультантом исследования Л.Д. Лукьяновой. Подготовка животных к экспериментам (ранжирование по индивидуальной устойчивости к гипоксии), введение препаратов, экспонирование животных в условиях разных режимов ГБГ, тестирование общей резистентности организма к острой гипоксии после введения препаратов и гипоксических тренировок осуществлялась автором совместно с Э.Л. Германовой. Весь комплекс лабораторно-аналитических работ (биохимические тесты, иммуноблоттинг, иммуногисто-химические, морфологические исследования) и статистическая обработка данных были выполнены лично автором.

Роль митохондрий в формировании резистентности организма к гипоксии

Таким образом, в ответ на нарушение оксигенации происходит регуляторная перестройка работы субстратного участка дыхательной цепи. Активация альтернативных метаболических потоков, выполняющих функцию срочных компенсаторных механизмов, позволяет сохранить поступление восстановительных эквивалентов на цитохромный участок дыхательной цепи, благодаря чему функция МФК III и IV и синтез АТФ в этом участке не нарушаются. Это обеспечивает сохранение энергосинтезирующей функции.

Этот процесс направлен на использование энергетически более эффективного в условиях гипоксии сукцинатоксидазного пути окисления субстратов, благодаря чему предупреждаются или ослабляются нарушения синтеза АТФ и параметров аденилатного пула, а также жизненно важных функций организма, устраняется характерный для гипоксии ацидоз и, как следствие, увеличивается резистентность организма к дефициту кислорода.

Если такое переключение не происходит, то наблюдается резкая деэнергизация (снижение мембранного потенциала, потеря АТФ и изменения в пуле адениннуклеотидов, нарушение дыхания, связанного с окислением НАД-зависимых субстратов - донаторов электронов для комплекса І (Дудченко A.M., Лукьянова Л.Д., 2003, 2004; Дудченко A.M. и др., 1996; Лукьянова Л.Д., 1982, 1989, 1997;Lukyanova L.D., 1988, 1997, 2014; Lukyanova L.D. et al, 2008, 2009). Все это в совокупности предшествует изменениям других функционально-метаболических параметров, контролирующих жизнедеятельность клетки: конденсации митохондриального матрикса, нарушению кальциевого и калиевого гомеостаза, потере чувствительности к кислороду, нарушению экспрессии митохондриального генома, появлению активных форм кислорода митохондриального происхождения, потере CoQ, инициации выхода цитохрома с в межмембранное пространство, апоптозу, снижению способности клетки адаптироваться к низким рОг. При этом происходит повышение отношения лактат/пируват, измененяется редокс-потенциал клетки, развивается метаболический ацидоз. Наряду с этим страдают различные энергозависимые процессы (например, электрогенная функция электровозбудимых клеток, анаболические процессы - синтез мочевины, реакции второй стадии биотрансформации и др).

В настоящее время получено большое количество экспериментальных доказательств в пользу универсальности такого механизма на ранних стадиях гипоксии.

Признаками инактивации МФК I при гипоксии, развивающейся вслед за усилением его активности, являются: первичное увеличение и последующее снижение интенсивности окисления НАД-зависимых субстратов и эффективности зависящего от него окислительного фосфорилирования (Лукьянова Л.Д., 1989, 1997, 2000, 2002; Лукьянова Л.Д. и др., 1999; Романова В.Е. и др., 1991; Чернобаева Г.Н. и др., 1991, 1993); уменьшение чувствительности дыхания различных тканей (мозг, сердце, печень, гепатоциты) к специфическим ингибиторам НАД-зависимого участка дыхательной цепи, например, ротенону (Дудченко A.M., Лукьянова Л.Д., 2003; Корнеев А.А., Лукьянова Л.Д., 1987; Лукьянова Л.Д., Власова И.Г., 1989). Имеются и прямые доказательства того, что на этой стадии гипоксии происходит снижение активности чувствительной к специфическим ингибиторам НАДН-убихинон оксидоредуктазы (МФК I) и накопление НАД-зависимых субстратов цикла Кребса при сохранении активности остальных ферментов дыхательной цепи (Дудченко A.M. и др., 1996; Дудченко A.M., Лукьянова Л.Д., 2004; Lukyanova L.D., 2004).

Этот феномен известен в литературе как митохондриалъная дисфункция. В настоящее время имеется большое количество экспериментальных подтверждений нарушения электронтранспортной функции МФК І в условиях гипоксии, которая сохраняется и даже усиливается в постгипоксическом периоде (первые 30 мин -2ч реоксигенации) (Agani F.H. et al., 2002; Da Silva M. et al., 2003; Genova M. et al, 1995; Lukyanova L.D., 1988; Lukyanova et al, 2009; Maklashinas E. et al, 2002; Pitkanen S., Robinson B.H., 1996; Rouslin W., Millard R., 1980; Sadek H. et al, 2004). Одновременно при гипоксии наблюдается активация сукцинатдегидрогеназы и сукцинатоксидазного окисления, а также увеличение вклада последнего в дыхание и синтез энергии (Кондрашова М.Н., 1972, 1976, 1989, 1991; Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В., 1985; Кондрашова М.Н., Маевский Е.И., 1978; Кондрашова М.Н. и др., 1973; Лукьянова Л.Д., 1975а,б, 1981, 1997, 2004а, 2011; Лукьянова Л.Д., Коробков А.В., 1981; Лукьянова Л.Д., Мурашко Л.М., 1973; Лукьянова Л.Д. и др., 1976, 1978, 1999, 2007, 2015; Маевский Е.И. и др., 2000). В условиях гипоксии меняются кинетические свойства основных ферментов комплексов I и П. Так, в неокортексе НУ крыс любое гипоксическое воздействие приводит к противоположным изменениям Км обоих ферментных комплексов: увеличению значений Км НАДН-убихинон-оксидоредуктазы (МФК I) и уменьшению значений Км сукцинатдегидрогеназы (МФК II) (Дудченко A.M., 1976; Лукьянова Л.Д., 1982, 1987; Лукьянова Л.Д. и др., 2007). Процесс отражает снижение эффективности работы фермента в первом случае и его увеличение - во втором. Таким образом, переключение при разных формах гипоксических воздействий путей окисления субстратов дыхательной цепи от НАД-зависимого на сукцинатоксидазный путь обусловлено кинетическими причинами и является срочным регуляторним и компенсаторным механизмом адаптации, который реализуется в условиях дефицита кислорода в большинстве тканей (мозг, миокард, печень, почки, лимфоциты). Он предупреждает или ослабляет характерные для гипоксии нарушения синтеза АТФ и оказывает нормирующее действие на параметры аденилатного пула, а также на жизненно важные функции организма, способствует устранению гипоксического ацидоза, увеличению резистентности организма к дефициту кислорода и формированию срочной резистентности. Если такое переключение не происходит (некомпенсированная дисфункция МФК I), наблюдается более ранняя деэнергизация клеток, сопровождающаяся гораздо более выраженными нарушениями функционально-метаболических параметров, контролирующих жизнедеятельность клетки (Лукьянова Л.Д., 1982, 1989, 1997, 2000, 2011; Дудченко A.M., Лукьянова Л.Д., 2003, 2004а).

Роль редокс-статуса клеток при гипоксии. Продукция активных форм кислорода как механизм формирования адаптивных реакций

Активность Си,7п-супероксиддисмутазы (Си,7п-С0Д) определяли спектрофотометрическим методом по ингибированию реакции восстановления нитротетразолия синего супероксидным анионом (Fried R., 1975). Была использована неферментативная система генерации супероксидного радикала, включающая донор электронов НАДН (0,6 мМ) и переносчик электронов на кислород феназинметасульфат (0,8 мкМ). Детекция супероксидных радикалов осуществлялась с помощью нитротетразолия синего (0,05 мМ), восстановление которого сопровождается образованием ярко окрашенного формазана (560 нм). Реакция проводилась при 30 С в присутствии тканевого супернатанта (0,03 мг белка). За условную единицу активности Си,7п-С0Д принимали количество фермента, необходимое для снижения оптической плотности в ходе восстановления нитротетразолия синего в опытной пробе на 50%. Удельную активность Си,7п-С0Д в условных единицах рассчитывали на 1 мг тканевого супернатанта.

Активность каталазы определяли спектрофотометрическим методом, основанным на образовании стабильного комплекса (пероксомолибдата) при взаимодействии Н2О2 и молибдата аммония ((№Ї4)бМо7024-4Н20) (Goth L., 1991). Активность каталазы оценивали по убыли поглощения комплекса при 350 нм. Реакцию инициировали добавлением супернатанта (0,7 мг белка) в субстратный раствор (10 мМ Н2Ог в 0,1 М калий-фосфатном буфере, содержащем 6,3 мМ ЭДТА; рН 7,4; 37С). Через 5 мин инкубации в реакционную среду добавляли раствор молибдата аммония (0,4 мМ) и проводили измерение поглощения пероксомолибдата (коэффициент молярной экстинкции 22,2-10 М -см"). Расчет выполняли с учетом разницы поглощения пероксомолибдата в опытных пробах без инкубации и после инкубации с супернатантом. Активность каталазы выражали в единицах, равных нмоль НгОг/мг белка за 1 мин.

Для определения компонентов пула глутатиона кору головного мозга быстро извлекали после забоя, отмывали от крови в физ. растворе, удаляли сосудистую оболочку, взвешивали и гомогенизировали в 5% растворе сульфосалициловой кислоты в соотношении 10 мл на 1 г сырого веса ткани (10% гомогенат). Все операции проводились на льду с охлажденными рабочими растворами (+4 С). Сульфосалициловая кислота позволяет депротеинизировать пробы и не влияет на соотношение GSH/GSSG в отличие от метафосфорной, перхлорной и трихлоруксусной кислот. Гомогенат центрифугировали 5 мин при 10000g. Супернатант использовали для количественной оценки компонентов пула глутатитона.

Определение содержания восстановленного глутатиона (GSH) проводили спектрофотометрически, используя 5,5 -дитиобис(2 нитробензойную) кислоту (ДТНБ; реактив Эллмана) как специфичный реагент для обнаружения тиоловых групп GSH при рН 7,0-8,0 (Riddles P.W. et al., 1979; Sedlak J., Lindsay R.H., 1968). В результате взаимодействия образуются: продукт конъюгации глутатиона и ДТНБ (смешанный дисульфид тионитробензоатглутатион) и тионитрофенильный анион (ТНФА), окрашенный в желтый цвет. Количество ТНФА эквимолярно количеству прореагировавшего с ДНБК восстановленного глутатиона. Коэффициент молярной экстинкции ТНФА, поглощающего при 412 нм, равен 13600 М_1-см-1. Реакционная среда (3 мл) содержала 0,2 М натрий-фосфатный буфер (рН 7,4), 6,3 мМ ЭДТА, 0,15 мМ ДТНБ. После добавления пробы (0,2 мл) быстро развивалось желтое окрашивание.

Определение содержания общего глутатиона (G) проводили после восстановления в пробах окисленного глутатиона в присутствии 2,5 ед глутатионредуктазы дрожжей (Sigma-Aldrich, США; G3664) и 0,3 мМ НАДФН. При добавлении ДТНБ (0,15 мМ) развивалось окрашивание. Расчет проводили как описано выше для GSH. Содержание окисленного глутатиона (GSSG) определяли по разности между содержанием общего и восстановленного глутатиона.

Процесс перекисного окисления ненасыщенных липидов инициируется свободными радикалами и развивается через стадии образования первичных (диеновые коньюгаты и липоперекиси) и вторичных продуктов (низкомолекулярные диальдегиды, образующиеся при распаде эндопероксидов полиненасыщенных жирных кислот; продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой - ТБК-РП).

Содержание гидроперекисных метаболитов (Н2О2, гидроперекисей липидов) определяли спектрофотометрическим методом, основанным на реакции окисления пероксидами Fe(II) до Fe(III) с последующим образованием красно-фиолетового ферроксиленолового комплекса с максимумом поглощения при 580 нм (Hermes-Lima М. et al, 1995). Реакционная среда (2,0 мл) содержала: 0,25 мМ сульфата Ре(П)-аммония (соль Мора; Fe(NH4)2(S04)2-6H20), 0,025 М H2SO4, 0,1 мМ ксиленола оранжевого. Реакцию инициировали добавлением 0,1 мл спиртового экстракта коры головного мозга (1 (ткань): 5 (метанол) по массе); супернатант получали центрифугированием при 1000 g / 10 мин / +4иС). Продолжительность развития окраски составляла 12 часов. Уровень гидроперекисей выражали в эквивалентах гидропероксида кумена (оценивали интенсивность окрашивания при добавлении в реакционную среду 5 нмоль (1 эквивалент) гидропероксида кумена) в пересчете на 1 г сырого веса ткани.

Методы определения содержания продуктов перекисного окисления липидов

При снижении содержания кислорода во вдыхаемом воздухе до 14% (ГБГзооо) срочная экспрессия HIF-la уже достоверна (пороговая доза гипоксического воздействия). Экспрессия HIF-la максимальна после одночасового применения ГБГ5000 (10,5% Ог) (оптимальный гипоксический режим). При одночасовом применении более жестких режимов гипоксии (ГБГ7ооо - 8%Ог и ГБГ9ооо - 6% Ог) наблюдается не только отсутствие индукции HIF-la, но прогрессирующее подавление его содержания в КГМ сравнительно с базовым (повреждающие воздействия, провоцирующие нарушение экспрессии HIF-la) (рис. 13).

В миокарде НУ и ВУ крыс динамика экспрессии ядерного HIF-la при воздействии слабой и умеренной гипоксии (ГБГзооо-14%Ог; ГБГ5ооо-Ю,5%02) была в целом сходной с динамикой в КГМ, однако она развивалась после более продолжительного (30 мин) латентного периода (рис. 12 Б). Экспрессия HIF-la в сердце НУ крыс достигала максимальных значений через 45-60 мин гипоксической экспозиции (120-130% при ГБГзооо и 140-150% при ГБГ5ооо)- В сердце ВУ крыс изменения экспрессии HIF-la в условиях слабой и умеренной гипоксии были недостоверны (рис. 12 Б). При тяжелой гипоксии индукция HIF-la наблюдалась уже через 15 мин (130-140%) в миокарде обоих фенотипов крыс (рис. 12 Б). В отличие от КГМ, уровень HIF-la достоверно превышал базовый в течение первых 60 мин экспозиции, что может свидетельствовать о большей устойчивости ткани миокарда к острому дефициту кислорода. Через 4ч тяжелой гипоксии развивалось снижение уровня HIF-la на 50% относительно контроля. Фенотипические отличия отсутствовали. Наконец, в печени НУ и ВУ крыс срочная индукция HIF-la не развивалась на фоне слабого гипоксического воздействия (ГБГ3ооо-14%02) (рис. 12 В). При гипоксии средней тяжести (ГБГ5ооо, 10,5% Ог) срочная экспрессия HIF-la наблюдалась у обоих фенотипов крыс. При тяжелой гипоксии динамика экспрессии HIF-la в печени была сходна с динамикой в КГМ: после кратковременного увеличения экспрессии в первые 30 мин гипоксического воздействия происходило ее уменьшение до уровня ниже базового. При этом фенотипические различия отсутствовали.

Таким образом, срочная гипоксическая экспрессия HIF-la в ответ на однократное гипоксическое воздействие индуцировалась во всех исследуемых тканях, но в ограниченном диапазоне значений Ог во вдыхаемом воздухе, специфичном для каждой ткани. Ее интенсивность и продолжительность, а также длительность скрытого периода до ее проявления, зависели от тяжести воздействия и типа ткани. Наименее выражена была кислородзависимая экспрессия HIF-la в печени. Наибольшая зависимость от концентрации Ог была характерна для КГМ НУ крыс.

Следует также отметить, что срочная экспрессия HIF-la была кратковременной: после достижения максимальных значений через 45-60 мин гипоксического воздействия ее интенсивность, как правило, начинала уменьшаться. Последнее может быть результатом либо подавления синтеза HIF-la, либо активации в этих условиях регуляторных механизмов его деградации.

Полученные результаты позволяют также считать воздействие гипоксии средней тяжести (ГБГ5000, 10,5% Ог) оптимальным для индукции экспрессии HIF-la во всех исследованных тканях.

Динамика содержания HIF-la в тканях в постгипоксическом периоде (после однократного одночасового воздействия разных гипоксических режимов) Являясь кислородзависимым процессом, экспрессия и аккумуляция HIF-la в тканях в постгипоксическом периоде (восстановление нормальной оксигенации после гипоксического воздействия) должны снижаться, что и было показано многими авторами (Вегга Е. et аі., 2001; Fandrey G. et al., 2006; Maxwell P.H. et al, 1999; Semenza G.L., 2009, 2011, 2012). Аналогичные данные были получены нами. Во всех исследованных тканях НУ крыс, в которых развивалась срочная гипоксическая экспрессия HIF-la в ответ на однократное часовое слабое гипоксическое воздействие и умеренной тяжести, сразу по его прекращении и в последующие 2ч реоксигенации (ранний постгипоксический период) наблюдалось снижение уровня HIF-la до базовых значений или даже ниже. Однако вслед за этим начиналось вторичное его увеличение, которое завершалось через сутки (рис. 14). Наблюдаемое в тканях НУ животных увеличение содержания HIF-la в посгипоксическом периоде может быть связано с активацией кислород-независимого синтеза HIF-la (Semenza G.L., 2002, 2003, 2009, 2011, 2012).

После воздействия тяжелой гипоксии вторичное увеличение содержания HIF-la отсутствовало во всех тканях НУ крыс (рис. 14).

В отличие от НУ животных, у ВУ крыс содержание HIF-la в тканях в раннем периоде реоксигенации, также как и через 24 ч после однократного гипоксического воздействия и независимо от его тяжести, не отличалось от базового (рис. 14).

Однократное одночасовое гипоксическое воздействие в выбранных нами режимах не влияло на постгипоксическую экспрессию HIF-la в КГМ НУ и ВУ крыс в более отдаленные временные периоды (в последующие 12 дней) (данные не показаны).

Взаимодействие GPR91 и фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) при однократном воздействии разных режимов гипоксии

Приведенные в данном разделе экспериментальные исследования, посвященные изучению адаптивных изменений при гипоксии и роли HIF-la в этом процессе, позволили впервые показать, что в условиях как нормоксии, так и гипоксии существуют не только тканеспецифические, но и фенотипические различия в базовом содержании HIF-la, наиболее четко выявляющиеся в КГМ НУ и ВУ крыс.

Установлено существование обратной зависимости между базовым содержанием HIF-la в КГМ и толерантностью животных к гипоксии. Показано, что HIF-la аккумулируется в нейронах и их количество в КГМ НУ крыс достоверно больше, чем у ВУ.

Доказано, что срочная гипоксическая экспрессия HIF-la в ответ на однократное гипоксическое воздействие индуцируется во всех исследуемых тканях, но в ограниченном диапазоне значений Ог во вдыхаемом воздухе, специфичном для каждой ткани. Ее интенсивность и продолжительность дозозависимы. Наибольшая зависимость срочной экспрессии HIF-la от концентрации Ог была характерна для нейронов КГМ НУ крыс, из чего следует, что система HIF-la используется при формировании срочных механизмов адаптации преимущественно у одного фенотипа - НУ животных. Высокая исходная толерантность к гипоксии ВУ животных обеспечивается другими механизмами.

При курсовом ежедневном одночасовом применении неповреждающих гипоксических воздействий срочная экспрессия HIF-la индуцируется только в первые несколько дней в тканях НУ животных и коррелирует с повышением толерантности организма к дефициту кислорода. Полученные результаты позволили определить оптимальные гипоксические условия для срочной экспрессии HIF-loc во всех исследованных тканях (ГБГ5ооо, 10,5% Ог, 1ч).

При изучении механизмов, контролирующих срочную гипоксическую экспрессию HIF-loc, впервые показано, что в условиях in vivo эта экспрессия, действительно, сукцинатзависима и контролируется в КГМ, по крайней мере, двумя различными механизмами, связанными с образованием при гипоксии эндогенного сукцината. Первый - митохондрио-зависимый механизм, регулируемый при гипоксии состоянием ферментов субстратного участка митохондриальной дыхательной цепи (репрограммирование работы дыхательной цепи в КГМ: ингибирование активности МФК I, активация МФК II (СДГ), увеличение внутриклеточного уровня сукцината).

Второй механизм связан с функционированием специфического для мозга ГАМК-шунта, активирующегося при гипоксии и сопряженного с образованием сукцината.

Впервые также показано, что в условиях in vivo в нейронах КГМ при неповреждающих режимах гипоксии возможна активация системы срочной индукции экспрессии HIF-loc с участием белка теплового шока HSP90. В КГМ возможность вовлечения такого механизма проявляется с первых минут гипоксического воздействия. Она выражена сильнее у НУ крыс и перестает действовать в постгипоксическом периоде.

Из полученных нами данных следует также, что HSP70 не вовлекается в процесс индукции HIF-loc в КГМ при щадящих режимах гипоксии, но его экспрессия характерна для тяжелой гипоксии, сопровождаемой повреждающими эффектами.

Таким образом, доказано, что при гипоксии в условиях in vivo в нейронах КГМ НУ животных реализуется сложная, многокомпанентная система срочного регулирования стабильности HIF-loc, обеспечивающая оптимальные условия для экспрессии HIF-1 ос-зависимых адаптивных генов.

В противоположность широко распространенному мнению, в работе показано, что положительная корреляция между срочной гипоксической экспрессией HIF-loc и VEGF в условиях применяемых нами режимов гипоксии, подтверждающая возможную роль HIF-loc как индуктора VEGF, наблюдается в очень ограниченном диапазоне концентраций Ог во вдыхаемом воздухе (ГБГ5000, 10,5% Ог) и преимущественно в КГМ.

Дополнительно к описанному в литературе функционально-метаболическому паттерну, характеризующему фенотипические особенности высокоустойчивых и низкоустойчивых к острой гипоксии животных (Лукьянова Л.Д., 1997, 2004), нами получены инновационные данные, свидетельствующие о принципиальных различиях в механизме формирования их толерантности к дефициту кислорода.

Так, для КГМ НУ крыс сравнительно с ВУ характерны: - более выраженное увеличение образования сукцината при гипоксии, коррелирующее с более интенсивной срочной гипоксической экспрессией HIF-loc; - увеличение активности СДГ в условиях гипоксии (при отсутствии изменений этого показателя в КГМ ВУ); - более выраженная зависимость гипоксической экспрессии HIF-loc от активности ГАМК-шунта; - более высокая чувствительность НУ крыс к дефициту ГАМК; - более выраженная положительная корреляция между гипоксической экспрессией HIF-loc и HSP90.

Учитывая роль янтарной кислоты во внутриклеточном метаболизме и сигналинге при гипоксии (см. обзор литературы), понятен интерес к недавно деорфанизированному, но мало изученному рецептору GPR91, лигандом которого является сукцинат (Не W. et al., 2004). В связи с этим в данном разделе рассматриваются вопросы, которые позволят определить место GPR91 в ответной реакции организма на гипоксию.