Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 18
1.1 Церебральная ишемия и травма головного мозга: этиология и клиническая значимость 18
1.1.1 Ишемический инсульт 18
1.1.2 Гипоксическая энцефалопатия новорожденных 19
1.1.3 ЧМТ 20
1.2 Функциональная роль митохондрий в патофизиологии головного мозга 22
1.2.1 Структура и функции митохондрий в головном мозге 22
1.2.2 Роль митохондриальных АФК в развитии острых церебральных патологий 29
1.2.2.1 Механизмы образования активных форм кислорода 29
1.2.2.2 Сигнальная функция АФК 35
1.2.2.3 Механизмы клеточной защиты от АФК 39
1.2.3 Роль митохондрий в кальциевой сигнализации 44
1.2.4 Митохондрии и глутаматная эксайтотоксичность 48
1.2.5 Роль митохондрий в клеточной гибели 53
1.2.5.1 Переход митохондрий в состояние повышенной проницаемости и индукция клеточной гибели 54
1.2.5.2 Каспаза-зависимый апоптоз 56
1.2.5.3 Каспаза-независимый апоптоз 59
1.2.5.4 Индукторы и модуляторы участия митохондрий в гибели клеток, повышающие проницаемость внешней мембраны 60
1.2.5.5 Окислительный стресс 62
1.2.5.6 Активация PARP 63
1.2.6 Контроль качества митохондрий (митофагия) 63
1.2.7 Повреждение митохондрий как активатор врожденного иммунитета 68
1.3 Стратегии защиты головного мозга 71
1.3.1 Антиоксиданты 71
1.3.2 Разобщители дыхания и окислительного фосфорилирования 75
1.3.3 Прекондиционирование 80
1.3.4 Фармакологическое ингибирование неспецифической проницаемости митохондрий 91
1.3.5 Клеточная терапия 102
2. Материалы и методы экспериментальных исследований 112
2.1 Эксперименты на культурах клеток 112
2.1.1 Получение первичной культуры нейронов 112
2.1.2 Получение первичной культуры астроглии 113
2.1.3 Культивирование эндотелиальных клеток 113
2.1.4 Культуры клеток эпителия почечных канальцев 114
2.1.5 Получение мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток 114
2.1.6 Получение 0 клеток линии PC12 114
2.1.7 Фенотипирование клеточных культур 115
2.1.8 Кислородно-глюкозная депривация (КГД) 115
2.1.9 Химическая гипоксия 116
2.1.10 Оценка жизнеспособности клеточных культур 116
2.1.11 Оценка продукции лактата 116
2.1.12 Измерение активности лактатдегидрогеназы 116
2.1.13 Совместное культивирование клеток эпителия почечных канальцев с первичной культурой нейронов коры головного мозга 117
2.1.14 Сокультивирование ММСК с нейральными клетками 117
2.1.15 Трансфицирование клеток 117
2.1.16 Оценка межклеточного транспорта компонентов цитозоля между ММСК и нейральными клетками 118
2.1.17 Иммуноцитохимия первичных культур нейронов 118
2.1.18 Оценка продукции АФК в первичной культуре нейронов 118
2.1.19 Оценка мембранного митохондриального потенциала в клеточных культурах 118
2.1.20 Оценка пролиферации клеток 119
2.1.21 Конфокальная микроскопия 119
2.1.22 Проточная цитофлуориметрия 119
2.1.23 Обработка клеточных культур цитопротекторными агентами 120
2.2 Эксперименты на животных 120
2.2.1 Моделирование фокальной ишемии/реперфузии головного мозга 121
2.2.2 Моделирование открытой черепно-мозговой травмы головного мозга 121
2.2.3 Моделирование ишемического/гипоксического повреждения головного мозга у новорожденных крысят 122
2.2.4 Поведенческие тесты 122
2.2.4.1 Тест «Постановка конечности на опору» 123
2.2.4.2 Тест Монтойа 124
2.2.5 Магнитно-резонансная томография 124
2.2.6 Протонная магнитно-резонансная спектроскопия 124
2.2.7 Окраска срезов мозга 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом 125
2.2.8 Определение объема инфаркта 125
2.2.9 Определение АФК в срезах головного мозга 126
2.2.10 Оценка трансмембранного митохондриального потенциала в суспензии клеток головного мозга 126
2.2.11 Инъекция ММСК в головной мозг 127
2.2.12 Экспериментальные группы и изучаемые терапетические подходы 127
2.2.12.1 Изучение нейропротеткорных свойств ионов лития 127
2.2.12.2 Исследование нейропротекторных свойств митохондриально адресованных антиоксидантов 128
2.2.12.3 Изучение нейропротекторных свойств разобщителей дыхания и окислительного фосфорилирования 129
2.2.12.4 Изучение нейропротекторных эффектов фармакологического и удаленного ишемичского прекондиционирования 131
2.2.12.5 Оценка нейропротекторных свойств ММСК на модели ишемии головного мозга 134
2.3 Биохимические исследования 134
2.3.1 Определение содержания эритропоэтина в моче 134
2.3.2 Выделение митохондрий 135
2.3.3. Полярографическое измерение потребления О2 митохондриями 135
2.3.4 Вестерн-блоттинг 135
2.4 Статистическая обработка данных 136
3. Результаты 137
3.1 Ишемия/реперфузия вызывает дисфункцию митохондрий клеток головного мозга 137
3.2 Защита головного мозга от повреждений, вызванных ишемией/реперфузией или черепно-мозговой травмой 141
3.2.2 Нейропротекторные свойства митохондриально-адресованных антиоксидантов 158
3.2.3 Нейропротекторные свойства разобщителей дыхания и окислительного фосфорилирования 182
3.2.3.1 Протонофор 2,4-динитрофенол защищает головной мозг от последствий ишемии/реперфузии 182
3.2.3.2 Нейропротекторные свойства митохондриально-адресованных разобщителей дыхания и окислительного фосфорилирования при ишемии/реперфузии головного мозга 184
3.2.3.3 Нейропротекторные свойства грамицидина А с N-концевыми модификациями 186
3.2.3.4 Нейропротекторные свойства митохондриально-адресованного флуоресцеина (MitoFluo) на модели ЧМТ 191
3.2.4 Фармакологическое и удаленное ишемическое прекондиционирование как способ защиты головного мозга при инсульте 197
3.2.4.1 Удаленное ишемическое прекондиционирование почки защищает головной мозг от ишемии/реперфузии 197
3.2.4.2 Нейропротекторный эффект удаленного ишемического прекондиционирования конечностей и влияние на него анестетиков 203
3.2.4.2.1 Нейропротекторный эффект удаленного ишемического прекондиционирования конечностей на экспериментальной модели ишемии/реперфузии головного мозга 203
3.2.4.2.2 Нейропротекторные эффекты УИПК при использовании хлоралгидрата во время прекондиционирования 207
3.2.4.2.3 Нейропротекторные эффекты УИПК при использовании золетила во время прекондиционирования 209
3.2.4.2.4 Исследование сигнальных путей ишемической толерантности, вызванной УИПК и наркозными препаратами 211
3.2.4.3 Нейропротекторный эффект фармакологического прекондиционирования митохондриально-адресованным антиоксидантом SkQR1 213
3.2.5 Терапия ишемии головного мозга мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками 224
3.2.5.1 Фенотип использованных первичных клеточных культур 224
3.2.5.1.1 Фенотипирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 224
3.2.5.1.2 Фенотипирование первичных культур нейронов и астроцитов 225
3.2.5.2 Транспорт компонентов цитозоля между нейральными клетками и ММСК 227
3.2.5.3 Транспорт митохондрий между нейральными клетками и ММСК 235
3.2.5.4 Влияние митохондриальной дисфункции в соматических клетках на донирование митохондрий из ММСК 237
3.2.5.5 Образование межклеточных контактов по типу туннелирующих нанотрубок между нейральными клетками и ММСК 242
3.2.5.6 Влияние сокультивирования ММСК с нейронами на нейропротекторные свойства ММСК 245
3.2.5.7 Роль белка Miro1 в межклеточном транспорте митохондрий и в реализации нейропротекторных эффектов ММСК на модели экспериментальной ишемии головного мозга крысы 249
4. Обсуждение 253
5. Выводы 294
Список литературы 299
Благодарности 346
- Структура и функции митохондрий в головном мозге
- Прекондиционирование
- Нейропротекторные свойства митохондриально-адресованных антиоксидантов
- Роль белка Miro1 в межклеточном транспорте митохондрий и в реализации нейропротекторных эффектов ММСК на модели экспериментальной ишемии головного мозга крысы
Структура и функции митохондрий в головном мозге
Головной мозг составляет около 2% от массы тела человека, однако при этом использует до 20% всего кислорода, потребляемого организмом [318]. Высокая потребность мозга в кислороде необходима для функционирования митохондрий, чтобы производить достаточное количество АТФ, используемого на поддержание ионных градиентов на плазматической мембране нервных клеток, поддержание компартментализации нейротрансмиттеров и обеспечение экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул.
Окислительное фосфорилирование обеспечивается в митохондриях электрон-транспортными комплексами внутренней мембраны, которая в норме имеет низкую ионную проводимость и, в то же время, обеспечивает транспорт метаболитов за счет специфических переносчиков и обменников. Реализации этих свойств способствует специфический липидный состав митохондриальных мембран, в частности, повышенное содержание в них фосфатидилэтаноламина и кардиолипина. Однако по липидному составу митохондрии мозга несколько отличаются от митохондрий других органов, прежде всего печени и сердца. Известно, что в митохондриях мозга крысы содержится меньше кардиолипина – около 6 мкмоль на г ткани или 2-10% от общего количества фосфолипидов [299], в результате чего соотношение кардиолипин/фосфолипиды в мозге на 15-20% ниже, чем в сердце или печени. Важным отличием кардиолипинов в мозге является малое содержание в них насыщенных жирных кислот и повышенное количество полиненасыщенных: около 45% ацилов линолевой и линоленовой кислот и 40% арахидоновой и докозагексаеновой [183]. Несмотря на различия в липидном составе, основные свойства проницаемости липидных бислоев митохондрий разных тканей в основном схожи. Однако, в силу высокого содержания липидов с полиненасыщенными жирными кислотами, мембраны мозговых митохондрий более чувствительны к свободнорадикальному окислению в патологических условиях [114].
Интересно, что, хотя митохондрии печени более эффективно вырабатывают АТФ, митохондрии мозга способны к более быстрой продукции АТФ [395]. В то же время, подобная валовая оценка всех митохондрий ткани может быть недостаточно достоверной из-за наличия очень высокой региональной, клеточной и субклеточной гетерогенности мозговых митохондрий. В 1970-е годы была разработана методика для выявления и выделения митохондрий из синаптических и несинаптических районов. Первый тип состоит только из нейрональных митохондрий, а второй - и из нейрональных, и из глиальных. Между двумя этими популяциями есть ряд различий. Во-первых, у них отличается активность метаболических ферментов и интенсивность дыхательных процессов. Например, содержание цитохрома b и а/а3 в синаптических и несинаптических митохондриях, полученных из коры, гиппокампа и стриатума крыс было практически одинаковым, тогда как количество цитохромов с/с1 было значительно выше в стриатуме и гиппокампе, чем в коре мозга [92]. Наоборот, наибольшая активность комплексов дыхательной цепи (NАDН-цитохром с редуктаза, сукцинат-цитохром с редуктаза и убихинол-цитохром с редуктаза) наблюдалась именно в корковых митохондриях. Зависимость активности дыхательных комплексов от температуры также была различной для стриатума, гиппокампа и коры, что, вероятно, связано с различными физическими свойствами липидных мембран [92]. Большинство митохондрий, расположенных в дендритах, имеют высокий уровень активности цитохромоксидазы. Существует также взаимосвязь между активностью цитохромоксидазы и размером митохондрии - чем активнее фермент, тем крупнее органелла. Каждый нейрон (или, скорее, каждый крупный сегмент нейрона) самостоятельно регулирует плотность расположения и величину митохондрий. В определенных областях головного мозга в дендритах митохондрии с активной цитохромоксидазой могут быть крупнее чем в основании аксона, но мельче чем в окончании аксона. Это может свидетельствовать либо об ограниченном движении митохондрий из одной части нейрона в другую, либо о быстром регулировании уровня фермента в митохондрии соответственно локальным потребностям [733]. Кроме того, было показано, что функциональная активность митохондрий из СА1 области гиппокампа ниже, чем в зоне неокортекса: это проявлялось в низкой активности комплекса IV в синаптосомальных митохондриях СА1 и комплексов II-IV в несинаптосомальных митохондриях СА1 по сравнению с митохондриями неокортекса. В то же время наблюдались и различия синаптосомальных и несинаптосомальных митохондрий, в частности в пороге активации комплекса I, что может обусловливать более высокую чувствительность митохондрий синаптического происхождения к метаболической дисфункции при различных нейральных патологиях [184].
Таким образом, когда анализируются различные изменения в функционировании митохондрий мозга, например, при острых ишемических патологиях, нужно всегда учитывать имеющуюся исходно в норме гетерогенность митохондрий, чтобы оценить эффекты собственно патологического процесса.
Помимо функциональных особенностей митохондрий мозга, важное значение, как для нормального функционирования, так и для развития патологических процессов в нейральных клетках, имеет структурная организация митохондриального ретикулума. Обычно митохондрии клетки объединяются в сложные митохондриальные сети, благодаря чему возможна лучшая координация работы этих органелл. Однако такие сети могут фрагментироваться под действием различных факторов. Слияние и дробление митохондрий составляет неотъемлемую часть функционирования любой клетки, в том числе нейральной.
Слияние митохондрий регулируется множеством белков и представляет собой достаточно сложный процесс из-за наличия у митохондрий двух мембран. Многие элементы, задействованные в механизме слияния митохондрий определены в более простых системах, в частности, дрожжевых клетках, а затем их аналоги находят в других клетках, в том числе нейронах.
У дрожжей для слияния внешних мембран митохондрий необходимо их близкое расположение, низкие уровни GTP и протонный градиент через внутреннюю мембрану [143]. Fzo1, MFN1 и MFN2 - крупные белки семейства GTP-аз, локализованные в наружной мембране митохондрий. N-концы данных белков содержат консервативный GTP-азный домен, а С-конец представляет собой биспиральную структуру. Показано, что мутации в одном из этих доменов у белка Fzo1 ингибируют слияние митохондрий у дрожжей. В in vitro исследованиях обнаружено, что данный белок выступает в роли посредника между внешними мембранами митохондрий во время слияния. Белки MFN1 и MFN2 присутствуют на внешней мембране митохондрий и образуют гомо- и гетероолигомерные комплексы, соединяя соседние митохондрии. MFN2 также участвует в связывании митохондрий и ЭПР, регуляции активности электронно-транспортной цепи (ЭТЦ), синтезе некоторых белков и внутриклеточной передаче сигнала [467]. Предполагается, что Fzo1, MFN1 и MFN2 выступают в качестве посредников при слиянии митохондрий благодаря взаимодействиям биспиральных доменов. Согласно кристаллической структуре гомолога митофузина у цианобактерий (BDLP), две трансмембранные спирали (аминокислотные остатки 572-606) образуют гидрофобную область, которая может внедряться в билипидный слой и тем самым искривлять мембрану. Таким образом, гидрофобная область MFN2 может быть непосредственно вовлечена в процесс слияния мембран (Рисунок 1) [365].
У млекопитающих процесс слияния внутренних мембран митохондрий опосредован динамин-связанным белком OPA1 и для его реализации требуется повышенный уровень GTP [143]. У OPA1-мутантных мышей наблюдается повышенная фрагментация митохондрий. На N-конце OPA1 находится MTS-последовательность для транспорта белка в митохондрию. В состав белка входят также трансмембранная спираль, заякоривающая его на внутренней мембране митохондрии. В зависимости от изменения мембранного потенциала OPA1 может менять свою конформацию, что влияет на ход слияния [467]. Протеолитическое расщепление различными протеазами in vivo отщепляет OPA1 от мембраны. Предположительно, молекулы OPA1, как и Fzo1, связываются друг с другом своими GTP-азными и GED-доменами для соединения внутренних митохондриальных мембран (Рисунок 1).
Прекондиционирование
Явление прекондиционирования очень близко описывается образной цитатой «то, что не убивает тебя, делает тебя сильнее». Открытое для сердца [483], это явление затем активно стало исследоваться и для других органов [668], и в том числе было показано, что оно обеспечивает повышенную толерантность мозга к различным острым повреждающим воздействиям. За последние несколько десятилетий предпринималось много попыток определения молекулярных механизмов, участвующих в индукции защитных реакций, и последние данные свидетельствуют о том, что многие из этих механизмов сходятся на митохондриях, являющихся мастер-регуляторами эндогенной нейропротекции [636].
Прекондиционирование мозга было открыто лишь спустя 20 лет, после того, как это явление было описано для сердца [614] и затем его защитные эффекты на мозге были неоднократно подтверждены [608]. Сегодня широко признается, что для реализации феномена прекондиционирования мозга необходимы малые дозы повреждающего воздействия (обычно ишемии), обеспечивающие нейропротекторные реакции ткани при последующем повреждении [205]. Действительно, было показано, что такие стимулы, как ишемия, низкие дозы эндотоксина и гипоксия, способны индуцировать защитные реакции [5, 26], причем эти сигнальные пути являются достаточно универсальными, обеспечивая так называемую “перекрестную толерантность” [608].
Описано два основных типа прекондиционирования: немедленное и отложенное, то есть в зависимоти от сигнальных путей система может обладать «памятью» к повреждающему воздействию или же толерантность возникает только в очень короткий промежуток времени после прекондиционирования (Рисунок 11). Немедленное прекондиционирование (не обладающее «памятью») происходит в течение нескольких минут после стимула и включает клеточные изменения, связанные с активностью или функцией ферментов, вторичных мессенджеров и ионных каналов. И, наоборот, для реализации отложенного прекондиционирования мозга требуется несколько часов и даже дней, поскольку оно зависит от экспрессии генов и de novo синтеза белка [259]. Помимо этого, недавно было показано, что прекондиционирование запускает специфическое репрограммирование клеток, что в свою очередь, может придавать ткани нейропротекторный фенотип [667].
Хотя в целом понимание процессов происходящих при прекондционировании уже сложилось, молекулярные механизмы, ответственные за индукцию и поддержание индуцированной толерантности мозга, остаются в значительной степени неопределенными из-за сложности и комплексности этого процесса. Одним из важных посредников в сигналах прекондиционирования является митохондрия, более того многие события этого каскада имеют митохондрию как ключевое звено [636]. Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что транзиторное воздействие на митохондрии физиологических или патологических стимулов, внутриклеточных мессенджеров или фармакологические препаратов могут вызывать в них изменения, которые, в конечном счете, защищают нейроны от различных повреждающих воздействий [215]. Взаимосвязь между митохондриальными функциями, биоэнергетикой и метаболизмом и проявлением нейропротекторного действия ПК описано и в in vitro системах, и в моделях ишемии головного мозга in vivo.
Говоря в целом о прекондиционирующих стимулах необходимо отметить, что различия в продолжительности, интенсивности и частоте стрессового сигнала определяет то, будет ли стимул слишком слабым, чтобы вызвать какой либо ответ, достаточным для включения прекондиционирования или слишком жестким и соответсвенно опасным. Таким образом, молекулы, способные вызывать повреждение головного мозга, такие как глутамат, АФК, воспалительные цитокины и ионы кальция, могут при действии в низких дозах в процессе ишемического ПК запускать адаптивный, а не повреждающий ответ в клетках мозга, закладывая принцип гормезиса [271, 726]. Хотя короткая церебральная ишемия или гипоксия головного мозга являются прототипом всех прекондиционирующих стимулов, существует множество других эндогенных и экзогенных сигналов, которые не относятся к ишемическим или гипоксическим: гипероксия, длительная гиперперфузия, гипертермия (тепловой стресс) и распространяющаяся кортикальная деполяризация (волна электрофизиологической гиперактивности, за которой следует волна торможения). В результате один стрессорный фактор может провоцировать кросс-толерантность к другому. Однако все широкое разнообразие таких стимулов индуцирует некий общий «толерантный фенотип» головного мозга, то есть сигнальные пути от самых разных стимулов сходятся на нескольких базовых ключевых триггерах, которые регулируют выработку адаптации к последующим повреждениям. Важно отметить, что многие фармакологические препараты и химические соединения могут также индуцировать ишемическую толерантность (фармакологическое прекондиционирование), симулируя сигнальные пути ишемического ПК. Эти процессы будут рассмотрены в отдельной главе ниже.
Прямое ишемическое ПК, при котором целевой орган подвергается короткому, а затем пролонгированному периоду ишемии, способно уменьшать реперфузионное повреждение, однако одним из его главных недостатков является повреждение важных сосудов и стрессирование целевого органа [682]. Удаленное ишемическое прекондиционирование – это воздействие на орган (или его участок), удаленный от целевого органа, коротким (часто повторяющимся) периодом ишемии, что может приводить к защите целевого органа против последующего пролонгированного периода ишемии. Термин «удаленное ишемическое прекондиционирование» был впервые применен для феномена, открытого Przyklenk и соавторами: перекрытие левой огибающей артерии собаки 4 раза по 5 минут (периоды реперфузии также составляли 5 минут) значительно уменьшало объем повреждения миокарда, вызываемого последующим перекрытием левой передней нисходящей артерии [559]. В том же году McClanahan с коллегами продемонстрировал, что ишемия почки с последующей реперфузией защищает миокард от ишемии и уменьшает размер инфаркта [459]. В 2002 году исследования Tokuno и соавторов предоставили свидетельства в пользу того, что именно ишемия, а не реперфузия, активирует сигнальные пути, приводящие к удаленной протекции органов [691].
Явление протекции при помощи удаленного ишемического ПК было показано для сердца, мозга, печени, почки, мышц и кожи. При этом короткий период ишемии может проводиться на различных удаленных органах: сердце, печени, легком, кишечнике, мозге, почке и конечностях [682].
Есть свидетельства положительного эффекта прекондиционирования, проводимого перед трансплантацией почки, печени, сердца. Реперфузионное повреждение трансплантата может приводить к первичному полному отсутствию его функционирования (менее чем в 5% случаев), его первичной дисфункции (10-30%), а также к синдрому множественной дисфункции, приводящему к серьезным нарушениям работы и к смерти организма. Интересно, что влияние на успех трансплантации было показано как при прекондиционировании донора, так и прекондиционировании реципиента [682], что является одним из доводов в пользу гуморальной природы протекторных стимулов.
Очевидно, чтобы индуцировать толерантность, все разнообразные прекондиционирующие стимулы должны распознаваться молекулярными сенсорами, призваными сообщать клетке и органу, что существует угроза ишемии ткани. Индентивицировано дотаточно много систем, которые могут служить такими сенсорами: среди них рецепторы нейротрансмиттеров и нейромедиаторов, цитокиновые и Толл-подобные рецепторы, ионные каналы и редокс-чувствительные белки [345]. В свою очередь эти сенсоры активируют дальнейшую передачу сигнала, чтобы, в конечном счете, индуцировать адаптивный ответ клетки. Число таких путей передачи сигнала невелико, поскольку большинство этих путей являются универсальными для множества исходных прекондиционирующих стимулов. Считается, что основными участниками систем передачи таких сигналов являются митоген-активируемые протеинкиназы (MAPKs) с ниже лежащими сигнальными путями Raf (Raf-1, A-Raf и B-Raf), MEK и ERK, Akt (протеинкиназа B) и изоформа протеинкиназы C- [287], а также mitoKATP-канал [7]. Причем для кардиомиоцитов показано, что большая часть этих сигнальных путей имеет конечным эффектором киназу гликогенсинтазы-3 [337]. При их участии активируются процессы, направленные на выживание клеток, ингибируются каспазы и проапоптотические гены. Например, было показано, что нейропротекция, вызванная гипоксическим прекондиционированием гранулярных нейронов мозжечка, связана с активацией PI3-K/Akt и фосфорилированием MEK/ERK [330]. После того как на сердце была продемонстрировано, что фосфорилирование и активация PI3-K/Akt и ERK сигнальных путей происходит не только во время ишемического ПК, но и во время реперфузии, а их блокада полностью снимает протекцию, сигнализацию через них объединили под названием пути киназ, спасающих от реперфузионного повреждения – RISK пути [587]. После активации Akt киназа фосфорилирует различные субстраты по остаткам серина или треонина. Так, Akt способна фосфорилировать и инактивировать GSK-3; фосфорилировать mdm2 (murine double minute) – белок, поддерживающий транспорт р53 из ядра в протеосомы для последующей деградации [296]; фосфорилировать BAD, каспазу 9 и другие белки [537]. Еще одна мишень – это CREB белок, транскрипционный фактор, индуцирующий, в частности, экспрессию генов Na+/Ca2+-обменников, особенно NCX3 изоформы, способной, в отличие от других изоформ, работать при сниженных количествах АТФ, что способствует сохранению кальциевого гомеостаза при последующей ишемии [537]. Помимо прочего, через Akt реализуется и индукция экспрессии белков теплового шока, что также способствует выживанию клеток. Участие ERK 1/2 в механизмах протекции ишемического ПК было продемонстрировано на культурах кортикальных нейронов, а также на нейронах СA1 поля гиппокампа [269, 330]. Вероятно, этот путь активируется протеинкиназой С, поскольку ингибирование ERK устраняет протекцию как ишемического ПК, так и агонистов PKC в модели органотипических гиппокампальных срезов [398]. На культуре гиппокампальных нейронов было продемонстрировано, что активация NMDA-рецепторов ведет к активации ERK1/2 киназы [528], что также согласуется с приведенными выше данными, так как активация NMDA-рецепторов приводит, в свою очередь к активации PKC. Активация ERK1/2 индуцирует экспрессию нейропротекторных генов, например, супероксид-дисмутазы 1 [330], а также различных транскрипционных факторов, например, CREB [528]. Активность ERK 1/2 способствует предотвращению апоптоза и выживанию клетки: так, ERK 1/2 способна фосфорилировать проапоптотический белок BAD, вызывая диссоциацию его от Bcl-xL [398].
Многие киназы и транскрипционные факторы являются редокс-чувствительными, где в качестве сигнальной молекулы и модулятора прекондиционирующего сигнала могут также служить АФК, что показано и для нервной ткани [567]. Еще одной молекулой-передатчиком интегрирующим многие сигналы ишемической толерантности является аденозин и возможно другие продукты гидролиза АТФ, роль которых во многих моделях нейропротекции при прекондиционирвоании мозга хорошо показана [491, 542].
Поскольку прекондицонирование активирует не только пост-трансляционные модификации белков и ферментов, но и изменения экспрессии многих белков, то часть исследований направлена на поиск именно транскрипционных факторов, меняющихся при ишемии или ишемическом ПК, главным из которых, конечно, является гипоксия-индуцируемый фактор (HIF-1). Регуляция активности генов через HIF-1 является достаточно консервативной и сходна у дрозофилы, нематоды и млекопитающих, в связи с чем эти пути регуляции весьма хорошо изучены. При нормоксии изоформа HIF1 гидроксилируется при участии кислорода и пролиновых гидроксилаз, что активирует связывание фактора с убиквитином и направляет HIF1 в протеасомальную деградацию. Гипоксия замедляет или прекращает гидроксилирование HIF1, таким образом, делая его стабильным и позволяя транслоцироваться в ядро, где он после димеризации с HIF1 промотирует транскрипцию генов, ответственных за устойчивость к гипоксии. В частности, гены, которые кодируют синтез эритропоэтина (ЭПО), VEGF, iNOS, транспортера глюкозы-1, ферментов гликолиза и многих других белков, обеспечивающих протекцию мозга во второй фазе действия ПК [665]. HIF-1 также способствует сохранению кальциевого гомеостаза, индуцируя экспрессию NCX1 [537]. Существует и другая, менее широко изученная изоформа HIF2, которая регулируется аналогичным образом, однако экспрессируется в основном в эндотелии и, как считается, не индуцируется в мозге в ответ на гипоксию [16, 666].
Нейропротекторные свойства митохондриально-адресованных антиоксидантов
В основе повреждения головного мозга в результате ишемии и последующей за ней реперфузии лежит развитие окислительного стресса и дисфункция митохондрий, где митохондрии являются одним из основных источников АФК. В этой связи мы исследовали нейропротекторные свойства митохондриально-адресованных (6 -пластохинонил)-децилтрифенилфосфоний (SkQ1); 10-(6 -толухинонил) децилтрифенилфосфоний (SkQT1); 10-(6 -пластохинонил) децилродамин 19 (SkQR1); 10- (6 -толухинонил) децилродамин 19 (SkQTR1).
Был исследован защитный эффект производных пластохинона и тимохинона конъюгированных с молекулами, обеспечивающими адресную доставку в митохондрии (Рисунок 26) при моделировании ишемического повреждения головного мозга. В этой связи проводили окклюзию средней мозговой артерии в течение 60 мин с последующей реперфузией, и были исследованы 10-(6 -пластохинонил)-децилтрифенилфосфоний (SkQ1); 10-(6 -толухинонил)-децилтифенилфосфоний (SkQT1) и 10-(6 -пластохинонил)-децилродамин 19 (SkQR1); 10-(6 -толухинонил)- децилродамин 19 (SkQTR1). Антиоксиданты вводили внутрибрюшинно сразу же после начала реперфузии в дозе 1 моль/кг. Через 24 часа после моделирования ишемического инсульта в головном мозге крыс методом МРТ наблюдалось обширное повреждение коры и стриатума, а также в ряде случаев частичное повреждение гипоталамуса и миндалевидного тела, расположенных вне сосудистой территории средней мозговой артерии (Рисунок 27А). Введение SkQR1 и SkQTR1 значительно уменьшило область инфаркта, до 72,0% ± 16,1% и 68,0% ± 6,1% от значений в группе, получившей вместо антиоксидантов физиологический раствор (P 0,05) (Рисунок 27A, Б). Ишемическое повреждение также привело к значительному отеку мозга, составляющему 15,0 ± 1,4% от объема полушария, тогда как SkQR1 и SkQTR1 уменьшили размеры отека по меньшей мере вдвое – до 7,1 ± 2,0% и 7,6 ± 1,6%, соответственно (P 0,05) (Рисунок 27A, В). Два других антиоксиданта – SkQ1 и SkQT1 – не оказали статистически значимого воздействия на снижение повреждения мозга и отек (Рисунок 27A–В). Ишемическое повреждение также вызвало значительные нарушения сенсомоторных функций в конечностях, контралатеральных поврежденному полушарию. Если до индукции ишемии у интактных крыс неврологический статус оценивался в 14,0 баллов в тесте «постановка конечности на опору», а у ложнооперированных животных – в 13,1 ± 0,5 баллов, то после ишемического повреждения результат составил лишь 2,1 ± 0,2 балла. Введение SkQ1 и SkQTR1 статистически значимо снижало неврологический дефицит до 3,8 ± 0,5 и 4,0 ± 0,4 баллов соответственно (P 0,05) (Рисунок 27Г). У животных, получивших одноразовую в/б инъекцию SkQR1, неврологический дефицит был в 3,5 раза меньше по сравнению с контрольной группой и составил 7,0 ± 1,0 баллов.
Дозо-зависимые нейропротекторные эффекты SkQR1
Поскольку SkQR1 показал наибольшую терапевтическую эффективность по сравнению с другими типами митохондриально-направленных антиоксидантов, было решено исследовать его дозо-зависимые нейропротекторные свойства. SkQR1 вводился в/б в дозах 0,5, 1 и 2 моль/кг сразу после начали реперфузии. При сравнении с контрольной группой, получавшей физиологический раствор, было показано снижение объема инфаркта на 28% после воздействия 1 и 2 моль/кг SkQR1 (P 0,05) (Рисунок 28А). Введение 1 и 2 моль/кг SkQR1 (P 0,05) также значительно уменьшило размеры отека мозга (Рисунок 28Б). Статистически значимых различий в объемах инфаркта и отека мозга при введении 0,5 моль/кг SkQR1 не наблюдалось. Тем не менее, воздействие SkQR1 во всех дозах значительно способствовало восстановлению сенсомоторных функций головного мозга в соответствии с показателями неврологического статуса, оцененного в тесте «Постановка конечности на опору» с 2,8 ± 0,7 (контрольная группа) до 6,8 ± 0,5, 7,0 ± 1,0 и 5,3 ± 0,5, соответственно для доз 0,5, 1 и 2 моль/кг (Рисунок 28В).
Нейропротекторный эффект курсового введения SkQR1
В следующей серии экспериментов изучали влияние SkQR1 при курсовом введении в более низкой дозе на способность корректировать последствия ишемического повреждения головного мозга. Крысам вводили по 0,1 моль/кг SkQR1 в день внутрибрюшинно в течение 5 дней. Первая инъекция производилась в момент начала реперфузии, остальные один раз в сутки в последующие 4 дня. При курсовом воздействии SkQR1 наблюдалась тенденция к снижению повреждения мозга на 7-е сутки после ОСМА (Рисунок 29A). Оценка неврологического статуса выявила спонтанное восстановление сенсомоторных функций после ишемического повреждения даже у крыс, получавших физиологический раствор. Тем не менее, у крыс, получавших SkQR1, наблюдалось более быстрое статистически значимое по сравнению с группой «ОСМА + Физ р-р» восстановление сенсомоторных функций, начиная с 3-го дня после операции. На 7-е сутки неврологический статус крыс, получавших SkQR1, был на 2 балла выше показателя группы «ОСМА + Физ р-р» (Рисунок 29Б).
Накопление SkQR1 в головном мозге
Для исследования прохождения SkQR1 через гематоэнцефалический барьер после внутрибрюшинного и интраназального введения было проанализировано его распределение в мозге с помощью тканевых срезов, приготовленных через час после введения SkQR1 в дозе 1 моль/кг различными путями. Флуоресценцию SkQR1 в срезах головного мозга изучали с помощью конфокальной микроскопии. В случае интраназального введения нами была отмечена равномерная флуоресценция в тканях мозга. Важно отметить, что SkQR1 закапывали только в одну ноздрю, и уровень флуоресценции в ипсилатеральном полушарии был выше, чем в контралатеральном. Данный факт свидетельствует о прямом проникновении SkQR1 в головной мозг после интраназальной инстилляции, минуя центральный кровоток через периневральные и периваскулярные пространства (Рисунок 30) [473]. После внутрибрюшинной инъекции общей флуоресценции SkQR1 в тканях головного мозга не наблюдалось за исключением ярких флуоресцирующих точек, по-видимому, соответствующих клеткам кровяных сосудов. Мы предполагаем, что при внутрибрюшинном введении гематоэнцефалический барьер препятствует проникновению SkQR1 в головной мозг.
Роль белка Miro1 в межклеточном транспорте митохондрий и в реализации нейропротекторных эффектов ММСК на модели экспериментальной ишемии головного мозга крысы
Как было показано выше, ММСК могут образовывать межклеточные контакты по типу туннелирующих нанотрубок и передавать по ним митохондрии нейронам и астроцитам, а также сокультивирование ММСК с нейральными клетками приводит к увеличению экспрессии белка Miro1 в ММСК. Miro1, помимо участия в процессах внутриклеточного транспорта также играет ключевую роль в межклеточном транспорте митохондрий [400]. Для проверки гипотезы о функциональной значимости межклеточного транспорта митохондрий для реализации нейропротекторных свойств ММСК нами была создана линия ММСК с суперэкспрессией Miro1 (Miro1-ММСК). Мы предположили, что увеличение количества белка Miro1 в ММСК будет приводить к повышению частоты событий межклеточного транспорта митохондрий в нейральные клетки.
Для проверки данной гипотезы нами проводились in vitro исследования, в которых оценивали число астроцитов, получивших митохондрии от ММСК при совместном их культивировании в течение 24 ч. Сокультивирование Miro1-ММСК с первичной культурой астроцитов в течение суток приводило к увеличению межклеточного транспорта митохондрий от ММСК к астроцитам в 2,5 раза по сравнению с нативными ММСК (Рисунок 81, P 0,05).
Следующим этапом являлось изучение роли белка Miro1 и транспорта митохондрий в реализации нейропротекторных эффектов ММСК на модели экспериментальной ишемии головного мозга крысы. Различий в объеме повреждения головного мозга на 14 сутки после моделирования ишемии/реперфузии между контрольной группой и группой, получившей трансплантацию нативных ММСК, не было выявлено. В группе ОСМА+Miro1-ММСК также не было статистически значимых отличий в объеме повреждения между группой ОСМА+Физ р-р, однако отмечалась тенденция в снижении объема повреждения на 15% (Рисунок 82А,Б). Оценку неврологического дефицита проводили в течение 14 суток. На первые сутки после моделирования фокальной ишемии в группе ОСМА+Физ р-р и ОСМА+ММСК наблюдались выраженные неврологические нарушения, оцененные в тесте «Постановка конечности на опору» в 1,5±0,2 и 2±0,4 балла, соответственно. Тогда как в группе ОСМА+Miro1-ММСК неврологический статус был равен 3,7±0,6 баллам, статистических различий между группой ОСМА+Физ р-р выявлено не было. Достоверные различия между контрольной группой и ОСМА+Miro1-ММСК были выявлены, начиная с 7 суток после ОСМА, а с группой ОСМА+ММСК – на 14 сутки. Также на 14 сутки после моделирования ишемии/реперфузии имелись статистически значимые различия между группами животных, получивших трансплантацию нативных ММСК и с гиперэкспрессией Miro1, при этом неврологический статус составлял 4,8±0,5 и 7,5±1,1 баллов, соответственно, тогда как в контрольной группе – 3,5±0,9 баллам (Рисунок 82В).
Таким образом, мы показали, что трансплантация ММСК через сутки после индукции ишемии/реперфузии головного мозга снижает объем повреждения и неврологические нарушения. Сделано предположение, что в основе нейропротекторных механизмов ММСК лежит способность образовывать межклеточные контакты по типу туннелирующих нанотрубок с нейральными клетками, приводящая к транспорту между клетками цитоплазматического содержимого и митохондрий. Транспорт митохондрий играет ключевую роль в проявлении нейропротекторных эффектов ММСК, поскольку сверхэкспрессия белка Miro1 в ММСК способствует увеличению межклеточного транспорта митохондрий и усилению нейропротекторных эффектов ММСК при экспериментальном ишемическом инсульте.