Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Современное состояние проблемы .13
1.1 Значение кадгеринов в онтогенезе человека 15
1.1.1 Е-кадгерин 15
1.1.2 Р-кадгерин 21
1.1.3 Эпителиальные кадгерины в развитии и функционировании молочной железы .22
1.1.4 Эпителиальные кадгерины в развитии злокачественной опухоли .25
1.2 Экспрессия кадгеринов и эпителиально–мезенхимальный переход 30
ГЛАВА II. Материал и методы исследования .33
2.1 Материал исследования 33
2.2 Методы исследования
2.2.1 Гистологический метод 49
2.2.2 Иммуногистохимический метод 54
2.2.3 Статистический метод 67
ГЛАВА III. Экспрессия эпителиальных кадгеринов и ассоциированных молекул в клетках рака молочной железы
3.1. Изучение эпителиальных кадгеринов и ассоциированных молекул в интактной ткани молочной железы .68
3.2 Изучение эпителиальных кадгеринов и ассоциированных молекул при инвазивном дольковом раке молочной железы 73
3.2.1 Изучение экспрессии Е-кадгерина и ассоциированных молекул .73
3.2.2. Изучение экспрессии Р-кадгерина и ассоциированных молекул .81
3.2.3 Исследование экспрессии маркера эпителиально-мезенхимального перехода виментина на клетках опухоли .84
3.2.4 Характеристика групп инвазивного долькового рака молочной железы с аберрантной экспрессией эпителиальных кадгеринов и ассоциированных молекул 88
3.3 Изучение эпителиальных кадгеринов и ассоциированных молекул при разных иммуногистохимических подтипах инвазивного рака молочной железы .95
3.3.1 Характеристика экспрессии эпителиальных кадгеринов, катенинов и
виментина при люминальном А подтипе инвазивного рака молочной железы .95
3.3.2 Характеристика экспрессии эпителиальных кадгеринов, катенинов и виментина при люминальном В (HER-2 негативный) подтипе инвазивного рака молочной железы 99
3.3.3 Характеристика экспрессии эпителиальных кадгеринов, катенинов и виментина при люминальном В (HER-2 позитивный) подтипе инвазивного рака молочной железы 102
3.3.4 Характеристика экспрессии эпителиальных кадгеринов, катенинов и виментина при Erb-B2 сверхэкспрессирующем подтипе инвазивного рака молочной железы .104
3.3.5 Характеристика экспрессии эпителиальных кадгеринов, катенинов и виментина при базальноподобном подтипе инвазивного рака молочной железы .106
3.4 Изучение эпителиальных кадгеринов и ассоциированных молекул в группах с разной стадией регионального метастазирования 109
3.4.1 Характеристика экспрессии эпителиальных кадгеринов, катенинов и виментина при инвазивном дольковом раке молочной железы со стадией регионарного метастазирования N0 (TNM) 110
3.4.2 Характеристика экспрессии эпителиальных кадгеринов, катенинов и виментина при инвазивном дольковом раке молочной железы со стадией регионарного метастазирования N1 (TNM) 112
3.4.3 Характеристика экспрессии эпителиальных кадгеринов, катенинов и виментина при инвазивном дольковом раке молочной железы со стадией
регионарного метастазирования N2 (TNM) 113
Заключение 117
Выводы .132
Список сокращений и аббревиатур 133
Список литературы 134
- Эпителиальные кадгерины в развитии и функционировании молочной железы
- Иммуногистохимический метод
- Исследование экспрессии маркера эпителиально-мезенхимального перехода виментина на клетках опухоли
- Характеристика экспрессии эпителиальных кадгеринов, катенинов и виментина при инвазивном дольковом раке молочной железы со стадией регионарного метастазирования N1 (TNM)
Введение к работе
Е- и Р-кадгерины являются молекулами клеточной адгезии, которые локализуются на поверхности эпителиальных клеток и участвуют в образовании адгезионных контактов. Адгезия, опосредованная эпителиальными кадгеринами является динамическим процессом, который регулируется сигнальными механизмами (Skaper S.D., et al, 2001; Halbleib J.M., Nelson W.J., 2006).
Эпителиальные кадгерины играют важную роль в формировании тканей во время гаструляции, нейруляции, гисто- и органогенеза. Кроме того, они необходимы для нормального функционирования органов, выстланных эпителием. Е-кадгерин играет роль в нормальной дифференцировке и поддержании структуры эпителия. Запускаемый при участии Е-кадгерина сигнальный механизм с участием -катенина считается необходимым для формирования почек молочной железы, расширения протоков и альвеологенеза, а также для поддержания структуры нормальной зрелой молочной железы. Трансмембранный Р-кадгерин, экспрессируемый в миоэпителии, имеет значение в регуляции пролиферации эпителиальных клеток молочной железы (Hatsell S. et al, 2003; Knudsen K.A., Wheelock M.J., 2005; Albergaria A., et al, 2011).
Подавление экспрессии Е-кадгерина приводит не только к снижению прочности
межклеточной гомофильной адгезии, способствующей увеличению клеточной подвижности,
но и к дезинтеграции Е-кадгерин-катенинового комплекса, в результате которой происходит
высвобождение сигнальных молекул, таких как -, р120-катенины из комплекса и запуск
ряда сигнальных путей, главным образом, канонического сигнального пути Wnt и
сигнального пути с участием RhO ГТФаз. Активация первого сигнального пути обнаружена
при развитии злокачественной опухоли и способствует инвазии опухолевых клеток в
соединительную ткань, а также последующую их миграцию, в то время как активация
второго сигнального пути обеспечивает подвижность клеток (Blavier L., et al, 2006; Katoh M.,
2005; Labelle M., et al, 2008; Perou C.M., et al, 2000). Гиперэкспрессия Р-кадгерина также
приводит к дестабилизации нормального комплекса Р-кадгерин/-катенин и
цитоплазматической экспрессии р120-катенина, что способствует его накоплению в цитоплазме и стимулирует активацию RhoГТФаз, Rac1, Cdc42, обеспечивая клеткам подвижность и способность к миграции (Paredes J., et al, 2007; Paredes J., et al, 2012; Albergaria A., et al, 2011).
Считается, что эпителиальные кадгерины играют существенную роль в патологии, в том числе при развитии рака молочной железы (Делектроская В.В. и соавт., 2005; Kotb A.M., et al, 2011; Rezaei M., et al, 2012; Weigelt B., et al, 2005).
В структуре онкологической заболеваемости рак молочной железы (РМЖ) занимает I место среди женщин экономически развитых стран (Франк Г.А., 2013). Особое значение в прогнозировании выживаемости при РМЖ уделяется раннему выявлению метастазов, которые считаются главной причиной смерти пациенток с данной патологией (Weigelt B., et al, 2005). Метастазирование является многоступенчатым процессом, включающим отделение опухолевых клеток от первичной опухоли, инвазию во внеклеточный матрикс, интравазацию в кровяное русло, распространение с кровотоком, экстравазацию в органы-мишени и формирование метастатических очагов (Makrilla N., et al, 2009; Li D.-M., Feng Y.-M., 2011). Для осуществления этапов инвазии и интравазации опухолевым клеткам необходимо изменить свой гистогенетический тип с эпителиального на мезенхимальный. При этом запускается механизм, известный как эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), осуществляемый и во время нормального эмбрионального развития на этапе формирования мезодермы. Первым этапом ЭМП является снижение экспрессии молекул – маркеров эпителиальных тканей, таких как Е-кадгерин и увеличение экспрессии мезенхимальных маркеров, таких как виментин (Yang J., Weinberg R.A., 2008; Thiery J.P., 2009; Breier G., et al, 2014). При развитии злокачественной опухоли отмечается трансмембранная экспрессия Р-кадгерина, которая в норме присутствует только на мембране миоэпителиальных клеток протоков молочной железы. Считается, что Р-кадгерин участвует в активации ЭМП (Albergaria A., et al, 2011; Baek S., et al, 2010).
Выявление взаимосвязи аберрантной экспрессии эпителиальных Е- и Р-кадгеринов, а также катенинов, необходимой для запуска ряда патологических сигнальных путей, а также виментина, экспрессия которого является следствием активации этих путей является важным аспектом в понимании механизмов, приводящим к развитию и жизнедеятельности злокачественной опухоли (Cowin P., et al, 2005). Не менее важной задачей является выявление регуляторных механизмов, активированных эпителиальными кадгеринами и образуемыми ими кадгерин-катениновыми комплексами, влияющих на опухолевый рост.
Полученные данные по экспрессии эпителиальных кадгеринов и связанных с ними молекул часто отличаются и интерпретируются по-разному. С одной стороны, это может быть связано с отсутствием единой системы оценки данных показателей (Brzozowska A. et al, 2011; Popescu C.I., et al, 2013), с другой, с гетерогенностью рака молочной железы, подтипы которого отличаются по рецепторному статусу, имеют разные биологические свойства и клиническое течение. В связи с этим, считается целесообразным изучать экспрессию вышеуказанных показателей в разных иммуногистохимических группах рака молочной
железы, учитывающих особенности конкретных подтипов (Семиглазов В.Ф. и соавт., 2013; Сазонов С.В.,2014).
В связи с выше изложенным, изучение роли эпителиальных Е- и Р-кадгеринов в регуляции внутриклеточных механизмов развития злокачественной опухоли с разным рецепторным статусом, а также ее метастазирования, является актуальной научной задачей.
Цель исследования
Оценить роль молекул клеточной адгезии Е-, P-кадгеринов, а также кадгерин-
катениновых комплексов в реализации внутриклеточных механизмов развития
злокачественной опухоли.
Задачи исследования
-
Изучить особенности экспрессии эпителиальных кадгеринов и ассоциированных с ними - и р120-катенинов в эпителиальной и миоэпителиальной тканях протоков молочной железы.
-
Оценить изменение экспрессии эпителиальных Е- и Р-кадгеринов, а также ассоциированых с ними молекул - и р120-катенинов в активации внутриклеточных механизмов изменения клеточного фенотипа при развитии разных иммуногистохимических подтипов инвазивного долькового рака молочной железы.
-
Определить признаки реализации эпителиально-мезенхимального перехода при развитии инвазивного долькового рака молочной железы.
-
Выявить особенности экспрессии эпителиальных кадгеринов, ассоциированных с ними - и р120-катенинов, а также виментина при метастазировании инвазивного долькового рака молочной железы разных иммуногистохимических подтипов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Эпителиальные Е- и Р-кадгерины играют важную роль в поддержании межклеточной адгезии эпителиальной и миоэпителиальной тканей, а также участвуют в реализации каскада сигнальных путей, необходимых для нормального функционирования эпителия и развития злокачественной опухоли.
-
При развитии эпителиальной опухоли отмечается коэкспрессия Е- и Р-кадгеринов, высвобождение -, р120-катенинов из кадгерин-катениновых комплексов, запуск сигнального пути Wnt, приводящего к увеличению пролиферации и инвазии клеток опухоли, а также сигнального пути с участием RhoГТФаз, приводящего к увеличению подвижности и миграции опухолевых клеток.
-
В результате внутриклеточных механизмов, активированных Е- и Р-кадгеринами, запускается эпителиально-мезенхимальный переход, который сопровождается
экспрессией виментина в цитоплазме опухолевых клеток и способствует увеличению их подвижности. 4. Высвобождение - и р120-катенинов запускает процесс метастазирования, при формировании региональных метастазов экспрессия указанных молекул снижается. При увеличении подвижности опухолевых клеток, активации их миграции, инвазии и формировании региональных метастазов в клетках опухоли увеличивается экспрессия Р-кадгерина и виментина.
Научная новизна исследования
Впервые проведено комплексное исследование эпителиальных кадгеринов и ассоциированных с ними молекул, участвующих в канцерогенезе, при разном рецепторном статусе клеток опухоли на модели разных иммуногистохимических подтипов инвазивного долькового рака молочной железы.
Выявлено значение экспрессии Е- и P-кадгеринов, а также формируемых ими кадгерин-катениновых комплексов в регуляции опухолевого роста при инвазивном дольковом раке молочной железы.
Обнаружены признаки изменения фенотипа клеток опухоли и реализации эпителиально-мезенхимального перехода, реализуемого при развитии опухоли.
Показано, что при развитии опухоли наблюдается появление коэкспрессии Е- и Р-кадгеринов, высвобождение молекул - и р120-катенинов из кадгерин-катениновых комплексов, что приводит к активации внутриклеточных механизмов регуляции процессов развития метастазирования, проявляющихся в эапуске эпителиально-мезенхимального перехода, активация которого сопровождается появлением экспрессии виментина в цитоплазме опухолевых клеток.
Научно - практическая значимость работы
Результаты исследований могут быть использованы для понимания ряда
внутриклеточных механизмов регуляции развития опухолевого роста.
Полученные данные позволяют выявить прогностически значимые параметры экспрессии эпителиальных кадгеринов, - и р120-катенинов, а также виментина, характерные для метастазирования злокачественной опухоли.
Включение в панель иммуногистохимического исследования определения экспрессии Е-,
Р-кадгеринов, - и р120-катенинов, а также виментина позволит выявлять
предрасположенность опухоли к метастазированию на ранних стадиях развития злокачественной опухоли.
Апробация работы
Научная работа апробирована на заседаниях кафедры патологический физиологии, а также гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Екатеринбург, 2013, 2014, 2015); VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Екатеринбург, 2013), XXV Европейском конгрессе патологов (Лиссабон, Португалия, 2013), Европейском онкологическом конгрессе (Амстердам, Нидерланды, 2013), Международной научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2014), XXIII Конгрессе Европейской ассоциации исследования рака (Мюнхен, Германия, 2014), XVIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2014), Всероссийском научном форуме «Учение о тканях. Гистогенез и регенерация» (Санкт-Петербург, 2015), Петербургском онкологическом форуме «Белые ночи» (Санкт-Петербург, 2015).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 26 научных работ, в том числе 13 в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов докторских и кандидатских диссертаций.
Внедрение в практику
Результаты диссертационной работы используются при научных исследованиях в лаборатории патоморфологии ГАУЗ СО Институт медицинских клеточных технологий, г. Екатеринбург, в учебном процессе кафедры патологической физиологии, а также кафедры онкологии и медицинской радиологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Екатеринбург), кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО ЮУФГМУ Минздрава России (г. Челябинск), патоморфологической и цитологической лабораторий ГБУЗСО «Свердловский областной онкологический диспансер» (г. Екатеринбург). Получены патент на промышленный образец № 91079 от 16.12.2014 г., приоритетная справка на промышленный образец № 215500282 от 02.02.2015 г.
Структура и объем диссертации
Эпителиальные кадгерины в развитии и функционировании молочной железы
Е-кадгерин – одна из наиболее значимых молекул клеточной адгезии в эпителиальных тканях. Он кодируется геном CDH1, расположенным на хромосоме 16q22.1 (Paredes J., et al, 2012; Sethi S., 2011). Е-кадгерин был впервые обнаружен у куриц и был назван L-CAM. Мышиная копия этого белка, увоморулин, на 80 % схожа по нуклеотидной и аминокислотной последовательности с человеческой копией (Pecina-Slaus N., et al, 2003).
Е-кадгерин локализуется на поверхности эпителиальных клеток, участвуя в
образовании адгезионных контактов, являющихся характерной особенностью эпителиальных тканей, но также встречающихся и в неэпителиальных тканях в виде мелких точечных или полосчатых соединений, а также адгезивных поясков, расположенных в апикальной части клетки, т.н. зона прилипания (Жункейра Л.К., Карнейро Ж., 2009; Франк Г.А. и соавт., 2005; Brzozowska A., et al, 2012; Niessen C.M., Gottardi C.J., 2008). Е-кадгерин является полипептидом, состоящим из 728 аминокислотных остатков, включающим трансмембранный домен, цитоплазматический домен и эктодомен. Последний состоит из 5 повторяющихся доменов, четыре из которых имеют одинаковую структуру и называются внеклеточные кадгериновые повторы (EC1-EC4), в то время как пятый (EC5) имеет особую структуру, характеризующуюся наличием четырех цистеинов, и называется мембранный проксимальный внеклеточный домен. Нарушение дисульфидных связей в этом домене влияет на формирование прочных межклеточных контактов (Niessen C.M., Gottardi C.J., 2008; Roy F., Berx G., 2008).
Важным компонентом Е-кадгерина является его цитоплазматический домен, состоящий из двух субдоменов: мембранного проксимального цитоплазматического домена, или, как его часто называют, юкстамембранного домена (ЮМД), и -катенин-связанного домена (БСД), каждый из которых имеет участок с аминокислотной последовательностью около 30-35 остатков, называющийся CH2 и CH3 соответственно (CH - кадгериновый гомологичный участок). Е-кадгерин через -катенин-связанный домен соединен с цитоскелетом посредством -, -, - и p120-катенинов, формируя комплекс Е-кадгерин/-катенин/-катенин/актин, участвующий в запуске каскада сигнальных путей в клетке (Roy F., Berx G., 2008; Weigelt B., et al, 2005)(рис.2). Формирование данного комплекса не только стабилизирует клеточную адгезию, но также активно стимулирует запуск ряда сигнальных путей, включающих сигнальный путь Wnt (название произошло от комбинации Wg (от англ. wingless - бескрылый) и Int - ген позвоночных, гомологичный гену wingless дрозофилы), сигнальные пути PI3K (фосфатидилиноситол 3-киназа) и RhoГТФазы (Rijsewijk F., et al, 1987; Clevers H., 2006; Makrilla N., et al, 2009; Pecina-Slaus N., 2003).
Вместе с другими классическими кадгеринами (главным образом, N-кадгерином), Е-кадгерин играет важную роль в формировании тканей во время гаструляции, нейруляции, гисто- и органогенеза (Halbleib J.M., Nelson W.J., et al, 2006; Kotb A.M., et al, 2011; Pecina-Slaus N., 2013; Vestweber D., 2008). Е-кадгерин начинает экспрессироваться в раннем эмбриогенезе на стадии двух бластомеров.
Эпителиальная дифференциация появляется в раннем онтогенезе на стадии морулы, когда каждый бластомер поляризуется, что сопровождается формированием эпителиальноподобного фенотипа. Е-кадгерин играет важную роль в адгезии бластомеров и ранней способности эмбриона к компактности. Е-кадгерин начинает экспрессироваться на мембране еще до того, как морула становится компактной, не выполняя при этом адгезивной функции. Механизм, который заставляет Е-кадгерин функционировать, до конца не ясен, но известно, что он связан с фосфорилированием протеина (Pecina-Slaus N., 2003).
Контролируемый ЭМП – наиболее важное событие, в котором принимает участие Е-кадгерин во время эмбрионального развития. Этот процесс был впервые описан E.Hay в 1980 году как центральный механизм раннего эмбрионального морфогенеза (Глушанкова Н.А. и соавт., 2014; Hay E.D., 1980; Priya R., et al, 2013; Reynolds A.B., Roczniak-Ferguson A., 2004). Потеря эпителиальной адгезии и полярности происходит во время формирования мезодермы и обеспечивает клеткам морфологию и свойства мезенхимальных клеток (De Vries W.N., et al, 2004; Liu T., et al, 2012; Rezaei M., et al, 2012; Zeisberg M., Neilson E.G., 2009). Первым этапом ЭМП является снижение экспрессии эпителиальных маркеров, таких как Е-кадгерин за счет подавления транскрипции, и увеличение экспрессии мезенхимальных маркеров, таких как виментин (Reuter C.W., et al, 2000; Saadatmand E.M., et al, 2013; Yang J., Weinberg R.A., 2008).
В тканях взрослого организма Е-кадгерин участвует в формировании эпителиального пласта. Две молекулы Е-кадгерина прилегающих друг к другу клеток соединяются друг с другом посредством внеклеточного домена, функционирующего только в присутствие ионов Ca2+, и образуют адгезионные контакты между двумя эпителиальными клетками (Жункейра Л.К., Карнейро Ж., 2009; Baranwal S., Alahari S.K., 2009; Chan A.O. ,2006; Makrilla N., et al, 2009). Роль Е-кадгерина в реализации сигнальных путей
Проведенные исследования на мышах показали, что роль Е-кадгерина и катенинов заключается не только в поддержании межклеточной адгезии, но и в обеспечении клеточной пролиферации и дифференцировки. Несмотря на то, что Е-кадгерин, главным образом, вовлечен в процесс поддержания эпидермальной целостности и защиты от апоптоза, связанные с ним катенины играют двоякую роль, участвуя в формировании межклеточных контактов, с одной стороны, и выступая как регуляторы клеточных сигнальных путей, с другой (Пальцев М.А., Иванов А.А., 2007; Stepniak E., et al, 2009; Timm A., Grosschedl R., 2005).
Адгезия, опосредованная Е-кадгерином является динамическим процессом, который регулируется несколькими сигнальными путями (Александрова А.Ю., 2014; Priya R., et al, 2013; Singhai R., et al, 2011). Подавление экспрессии Е-кадгерина, характерное для эмбриогенеза и развития эпителиальных опухолей, приводит не только к снижению прочности межклеточной гомофильной адгезии, способствующей увеличению клеточной подвижности, но и к дезинтеграции Е-кадгерин-катенинового комплекса, результатом которой служит высвобождение сигнальных молекул, таких как -, р120-катенины из комплекса и запуск ряда сигнальных путей (Шагиева Г.С. и соавт., 2012; Gruver A.M., et al, 2011; Schmidmaier R., Baumann P., 2008; Singhai R., et al, 2011).
Одним из главных сигнальных механизмов с участием Е-кадгерина и катенина является канонический сигнальный путь Wnt. При его активации белок Wnt связывается с рецептором рецептором Фрайззлед (Frizzled), что приводит к транскрипции генов, которые регулируют клеточный рост и дифференцировку. В основе данного сигнального пути лежит стабилизация цитозольной формы катенина. В норме Е-кадгерин связан с -катенином и образует прочный Е кадгерин/-катениновый комплекс. При отсутствии экспрессии Е-кадгерина свободная цитозольная форма -катенина связывается с аксином, фосфорилируется гликогенсинтазакиназой 3 (GSK-3) сигнального комплекса APC/аксин/казеинкиназа I и впоследствии утилизируется при помощи убиквитин-18 протеосом. Активированный сигнальный путь Wnt блокирует активность GSK-3, что приводит к транслокации -катенина в ядро, его связыванию с семейством транскрипционных факторов TCF/LEF (Т-клеточный фактор/ лимфоидный энхансерный фактор) и активации экспрессии таргетных генов, таких как c-myc, циклин D1/D2, фибронектин, MMP7 (матриксная металлопротеиназа 7), CD44 и других TCF/LEF-чувствительных генов, ответственных за пролиферацию клеток (рис.3). Активация канонического сигнального пути характерна при развитии злокачественной опухоли, способствуя инвазии опухолевых клеток в соединительную ткань и последующей их миграции (Самоделкин Е.И., Ветелина В.В., 2014; Clevers H., 2006; Wheelock M.J., Johnson K.R., 2003; Goldstein B., et al, 2006; Kikuchi A., et al, 2006).
Иммуногистохимический метод
Иммуногистохимические исследования проводились с использованием автоматических систем окрашивания Ventana и DAKO (табл.4). Для определения экспрессии Е-кадгерина использовались кроличьи моноклональные античеловеческие антитела Е-cadherin (Clone EP700Y, Cell Marque, США), -катенина - мышиные моноклональные античеловеческие антитела -catenin (Clone 14, Ventana, США), р120 катенина - мышиные моноклональные античеловеческие антитела p120 catenin (Clone 98, Ventana, США), P-кадгерина – мышиные моноклональные античеловеческие антитела P-cadherin (Clone 56С1, Monosan, Нидерланды), виментина - мышиные моноклональные анти-свиные антитела Vimentin (Clone V9, DAKO, Дания). Определение экспрессии HER-2/neu на клетках опухоли осуществлялось с помощью кроличьих моноклональных антител с-erb-2/HER-2 (Clone 4B5, Ventana, США). Для определения ядерного индекса пролиферации опухоли использовались кроличьи моноклональные античеловеческие антитела KI-67 Antigen (Clone SP6, Spring Bioscience, США), рецепторов эстрогена и прогестерона на ядрах клеток опухоли с помощью кроличьих моноклональных античеловеческих антител Estrogen Receptor (Clone SP1, Spring Bioscience, США), Progesterone Receptor (Clone SP2, Spring Bioscience, США). Для определения экспрессии цитокератинов опухолевыми клетками использовались мышиные моноклональные антитела Cytokeratin Cocktail AE1& AE3 (DSC, Германия) и кроличьи моноклональные антитела Cytokeratin 5 (Clone EP1601Y, Cell Marque, Нидерланды).
Предварительная демаскировка антигенов для антител к Е-кадгерину, -катенина, р120-катенина и HER2/neu проводилась в автостейнере Ventana BenchMark GX с использованием Ultra Cell Conditioning Solution (ULTRA CC1)(Ventana, США). Для остальных антител предварительная демаскировка производилась в PT Link с использованием EnVision Flex Target Retrieval Solution Low pH (DAKO, Дания). Таблица 4 Характеристика использованных антител для иммуногистохимического исследования
Автоматический иммуностейнерVentana BenchMark GX (Ventana Medical Systems, США) Автоматический иммуностейнерDAKOAUTOSTAINERUniversal staining system (DAKO,Дания) Антитела Е-cadherin (Clone EP700Y, CellMarque)-catenin (Clone 14, Ventana)p120 catenin (Clone 98, Ventana)HER2/neu (Clone 4B5, Ventana) P-cadherin (Clone 56С1, Monosan)Vimentin (Clone V9, DAKO)Estrogen receptor (Clone SP1, SpringBioscience)Progesterone receptor (Clone SP2,Spring Bioscience)Ki-67 (Clone SP6, Spring Bioscience)Cytokeratin Cocktail AE1& AE3 (DSC)Cytokeratin 5 (Clone EP1601Y, CellMarque) Система визуализации ultraView Universal DAB Detection Kit (Ventana) Dako EnVision + Dual Link System -HRP, хромоген Dako Liquid DAB+ Substrate Chromogen System (DAKO) Предварительная обработка Ventana BenchMark GX (Ventana) Ultra Cell Conditioning Solution (ULTRA CC1, Ventana) PT Link (DAKO)EnVision Flex Target Retrieval SolutionHigh pH (DAKO)EnVision Flex Target Retrieval SolutionLow pH (DAKO) Для иммуногистохимических реакций, осуществляемых в автостейнере Ventana BenchMark GX использовались сопутствующие растворы и система визуализации ultraView Universal DAB Detection Kit (Ventana). Для иммуногистохимических реакций, осуществляемых в автостейнере DAKO AUTOSTAINER Universal staining system использовались буфер Dako Wash Buffer, система визуализации Dako EnVision + Dual Link System - HRP, хромоген Dako Liquid DAB+ Substrate Chromogen System (DAKO, Дания).
Для проведения иммуногистохимических исследований использовались положительно заряженные стекла SUPERFROST PLUS (Thermo scientific, Германия). Оценку реакции осуществляли на микроскопе “Zeiss Imager M” (Германия).
Оценка иммуногистохимического окрашивания осуществлялась полуколичественным методом. Экспрессия E-кадгерина оценивалась как положительная при окрашивании 70% мембран исследуемых клеток (Kowalski P.J., et al, 2003) - рис.26,27. Наличие экспрессии Р-кадгерина определялось при мембранном окрашивании 10% опухолевых клеток (Vieira A.F., et al, 2012; Faria G., et al, 2012; Paredes J., et al, 2005; Paredes J. et al, 2002) - рис.28,29. Экспрессия мезенхимального маркера виментина расценивалась как положительная - при позитивном цитоплазматическом окрашивании 1% опухолевых клеток (Korsching E., et al, 2005; Rezaei M. et al, 2012) - рис.34,35. Ядерная транслокация -катенина оценивалась по окрашиванию ядер опухолевых клеток, в то время как цитоплазматическая экспрессия – по окрашиванию цитоплазм клеток опухоли. Ядерная экспрессия -катенина считалась положительной при окрашивании хотя бы одной опухолевой клетки в поле зрения (Ng T.L., et al, 2005), цитоплазматическая – при окрашивании 10% клеток опухоли (Ikeda S., et al, 2006) - рис.30,31. Мембранное окрашивание -катенина не учитывалось. Цитоплазматическая транслокация р120-катенина определялась по окрашиванию цитоплазм опухолевых клеток, при этом мембранное окрашивание р120-катенина не учитывалось. Экспрессия р120-катенина считалась положительной при цитоплазматическом окрашивании 10% опухолевых клеток (Liu Y., et al, 2009; Sarrio D., et al, 2004) - рис.32,33. Уровень ядерной экспрессии ER и PR на клетках карциномы оценивали по шкале от 0 до 8 (Allred D.S., et al, 1998; Hammond M.E., et al, 2010). Оценка уровней мембранной экспрессии HER-2/neu опухолевыми клетками производилась по шкале от 0 до 3+ (Bilous M., et al, 2003; Wolff A.C., et al, 2007). Уровень маркера пролиферации клеток опухоли Ki-67 определяли по процентному отношению числа окрашенных ядер опухолевых клеток ко всем клеткам рака молочной железы (%). В каждом случае просчитывали не менее 600 опухолевых клеток (Ивина А.А. и соавт., 2014; Jalava P., Kuopio T., 2006). Экспрессия цитокератинов опухолевыми клетками оценивалась как положительная при мембранном окрашивании клеток опухоли (Clarke C.L., et al, 2004).
Исследование экспрессии маркера эпителиально-мезенхимального перехода виментина на клетках опухоли
Мы провели анализ взаимосвязи между экспрессией эпителиальных кадгеринов, -катенина, виментина, рецепторным статусом и степенью развития опухоли в группе с аберрантной экспрессией р120-катенина. Результаты исследования представлены в таблице 14.
При анализе полученных данных, была выявлена положительная корреляция умеренной силы между экспрессией Е и Р-кадгеринов (V=0,47, p 0,05). Таблица 14 Взаимосвязь между эпителиальными кадгеринами, -катенином, виментином, рецепторным статусом и стадией развития инвазивного долькового рака молочной железы в группе с аберрантной экспрессией 120 катенина Нами была исследована группа случаев с экспрессией виментина в цитоплазме опухолевых клеток при инвазивном дольковом раке молочной железы, в которую вошло 174 соответствующих случая.
Из всех вошедших в группу случаев, 42 (24%) случая относились к подтипу Люминальный А, 28 (16%) случаев – к подтипу Люминальный В (HER-2 негативный), 22 (13%) случая – к подтипу Люминальный В (HER-2 позитивный), 34 (19%) случая – к подтипу Erb-B2 сверхэкспрессирующий и 48 (28%) случаев – к подтипу Базальноподобный (рис.50).
Мы проанализировали взаимосвязь между экспрессией эпителиальных кадгеринов и ассоциированных с ними катенинов, рецепторным статусом и степенью развития опухоли в группе с аберрантной экспрессиейвиментина. Результаты исследования представлены в таблице
При анализе полученных данных, была выявлена положительная корреляционная связь умеренной силы между экспрессией Е- и Р-кадгерина (V=0,49, p 0,05), а также между экспрессией -катенина и р120-катенина (V=0,40, p 0,05). Также обнаружено, что наличие экспрессии р120-катенина связана со степенью развития регионарных метастазов умеренной отрицательной корреляционной связью (V=-0,40, p 0,05). Таблица 15
Взаимосвязь между эпителиальными кадгеринами, катенинами, рецепторным статусом и стадией развития инвазивного долькового рака молочной железы в группе с аберрантной экспрессией виментина
Изучение эпителиальных кадгеринов и ассоциированных молекул при разных иммуногистохимических подтипах инвазивного рака молочной железы
В связи с гетерогенностью инвазивного долькового рака молочной железы (Семиглазов В.Ф. и соавт., 2013) и выявлением достоверных различий в экспрессии Е-кадгерина, Р-кадгерина и связанных с ними молекул -катенина, р120-катенина, а также виментина в разных группах исследования, нами проведен анализ экспрессии изучаемых молекул в разных иммуногистохимических подтипах рака молочной железы.
Характеристика экспрессии эпителиальных кадгеринов, катенинов и виментина при люминальном А подтипе инвазивного рака молочной железы
Исследованы 50 случаев инвазивного долькового рака молочной железы, относящихся к Люминальному А подтипу по иммуногистохимической классификации: ER, PR положительные, HER-2/neu отсутствует, Ki-67 низкий, 20% (Hammond M.E., et al, 2010; Wolff A.C., et al, 2007). Из всех отобранных случаев, 14 (28%) относились к 1 стадии, 32 (64%) случаев – ко 2 стадии, 4 (8%) случая – к третьей стадии по классификации TNM (рис.51). В 27% (14 случаев) определялись метастазы в регионарные лимфатические узлы. Из всех таких случаев, 12 (83%) – относились к стадии N1, 2 (17%) – к стадии N2.
Распределение случаев инвазивного долькового рака молочной железы подтипа Люминальный А по стадиям опухолевого процесса (TNM)
По данной классификации, Т0 – первичной опухоли нет, Т1 – опухоль 2 см в наибольшем измерении, Т2 – опухоль 2,1-5 см, Т3 – опухоль 5 см, Т4 – опухоль любых размеров с прорастанием грудной стенки или кожи; N0 – метастазов в лимфоузлы при гистологическом исследовании не выявлено, N1 – метастазы в 1-3 подмышечных лимфоузла, микрометастазы в окологрудинные лимфоузлы, N2 – метастазы в 4-9 подмышечных лимфоузлов или метастазы в окологрудинные лимфоузлы, обнаруженные клинически, N3 – метастазы в 10 и более подмышечных лимфоузлов, сочетание метастазов в подмышечные и окологрудинные лимфоузлы, метастазы в над- и подключичные лимфоузлы (Касчиато Д., 2008).
Нами изучена экспрессия Е-кадгерина и ассоциированной с ним молекулы -катенина. Наличие экспрессии Е-кадгерина было выявлено в 48 (96%) случаях. Появление цитоплазматического окрашивания -катенина, являющегося следствием разрушения комплекса Е-кадгерин--катенин, отмечалось в 32 (64%) случаях (рис.47). При анализе полученных данных, выявлена слабая положительная корреляционная связь между экспрессией Е-кадгерина и стадией опухолевого процесса (V=0,31, p 0,05). Снижение экспрессии Е-кадгерина отмечалось на более ранних стадиях опухолевого процесса.
При исследовании Р-кадгерина и ассоциированной с ним молекулы р120-катенина было выявлено появление экспрессии Р-кадгерина в 46 (92%) случаях, аберрантное цитоплазматическое окрашивание р120-катенина в 42 (84%) случаях (рис.52).
Коэкспрессия Е- и P-кадгеринов отмечалась в 46 (92%) исследованных случаев. Получена сильная положительная корреляционная связь между экспрессией Р-кадгерина и Е-кадгерина, (V=0,69, p 0,05), а также положительная корреляционная связь средней силы между экспрессией Р-кадгерина и -катенина (V=0,39, p 0,05). При Люминальном А подтипе инвазивного долькового рака молочной железы экспрессия Р-кадгерина напрямую связана с экспрессией Е-кадгерина и -катенина. Кроме того, положительная корреляционная связь средней силы выявлена между цитоплазматической экспрессией -катенина и р120-катенина, V=0,58 (p 0,05), что говорит о прямой взаимосвязи экспрессии указанных молекул.
Как видно из таблицы, уровень пролиферации, определяемый по индексу пролиферации Ki-67, сопряжен с наличием экспрессии Е-кадгерина прямой корреляционной связью умеренной силы (V=0,46), а также с экспрессией р120-катенина обратной корреляционной связью умеренной силы (V=-0,36). В Люминальный А подтип включаются опухоли с низким ( 20%) уровнем Ki-67. Среднее значение Ki-67 в исследуемой группе определялось как 9,44±3,81%. Таким образом, экспрессия Е-кадгерина и р120-катенина связана с низким уровнем пролиферации опухоли, причем, чем выше индекс пролиферации Ki-67, тем чаще присутствует Е-кадгерин и отсутствует р120-катенин на опухолевых клетках инвазивного долькового рака молочной железы подтипа Люминальный А.
Характеристика экспрессии эпителиальных кадгеринов, катенинов и виментина при Люминальном В (HER-2 негативный) подтипе инвазивного рака молочной железы Исследованы 50 случаев инвазивного долькового рака молочной железы, относящихся к Люминальному В (HER-2 негативный) подтипу по иммуногистохимической классификации: ER, PR присутствуют, опухоль HER-2 – негативная, Ki-67 высокий, 20% (Hammond M.E., et al, 2010; Wolff A.C., et al, 2007).
Из всех отобранных случаев, 23 (46%) относились к 1 стадии, 19 (38%) случаев – ко 2 стадии, 8 (16%) случаев – к третьей стадии по классификации TNM (рис.53). В 19 (38%) случаях выявлены метастазы в регионарные лимфатические узлы. Из них, 8 (40%) случаев относились к стадии N1, 11 (60%) – к стадии N2.
Характеристика экспрессии эпителиальных кадгеринов, катенинов и виментина при инвазивном дольковом раке молочной железы со стадией регионарного метастазирования N1 (TNM)
При изучении иммуногистохимических подтипов инвазивного долькового рака молочной железы выявлена прямая взаимосвязь между всеми изучаемыми параметрами: экспрессией Е- , Р-кадгеринов, - и р120 катенинов в группах случаев Люминального А и Erb-B2 сверхэкспрессирующего подтипов, прямая взаимосвязь между экспрессией Р-кадгерина и р120-катенина в группе случаев Базальноподобного подтипа, а также между экспрессией - и р120-катенинов в группе случаев Базальноподобного и Люминального В (HER-2 позитивный) подтипов. Полученные результаты свидетельствуют о взаимосвязанном последовательном каскаде, запускаемым появлением экспрессии Р кадгерина с последующей цитоплазматической транслокацией - и р120 катенинов, приводящей к активации описанных выше сигнальных путей. В результате реализации канонического сигнального пути Wnt, а также ряда других сигнальных путей, подробно не изучаемых в данной работе, в ядре опухолевых клеток активируются таргетные гены, приводящие к запуску ЭМП и блокированию гена CDH1, ответственного за синтез Е-кадгерина.
Но, как было показано выше, чаще всего реализуется неполный ЭМП, при котором экспрессия Е-кадгерина не блокируется таргетными генами, и данная молекула продолжает экспрессироваться на мембране опухолевых клеток. Отличающиеся от описанных выше результаты получены для группы опухолей Люминального В (HER-2 негативный) подтипа, для которых была выявлена прямая связь между экспрессией Е-кадгерина и -катенина, но при этом обратная связь между экспрессией Е-кадгерина и р120-катенина, а также Р-кадгерина и р120-катенина. Данная группа опухолей отличается от остальных групп относительно большим числом случаев с измененной экспрессией Е-кадгерина и относительно низким числом случаев с измененной экспрессией Р-кадгерина. Причем, в этой группе не выявлено взаимосвязи между экспрессией Е- и Р-кадгеринов. Можно предположить, что в данной группе опухолей, снижение экспрессии Е-кадгерина происходит главным образом, за счет механизмов, отличающихся от реализующихся при других иммуногистохимических подтипах. Как упоминалось выше, таким механизмом может быть эстрогеновый сигнальный путь, при котором происходит активация ER транскрипционных факторов Snail и Slug, подавляющих экспрессию Е-кадгерина (Oesterreich S., et al, 2003; Park S.H., et al, 2008).
При анализе полученных данных в группах подтипов, характеризующихся наличием экспрессии ER, PR, а также отсутствием экспрессии HER-2/neu, отличающихся уровнем пролиферации (индекс пролиферации Ki-67 низкий ( 20%) в Люминальном А подтипе и высокий (20%) в Люминальном В (HER-2 негативный), выявлено, что при высоком уровне пролиферации чем выше пролиферация, тем реже экспрессируется Е-кадгерин на мембране опухолевых клеток, и, наоборот, при низкой пролиферации клеток опухоли экспрессия Е-кадгерина напрямую связана с уровнем пролиферации (V=-0,46, p 0,05 и V=0,46, p 0,05 соответственно).
Таким образом, в опухолях с положительным рецепторным статусом гормональных рецепторов и отрицательной экспрессией рецептора HER-2/neu, высокая пролиферация клеток опухоли чаще связана с отсутствием экспрессии Е-кадгерина, что объясняется реализацией канонического сигнального пути Wnt (Savagner P., 2010).
При изучении опухолей подтипа с отсутствием экспрессии рецепторов ER, PR, HER-2/neu инвазивного долькового рака молочной железы (Базальноподобный подтип) выявлена прямая взаимосвязь маркера ЭМП виментина и индекса пролиферации Ki-67, что свидетельствует о реализации ЭМП в опухолях с высокой пролиферацией опухолевых клеток (V=0,52, p 0,05). Отсутствие экспрессии рецепторов ER, PR, HER-2/neu исключает участие эстрогенового сигнального пути, а также пути с участием тирозинкиназных рецепторов (HER-2/neu) в данном механизме. Полученный результат может быть объяснен реализацией канонического сигнального пути Wnt, приводящему к активации ЭМП и увеличению пролиферации опухолевых клеток.
Изучена экспрессия эпителиальных кадгеринов и ассоциированных катенинов в группах с наличием и отсутствием регионарных метастазов. Отсутствие экспрессии Е-кадгерина (7%), появление цитоплазматической экспрессии -катенина (67%) и р120-катенина (84%) выявлены в опухолях при отсутствии регионарных метастазов. Активация ряда сигнальных путей указанными молекулами позднее приводит к увеличению подвижности, миграции, инвазии, резистентности, выживаемости и пролиферации опухолевых клеток, а также к реализации ЭМП, что, в конечном итоге, сопровождается развитием метастазов. Таким образом, изменение экспрессии Е-кадгерина, - и р120-катенина предшествует развитию регионарных метастазов. Экспрессия Р-кадгерина клетками опухоли остается высокой на любой стадии регионарного метастазирования, но существенно увеличивается к стадии N2 (91% случаев). Таким образом, механизмы, 127 приводящие к экспрессии Р-кадгерина, усиливаются по мере развития опухолевого процесса. Выявлено также, что количество случаев, экспрессирующих виментин значительно увеличивается на стадии N2 (84% случаев), что является подтверждением реализации ЭМП и приобретением опухолевыми клетками способности к миграции, являющейся одним из условий развития метастазов. При изучении инвазивного долькового рака молочной железы со стадией регионарного метастазирования N1 выявлена взаимосвязь между цитоплазматической экспрессией - и р120-катенинов (V=0,46, p 0,05). Для данной группы случаев показано, что в присутствии эстрогенового рецептора в 70% случаев не происходит высвобождения -катенина из кадгерин катениновых комплексов (V=-0,40, p 0,05), т.е. происходит частичная дезактивация эстрогеновым сигнальным путем цитоплазматической транслокации -катенина преимущественно за счет блокирования гена CDH3 и экспрессии Р-кадгерина. Для данной группы исследования также показано, что в присутствии тирозинкиназных рецепторов (HER-2/neu) в большинстве случаев (69%) не происходит цитоплазматической транслокации р120-катенина (V=-0,47, p 0,05). Экспрессия виментина и Р-кадгерина достоверно не менялась по сравнению с группой без метастазов в лимфатические узлы. Достоверной взаимосвязи экспрессии виментина с другими параметрами для данной группы опухолей не выявлено.
При изучении инвазивного долькового рака молочной железы со стадией регионарного метастазирования N2 выявлена коэкспрессия Р-кадгерина и виментина в 91% случаев, а также взаимосвязь изучаемых признаков (V=0,67, p 0,05). Увеличение количества случаев с аберрантной экспрессией Р-кадгерина (на 5% (p 0,05) по сравнению с группой с отсутствием метастазов и на 9% (p 0,05) по сравнению с общей группой), а также с экспрессией виментина (на 14% (p 0,05) по сравнению с группой с отсутствием метастазов и общей группой) в данной группе исследования, а также высокая степень корреляции и коэкспрессии данных молекул, по видимому, может являться признаком вероятного развития регионарных метастазов. Кроме того, экспрессия виментина связана с экспрессией р120 катенина (V=-0,5, p 0,05). Можно предположить, что высвобождение р120 катенина из кадгерин-катениновых комплексов запускает каскад сигнальных путей, приводящих к метастазированию. Однако самое большое количество случаев с цитоплазматической экспрессией р120-катенина (84%) наблюдается при инвазивном дольковом раке молочной железы с отсутствием метастазирования, в то время как число соответствующих случаев инвазивного долькового рака молочной железы со стадией регионарного метастазирования N2 уменьшается в два раза (45%). Полученные данные позволяют предположить последовательную экспрессию р120-катенина и виментина, при этом, когда опухолевая клетка начинает экспрессировать виментин, цитоплазматическая экспрессия р120-катенина прекращается.