Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления об изменениях микробиоты толстой кишки у детей первого года жизни при формировании функциональных гастроинтестинальных расстройств (обзор литературы) 12
1.1. Структура микробиоты толстой кишки у детей первого года жизни и факторы, влияющие на становление кишечного гомеостаза 12
1.1.1. Значимость различных видов вскармливания у детей первого года жизни с функциональными гастроинтестинальными расстройствами 14
1.1.2. Роль индигенной микробиоты у детей первого года жизни в сохранении колонизационной резистентности толстой кишки 16
1.1.3. Характеристика наиболее значимых условно-патогенных бактерий, участвующих в формировании нарушений микробиоты толстой кишки у детей первого года жизни 22
1.2. Функциональные гастроинтестинальные расстройства у детей в критические периоды первого года жизни 28
1.3. Особенности микробиоты толстой кишки и взаимоотношений ассоциативных симбионтов у детей первого года жизни с функциональными гастроинтестинальными расстройствами 35
1.4. Принципы и методы лечения нарушений микробиоты толстой кишки у детей первого года жизни с функциональными гастроинтестинальными расстройствами 41
1.4.1. Бактериофагия как принцип патогенетически обоснованной коррекции нарушений микробиоты толстой кишки у детей первого года жизни с функциональными гастроинтестинальными расстройствами 42
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Материалы исследования .44
2.2. Методы исследований .49
2.2.1. Статистические методы .54
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 55
3.1. Изменение состояния индигенной микробиоты толстой кишки у детей с функциональными гастроинтестинальными расстройствами с учетом вида вскармливания 55
3.2. Характер взаимоотношений между различными вариантами E. coli с измененными свойствами в микробиоте толстой кишки у детей первого года жизни и их роль в формировании функциональных гастроинтестинальных расстройств с учетом вида вскармливания 62
3.3. Изменение состояния условно-патогенной микробиоты толстой кишки у детей с функциональными гастроинтестинальными расстройствами в зависимости от вида вскармливания .66
3.4. Роль и характер взаимоотношений условно-патогенных бактерий-ассоциантов в микробиоте толстой кишки у детей с функциональными гастроинтестинальными расстройствами в зависимости от вида вскармливания 73
3.5. Взаимовлияние представителей индигенной и условно-патогенной микробиоты на формирование микробиоценоза толстой кишки у детей первого года жизни с учетом вида вскармливания 76
3.6. Характеристика чувствительности к бактериофагам штаммов бактерий рода Klebsiella, как основного бактериального агента микробиоты толстой кишки у детей с функциональными гастроинтестинальными расстройствами в различные периоды первого года жизни 81
Заключение .87
Выводы .101
Список сокращений 103
Список литературы 104
- Роль индигенной микробиоты у детей первого года жизни в сохранении колонизационной резистентности толстой кишки
- Особенности микробиоты толстой кишки и взаимоотношений ассоциативных симбионтов у детей первого года жизни с функциональными гастроинтестинальными расстройствами
- Изменение состояния условно-патогенной микробиоты толстой кишки у детей с функциональными гастроинтестинальными расстройствами в зависимости от вида вскармливания
- Характеристика чувствительности к бактериофагам штаммов бактерий рода Klebsiella, как основного бактериального агента микробиоты толстой кишки у детей с функциональными гастроинтестинальными расстройствами в различные периоды первого года жизни
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Функциональные гастроинтестинальные расстройства (ФГИР) занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваний пищеварительного тракта у детей первого года жизни (Малолетняя С. В. и др., 2009; Богданова Н. М., 2013; Бельмер С. В., Хавкин А. И., Печкуров Д. В., 2016). Взаимоотношения макро- и микроорганизмов представляют важную проблему патологической физиологии, поскольку именно от них зависят развитие и регрессия различных патологических состояний (Урсова Н. И., 2011; Barbara G. et al., 2016).
Результаты экспериментальных и клинических исследований показали, что изменения состава кишечной микробиоты лежат в основе формирования кишечной диспепсии (Чередниченко Ю. В., 2015; Nino D. F. et al., 2016). У грудных детей микробиота кишечника характеризуется неустойчивостью, связанной с сукцессией, обусловленной неадекватным иммунным ответом организма на заселение кишечника условно-патогенными микроорганизмами (УПМ) (Ипатова М. Г. и др., 2010; Рыбальченко О. В., Бондаренко В. М., 2013; Cacho N., Neu J., 2014).
В патогенезе развития гастроинтестинальных расстройств важную роль играют нарушения симбиотических и антагонистических взаимоотношений бактерий индигенной и условно-патогенной микробиот, приводящие к увеличению доли патогенных микроорганизмов в кишечнике (Бухарин О. В., Кремлева Е. А., Сгибнев А. В., 2012; Белова И. В. и др., 2015; Беляева И. А. и др., 2017; Blanton L. V. et al., 2016; Reviera-Perez J. I., Gonzlez A. A., Toranzos G. A., 2016). В результате этого происходит изменение качественного состава индигенной и условно-патогенной микробиот, обеспечивая манифестацию клинической картины заболевания (Кешишян Е. С., Бердникова Е. А., Хавкин А. И., 2012; Янковский Д. С. и др., 2013; Булатова Е. М., Богданова Н. М., 2013; Patel M. P., 2015).
Следует отметить, что в формировании ФГИР у детей первого года жизни ведущую роль играют изменённая индигенная и агрессивная условно-патогенная микробиоты (Lopetuso L. R. et al., 2013).
В настоящее время известно, что существует взаимосвязь микробного разнообразия в кишечнике детей первого года жизни с различными видами вскармливания. При этом у детей, находящихся на грудном вскармливании, наблюдается высокий уровень колонизации толстой кишки условно-патогенными видами бактерий и особенно их ассоциациями, выделяемыми чаще и в более высоких титрах, чем у детей, находящихся на других видах вскармливания (Германенко И. Г., 2014; Hoen A. G. et al., 2015; Patel K. et al., 2015).
Установлено, что нарушения микробиоты кишечника, обусловленные увеличением концентраций УПМ с высокой активностью факторов персистенции, как правило, неэффективно поддаются коррекции и требуют длительного лечения бактериофагами, пробиотическими препаратами и, при необходимости, антибиотиками (Габриэлян М. И. и др., 2011; Николаева И. В., Купчихина Л. А., 2013; Bernaola A. G. et al., 2010; Backhed F. et al., 2015).
В связи с этим для разработки патогенетически обоснованной терапии дисбиотических состояний толстой кишки у детей первого года жизни с ФГИР необходимо оценить биологические свойства и характер взаимоотношений микроорганизмов индигенной и условно-патогенной микробиот (Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я., Хуснутдинова Л. М., 2003, 2012; Madan J. C. et al., 2012; Sha S. et al., 2013).
Цель исследования: установление роли нарушений состава микробиоты толстой кишки при формировании функциональных гастроинтестинальных расстройств у детей первого года жизни при различных видах вскармливания для патогенетического обоснования принципов их коррекции.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Установить особенности индигенной микробиоты толстой кишки у детей с функциональными гастроинтестинальными расстройствами в различные периоды первого года жизни с учётом вида вскармливания.
-
Определить состав условно-патогенных бактерий-ассоциантов при формировании патологической микробиоты толстой кишки у детей первого года жизни с функциональными гастроинтестинальными расстройствами с учётом вида вскармливания.
-
Оценить характер симбиотических и антагонистических взаимоотношений различных ассоциаций бактерий микробиоты толстой кишки детей первого года жизни с функциональными гастроинтестинальными расстройствами в зависимости от вида вскармливания.
-
Установить уровень чувствительности штаммов бактерий рода клебсиелл к специфическим бактериофагам у детей первого года жизни с функциональными гастроинтестинальными расстройствами для патогенетического обоснования принципов коррекции нарушений микробиоты толстой кишки.
Научная новизна работы
Доказано, что ведущую роль в патогенезе ФГИР у детей в различные периоды первого года жизни, находящихся как на грудном, так и на смешанном вскармливании, играют микроэкологические нарушения биоценоза кишечника, приводящие к увеличению доли УПМ и формированию патологической микробиоты.
Приоритетными являются данные о том, что ФГИР у детей в возрасте до 6 месяцев ассоциированы с изменениями микробиоты кишечника, проявляющимися дисбалансом состава индигенной микрофлоры за счёт замещения полноценных эшерихий и дефицитом бифидобактерий, в том числе и увеличением доли ассоциаций аномальных эшерихий независимо от вида вскармливания.
Установлено, что значимую роль в патогенезе ФГИР у детей, находящихся на грудном вскармливании, играет преобладание микроорганизмов-антагонистов (S. aureus + Clostridium spp. в период до 3 месяцев; S. aureus + Enterobacter spp. в период 3–6 месяцев и S. aureus + Candida spp. в период 6–12 месяцев), тогда как у детей на смешанном – микроорганизмов-симбионтов (в возрасте 3–12 месяцев доминируют Klebsiella spp., Clostridium spp., S. aureus).
Важными являются данные, что наиболее выраженные патологические нарушения микробиоценоза толстой кишки у детей с ФГИР, находящихся на грудном вскармливании, в возрасте от трёх до шести месяцев характеризуются снижением концентрации микроорганизмов индигенной микробиоты, что обусловлено сменой взаимоотношений не только у микроорганизмов индигенной, но и условно-патогенной микробиот.
Впервые установлено, что штаммы K. pneumoniae имеют большую чувствительность (в два раза) к действию бактериофагов клебсиелл пневмоний и секста, выделенных у детей с ФГИР в возрасте от трёх до шести месяцев, по сравнению со штаммами K. oxytoca аналогичного периода. Показано, что 80 % штаммов бактерий рода Klebsiella, выделенных из толстой кишки у детей с ФГИР, обладают резистентностью к бактериофагам, что может являться одной из причин неэффективного использования данных препаратов.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты настоящей работы вносят дополнительный вклад в теорию адаптации макроорганизма к изменениям микробиоты кишечника при ФГИР у детей первого года жизни.
Учитывая патогенетическую значимость дисбаланса индигенной и условно-патогенной микробиот в обеспечении общего гомеостаза организма при прогрессировании функциональных расстройств (ФР) в толстой кишке у детей первого года жизни, необходима
своевременная оценка проявлений изменённой микробиоты кишечника и её коррекция с помощью бактериофагии.
Полученные результаты могут быть использованы при составлении клинических рекомендаций для практического здравоохранения, в разработке новых протоколов лечения ФГИР у детей и при прогнозировании дисбиоценотических нарушений в микробиоте кишечника. В случае выделения бактерий Klebsiella spp. из микробиоты толстой кишки у детей первого года жизни, и особенно K. oxytoca, для её коррекции необходимо определять чувствительность к специфическим бактериофагам для подавления патогенной микрофлоры.
Методология и методы исследования
Использованы бактериологические методы (определение степени чувствительности штаммов бактерий рода Klebsiella к бактериофагам, расчёт коэффициента сходства Жаккара как методики установления совместимости видов и их взаимоотношений) и статистические методы исследования.
Положения, выносимые на защиту:
-
У детей с функциональными гастроинтестинальными расстройствами, находящихся на грудном вскармливании, микробиота толстой кишки в период от рождения до трёх месяцев характеризуется увеличением концентраций патогенной индигенной и условно-патогенной микрофлоры; от трёх до шести месяцев – стабилизацией патогенной индигенной и снижением концентрации условно-патогенной; от шести до двенадцати месяцев – увеличением концентраций условно-патогенных бактерий и стабилизацией изменённых свойств у представителей индигенной микробиоты.
-
В толстой кишке детей с функциональными гастроинтестинальными расстройствами, находящихся на смешанном вскармливании, в период 3–6 месяцев микробиота толстой кишки характеризуется перестройкой, заключающейся в увеличении концентраций условно-патогенной и подавлении нормальной индигенной, а в 6–12 месяцев – в снижении агрессивности условно-патогенной и увеличении концентраций нормальной индигенной.
-
Важную роль в патогенезе функциональных гастроинтестинальных расстройств у детей первого года жизни, находящихся как на грудном, так и на смешанном вскармливании, играют ассоциации условно-патогенных бактерий, оказывающих негативное воздействие на микробов-ассоциантов индигенной микробиоты, угнетая нормальных симбионтов и увеличивая микробную плотность бактерий с аномальными свойствами.
Степень достоверности и апробация результатов работы
Научные положения и выводы обоснованы достаточным объёмом исследований, выполненных с использованием современных методов, сертифицированного оборудования и реактивов. Статистическая обработка полученных результатов проведена с помощью пакета современных статистических компьютерных программ.
Апробация материалов диссертации проведена на заседаниях Учёного совета ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Роспотребнадзора Сибирского региона «Диагностика, профилактика и надзор за природно-очаговыми и другими инфекционными болезнями» (Иркутск, 2013); III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Развитие физико-химической биотехнологии на современном этапе», посвящённой 35-летию кафедры физико-химической биологии ИГУ и 95-летию Иркутского государственного университета (Иркутск, 2013); IV Межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за инфекционными заболеваниями» (Иркутск, 2013);
Всероссийской научно-практической конференции, посвящённой 20-летию кафедры профилактической медицины ФПКВ ГБОУ ВПО НИЖГМА Минздрава России (Нижний Новгород, 2013); Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Здоровье и экология населения» (Иркутск, 2015); 83-й Всероссийской Байкальской научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием, посвящённой 140-летию со дня рождения профессора Н. Д. Бушмакина «Актуальные вопросы современной медицины» (Иркутск, 2016); конференции с международным участием «Научно-методические проблемы нормальной физиологии и медицинской физики», посвящённой 80-летию кафедр нормальной физиологии и медицинской физики Московского государственного медико-стоматологического университета имени А. И. Евдокимова (Москва, 2017).
Публикации
По материалам выполненных исследований опубликовано 16 печатных работ, из них 12 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, общего заключения и выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 8 рисунками. Библиографический указатель включает 215 источников, из которых 72 публикации иностранных авторов.
Личный вклад автора
Автору работы принадлежит ключевая роль в проведении исследования, анализе и обсуждении полученных результатов, апробации результатов исследования, подготовке основных публикаций по выполненной работе.
Роль индигенной микробиоты у детей первого года жизни в сохранении колонизационной резистентности толстой кишки
Главное место с стуктуре кишечной микробиоты занимают представители индигенной микробиоты толстой кишки человека – бифидобактерии, лактобактерии, эшерихии и энтерококки.
Различные штаммы бифидобактерий и бактероиды появляются в ЖКТ спустя 10 дней после рождения и достигают микробного числа 108 -109 КОЕ/гр. Бифидобактерии в виде грампозитивных палочек с облигатными анаэробными свойствами в толстой кишке детей составляют около 95% популяции бактерий. Отмечено, что у детей, находящихся только на естественном вскамливании, в микробиоте кишечника преобладают бифидобактерии, с чем связывают меньший риск развития гастроинтестинальных расстройств (Копанев Ю.А., Соколов А.Л., 2008).
Согласно данным Урсовой Н.И. (2005), олигосахариды, являющиеся одним из наиболее важных компонентов грудного молока, считаются естественным бифидогенным фактором и обладают способностью влиять на характер кишечной микробиоты детей первого года жизни. Олигосахариды, доходящие в неизменном виде до толстой кишки, подвергаются процессу ферментации бифидобактериями, в результате чего образовавшаяся молочная кислота и короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) воздействуют на консистенцию кала и частоту актов дефекации (Cenit M.C. et al., 2015). У детей, находящихся на грудном вскармивании, рН кала ниже, чем у детей, получающих искуственные смеси. Подавление роста патогенных бактериальных агентов происходит благодаря высокой кислотности кала (Ардатская М.Д., 2009: Урсова Н.И., 2011).
Бифидобактерии выполняют защитные и трофические функции. Продукты жизнедеятельности бифидобактерий являются питательным материалом для эпителиальных клеток толстой кишки. Бифидобактерии питаются метаболитами лактофлоры, потому так важно их равновесие и оптимальное присутствие в биопленке ЖКТ. Являясь сахаролитическими микробами, бифидобактерии выделяют большое количество кислых продуктов. Образующаяся молочная, уксусная кислоты способствуют усилению всасывания ионов кальция, железа, витамина D. Значительное количество выделяемых бифидобактериями лизоцима, бактериоцинов, спиртов и высокая антагонистическая активность по отношению к патогенным бактериям препятствуют проникновению микробов в верхние отделы ЖКТ. У бифидобактерий отмечают высокую способность к синтезу аминокислот, белков, витаминов группы В, которые затем всасываются в кишечнике. Поэтому при стойких, тяжелых нарушениях функций бифидобактерий может развиваться комплекс белково-витаминно-минеральной недостаточности. Они препятствуют микробному декарбоксилированию пищевого гистидина и повышению количества гистамина (Корниенко Е.А., Нетребенко О.К., Украинцев С.Е., 2009; Николаева И.В. и др., 2012).
Лактобактерии заселяют организм новорожденного ребенка в антенатальном и раннем постнатальном периоде и определяются через несколько дней после рождения и у 75–100 % грудных детей, составляя 1 млрд микробных клеток в 1 г испражнений (Ракова Е.Б., 2012; Приворотский В.Ф., Луппова Н.Е., 2012). Дети, рожденные путем кесарева сечения, имеют значительно более низкое содержание лактобактерий, чем появившиеся естественным путем (Копанев Ю.А., Соколов А.Л., 2008). Лактобактерии – грампозитивные, неспорообразующие неподвижные палочки, преимущественно анаэробы. Они присутствуют во всех отделах пищеварительного тракта и выполняют защитную функцию. Род лактобактерий включает 44 вида, из них основными являются L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. fermentum. У детей, находящихся на грудном вскармливании доминирующим видом является L. infantis, синтезирующие холестерин, ответственный за развитие головного мозга на данном этапе.
Подавление гнилостных, гноеродных микробов и антибактериальная активность лактобактерий связаны с выработкой молочной кислоты, спирта и лизоцима, продуктов с высокой антибиотической активностью, интерферонов, интерлейкина 1, ряда других факторов неспецифической защиты. Исчезновение лактобактерий приводит к сдвигу реакции среды в щелочную сторону, резко снижая утилизацию кишечником биологически активных соединений (Зюбр Т.П., Мурашкина И.А., Васильев И.Б., 2008; Morelli L. et al., 1998).
Наряду с бифидо- и лактобактериями группу нормальных кислотообразователей составляют анаэробные пропионибактерии. Снижая рН окружающей среды, пропионибактерии проявляют антагонистические свойства в отношении патогенных и УПМ (Приворотский В.Ф., Луппова Н.Е., 2012).
Бактерии Е. соli и стрептококки можно обнаружить в ЖКТ уже через несколько часов после рождения. В кишечнике человека представители рода эшерихий появляются в первые дни после рождения в количестве 107-108 колоний образующих единиц на 1 грамм (КОЕ/г) фекалий и сохраняются на протяжении жизни на этом уровне (Отраслевой стандарт, 2003). В копроматериале здорового человека кишечные палочки (типичные, полноценные или иначе с нормальной ферментативной активностью) выявляются в количестве 107–108 КОЕ/г, при этом кишечные палочки с гемолитической активностью (ГА) должны отсутствовать. Кроме того, в человеческом организме встречается кишечная палочка со сниженной ферментативной активностью (СФА). Численность таких грамнегативных бактерий не должна превышать 10% от общего количества найденной микрофлоры. Кишечная палочка с СФА – неполноценная E. coli, которая не способна нанести организму никакого вреда, но и не приносит пользы. Если анализы показывают повышенное число данных микроорганизмов, то это может свидетельствовать о начале дисбактериоза, так как подобная картина характерна для дисбактериоза 2, 3 и 4 стадии (Ильина Н.А., Карпеева Е.А., Гусева И.Т., 2008; Иванова Е.И., 2014). Кишечные палочки являются основными конкурентами УПМ в отношении заселения ими кишечника (Байко С.В., 2007). Они вместе с бифидо- и лактобактериями препятствуют ее размножению. Кишечные палочки забирают из просвета кишечника кислород, который вреден для полезных для человека бифидо- и лактобактерий. E.coli вырабатывают ряд необходимых для человека витаминов: В1, В2, В3, В5, В6, В9, B12, К, участвует в обмене холестерина, билирубина, холина, желчных и жирных кислот, оказывает влияние на всасывание железа и кальция, способствует гидролизу лактозы, продуцирует антибиотикоподобные вещества, тормозящие рост патогенной кишечной палочки, а также участвует в создании местного, кишечного иммунитета (Осадчук М.А., Осадчук М.М., 2010; Ильина Н.А., Карпеева Е.А., Гусева И.Т., 2008; Carvalho F.A. et al., 2009). Некоторые штаммы эшерихий продуцируют колицины, которые тормозят рост энтеропатогенных штаммов кишечной палочки (Hoen A.G. et al., 2015). Эти свойства обусловлены, в первую очередь, механизмом синтеза секреторных иммуноглобулинов в кишечнике. Эшерихии принимают участие в синтезе витамина К, обеспечивая гемостатические процессы (Chow J. et al., 2010).
Нормальная кишечная микробиота в организме ребенка выполняет важнейшие физиологические функции, что позволяет рассматривать ее как отдельный метаболический орган (Куяров А.А., 2015). Прежде всего, она препятствует колонизации пищеварительного тракта факультативными и патогенными микроорганизмами, обеспечивая защитную функцию, в основе которой лежит принцип микробного антагонизма. Колонизационная резистентность обеспечивается конкуренцией за питательные вещества и рецепторы для адгезии, изменения уровня рН, выработки бактериоцинов и других веществ с противомикробной активностью. Нормальная микрофлора также обладает способностью распознавания и элиминации вирусов, что позволяет обеспечивать противовирусную защиту макроорганизма.
Бифидо-, лактобактерии и энтерококки обеспечивают гиполипидемический и гипотензивный эффекты путем деконъюгации солей желчных кислот, ассимиляции и преципитации холестерина, снижения активности тканевого ангиотензинпревращающего фермента. Нормальная микрофлора участвует в синтезе аминокислот, витаминов группы В, РР, К, С, биотина, пантотеновой кислоты, гормонов, антибиотических и других веществ, способствует всасыванию ионов железа, кальция, витамина D.
Сахаролитические микроорганизмы – бифидобактерии, лактобациллы, Enterococcus faecalis – производят большое количество активных углеводных ферментов, способствующих расщеплению растительных полисахаридов, пищевых волокон до КЦЖК (бутирата, пропионата, ацетата) (Сугян Н.Г., 2010).
Особенности микробиоты толстой кишки и взаимоотношений ассоциативных симбионтов у детей первого года жизни с функциональными гастроинтестинальными расстройствами
В онтогенезе в равных соотношениях с первого часа жизни участвуют аэробные и анаэробные микроорганизмы. Процесс нарастания анаэробной флоры идет параллельно с ростом оппортунистических микроорганизмов, минуя «стадию трансформации». Согласно данным ряда авторов в 92% случаев оппортунистические микроорганизмы в значимых количествах выделяют у здоровых детей в возрасте от месяца до года, в то время как у больных в тот же временной промежуток происходит резкое снижение частоты встречаемости представителей анаэробной части флоры – лакто- и бифидобактерий. Например, в возрасте от 1 до 11 месяцев частота выделения УПМ варьирует от 30,0% до 91,6% случаев.
Согласно исследованию Беловой И.В. и соавт. (2015), установлено, что суммарная численность сообществ симбиотических микроорганизмов у «здоровых» людей на один – два порядка выше, чем у больных. Возникновение патологического процесса можно объяснить не количеством выделяемых УПМ, а их измененными свойствами и подавлением лакто- и бифидобактерий (Белова И.В. и др., 2015). Выделямые из кишечной микробиоты у детей первого года жизни лакто- и бифидобактерии, Е.coli, Enterococcus spp., S. epidremidis, S. aureus, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Proteus spp., Enterobacter spp. определяют как информационно значимые критерии, которые могут быть использованы в процедурах скрининга и диагностики дисбиотических состояний. Процесс нарастания лакто- и бифидобактерий идет параллельно с ростом УПМ (Patel M.P., Denning M.P., 2015).
Наиболее важным показателем для нормального функционирования ЖКТ является наличие кислотообразующих бактерий в кишечнике детей. Снижение абсолютной концентрации пропионовой кислоты указывает на угнетение основных продуцентов кислоты (Veilonella, Propionibacterium, Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium и др.) или избыток соответствующих субстратов (сахара, крахмал, пектины), вызванный недостаточностью переваривания в верхних отделах ЖКТ или ферментопатией. Пропионовая кислота регулирует микроциркуляцию в слизистой оболочке кишечной стенки, поддерживает трофические процессы, участвует в глюконеогенезе и синтезе биогенных аминов, блокирует адгезию патогенов. Основными представителями протеолитической микрофлоры являются: Bacteroides, Proteus, Clostridium, E. coli, Enterobacter. Данные микроорганизмы с участием протеаз и уреаз расщепляют пищевой белок до токсичных аминов, фенолов, индолов, аммиака и других продуктов, которые всасываются и метаболизируются в печени, превращаясь в нетоксичные соединения. Масляная кислота – энергосубстрат для эпителиоцитов толстой кишки. Показатели валериановой кислоты, продуцируемой клостридиями, пептококками и пептострептококками характеризуют протеолитическую активность микрофлоры, гипопротеинемию, дефицит аминокислот в кишечнике, поступление в толстый кишечник белков, недостаточно предподготовленных для микробной ферментации. Низкие показатели данного критерия отмечают в 100% случаев у детей с запорами (Комарова Е.В., 2010; Осадчук М.А., Балашов Д.В., Осадчук М.М., 2015). Появление УПМ, их гиперколонизацию регистрируют на фоне снижения маслянокислого и пропионовокислого брожения, а также на фоне повышения доли уксуснокислого ферментирования.
Таким образом, наиболее информативными в патогенезе нарушений ЖКТ у детей первого года жизни на фоне сниженной индигенной микробиоты являются грамнегативные представители сем. Enterobacteriaceae (кишечная палочка, клебсиелла, протей, энтеробактер, цитробактер) и грампозитивные представители кокковой флоры – золотистый и эпидермальный стафилококки, энтерококки. Следует отметить, что необходимо учитывать не только изменение свойств и состава микробиоты представителей условно-патогенной микрофлоры толстой кишки, но и метаболическую активность дианостически значимых УПМ, для предотвращения усугубления клинической картины ФГИР.
Бухариным О.В. с соавт. (2009, 2010, 2011) взаимодействие человека и микроорганизмов предложено рассматривать с позиции ассоциативного симбиоза (Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгибнев А.В., 2012;).
Симбиотические ассоциации – это форма существования микроорганизмов в экологических нишах. Это понятие включает в себя организм человека в качестве макропартнера, стабильный доминантный микросимбионт (нормальную, индигенную микробиоту) и минорные ассоциированные микросимбионты (условно-патогенные микроорганизмы) с разнонаправленными воздействиями, определяющими формирование, стабильность существования и продуктивность симбиоза в целом.
Доминантная микрофлора оказывает мутуалистическое влияние на организм макросимбионта, включение же в этот симбиоз ассоциативных микросимбионтов может иметь разные последствия для макроорганизма. Это связано с тем, что межмикробные взаимодействия внутри ассоциаций – от синергизма до антагонизма – могут изменять биологические свойства микробов (Бондаренко В.М., 2013; Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгибнев А.В., 2012).
Нарушение стабильности ассоциативного симбиоза вследствие качественных и количественных изменений доминантной и ассоциативной микрофлоры может привести к развитию дисбиотических изменений и формированию хронических персистирующих инфекционно-воспалительных заболеваний человека. По данным Ю.В. Захаровой, при изменении ассоциативного симбиоза в сторону аллохтонной микрофлоры за счет антагонизма и последующей интерференции доминантного микросимбионта происходит формирование совершенно новых типов микробных ассоциаций, крайне нежелательных для макроорганизма (Захарова Ю.В., 2010). Самым многочисленным как по видовому разнообразию, так и в количественном отношении является ассоциативный симбиоз микробных сообществ толстой кишки. Популяции микроорганизмов, вступая в конкурентные или кооперативные взаимоотношения при заселении различных органов и тканей, формируют его специфический микросимбиоценоз (Габидуллин З.Г., Ахтариева А.А., 2006; Backhed F. et al., 2015). В микробных сообществах, относящихся к нормальной микробиоте человека, эволюционно сформировались межклеточные кооперации. Эти межклеточные взаимоотношения образуют систему трофических и энергетических взаимосвязей внутри кишечной микробиоты. Практически ни один биосубстрат, находящийся в распоряжении того или иного микробного эпитопа, не используется только в интересах одной популяции микроорганизмов (Гриневич В.Б., Захаренко С.М., Осипов Г.А., 2008).
До настоящего времени дискутируется вопрос о роли отдельных видов УПМ в формировании нормальной микробиоты человека, участии их в этиологии и патогенезе ряда заболеваний (Шендеров Б.А. и др., 2016). В частности, нуждаются в углублении и детализации научные исследования по роли отдельных УПМ, а также их ассоциаций, наиболее часто формирующих дисбиоз (Стоян М.В., 2016). Способность к продукции токсинов является одной из основных характеристик, вызывающих поражение пищеварительного тракта, при котором ведущее место занимают не УПМ, а представители индигенной микробиоты, такие как кишечная палочка. Под воздействием различных факторов данный вид микроорганизма изменяет свои свойства на патогенные – появляются аномальные, измененные свойства – гемолитическая и слабоферментативная активность (Иванова Е.И., 2014).
Изучение особенностей межмикробных взаимодействий в ассоциациях бактерий определенного биотопа, включающее не только оценку модификации роста и размножения симбионтов, но и изменение уровня экспрессии факторов их патогенности и персистенции, может позволить получить новые знания по механизму формирования микросимбиоценозов при разных формах инфекционного процесса, предложить критерии диагностики нормо- и патоценоза, открывает перспективы биорегуляции персистентного потенциала микроорганизмов (Бухарин О.В., 2009). Поражение кишечника при сочетанных инфекциях в основном связано с токсинами, которые считаются основным фактором патогенности, вызывающих пищевые отравления и энтероколиты у детей грудного возраста (Кунилова Е.С. и др., 2012; Николаева И.В., Купчихина Л.А., 2013). Наиболее существенными для изменения патогенности УПМ являются генетические рекомбинации, которые определяют геномную пластичность бактерий, реализуемую через несколько конкретных механизмов, связанных, в частности, с «островами» и «островками» патогенности (Бурганова Р.Ф., Потатуркина-Нестерова Н.И., Немова И.С., 2011). Именно интеграция, стабилизация и экспрессия генов вирулентности лежат в основе формирования новых патогенных свойств бактерии (Егорова С.А., Макарова М.А., Кафтырева Л.А., 2011; Николаева И.В., 2013).
Изменение состояния условно-патогенной микробиоты толстой кишки у детей с функциональными гастроинтестинальными расстройствами в зависимости от вида вскармливания
Как известно, УПМ при определенных условиях становятся патогенными, при этом происходит не только изменение количественных, но и качественных характеристик агрессивных для микробиоты кишечника бактериальных агентов, что в свою очередь может быть ассоциировано с развитием и усугублением ФР у детей первого года жизни.
При регистрации микроорганизмов условно-патогенной биоты установлено, что у детей в толстой кишке, находящихся на грудном вскармливании, преобладают следующие УПМ – Klebsiella spp. от 39,2 до 96,2% в возрасте 6–12 месяцев, S. аureus – от 38,5 до 50,1% случаев в возрасте до трех месяцев. В трех периодах первого года жизни из кишечного микробиоценоза детей в высокой концентрации выделяли клостридий – до 51,9% случаев, энтеробактер – до 9,4% случаев, цитробактер – до 15,4% случаев, грибки рода Candida – до 17,3%. С меньшей частотой регистрировали протеи (до 15,4%) и синегнойную палочку (до 5,8% случаев). Представленные данные рассчитаны при помощи z- критерия (табл. 11).
Таким образом, у детей в возрасте 3–6 месяцев происходило снижение доминантных представителей УПМ в кишечном биотопе почти в два раза (клебсиеллы, золотистый стафилококк, клостридии, дрожжеподобные грибы Candida), а к концу первого года жизни (6–12 месяцев) вновь регистрировали высокие показатели УПМ (более чем в два раза).
Для кишечной микробиоты у детей, находящихся как на смешанном вскармливании, так и на грудном, характерно снижение частоты встречаемости доминантных УПМ в два раза – клебсиелл (50,6%), золотистого стафилококка (38,9%) и клостридий (20,8%). Полученные результаты имеют статистически значимые отличия как при сравнении периодов первого года жизни, так и при сравнении по характеру питания детей с ФГИР (р0,05). Представленные данные рассчитаны при помощи z критерия (табл. 12).
Таким образом, у детей с ФГИР, находящихся на грудном вскармливании, в возрасте 3–6 месяцев выявлены наиболее критические показатели концентраций УПМ, что может быть связано с процессом формирования собственного иммунитета.
При оценке показателей условно-патогенной микробиоты отмечены следующие особенности: возраст до 3 месяцев у детей с ФГИР (грудное вскармливание) характеризовался наличием двухкомпонентных ассоциаций, доминирующими видами из которых были S. aureus в сочетании с грибами рода Candida (4,9%) и клостридиями (10,3% случаев), Proteus spp. (в 0,9%) и Klebsiella spp. в ассоциациях с золотистым стафилококком (50,1%) и костридиями (23,5%). В возрасте 3–6 месяцев доминируют ассоциации Klebsiella spp. с S. aureus (38,5%) и Clostridium spp. (15,4%), как и в 6-12 месяцев в 48,1 и 51,9% случаев соответственно.
Выявлены статистически значимые отличия при сравнении показателей между периодами. Представленные данные рассчитаны при помощи z критерия (табл. 13).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о микробном биоразнообразии и симбиотических связях УПМ, выделенных у детей первого периода. Вследствие этого происходит увеличение концентрации условно-патогенных и патогенных бактериальных агентов.
Отмечено, что у детей, находящихся на смешанном вскармливании в возрасте 3–6 месяцев доминируют ассоциации Klebsiella spp. + S. aureus (56,7%) и Clostridium spp. (31,5%), а также ассоциация S. aureus + Clostridium spp. (18,9%). У детей второго полугодия в микробиоценозе толстой кишки также доминируют ассоциации Klebsiella spp. + S. aureus (38,9%) и Clostridium spp. (20,8%). Получены статистически значимые различия при сравнении представителей кишечной микробиоты между периодами и грудным типом вскармливания (табл. 14). Д – дефицитные показатели, свн – сверхнормативные показатели (согласно Отраслевому стандарту, 2003); 1 – различия статистически значимы при р0,05 у детей 3–6 месяцев по сравнению с периодом 6–12 месяцев; 2 – различия статистически значимы при р0,05 у детей от рождения до трех месяцев, находящихся на грудном вскармливании по сравнению с периодом 3–6 месяцев у детей, находящихся на смешанном вскармливании; 3 – различия статистически значимы при р0,05 у детей 3–6 месяцев, находящихся на грудном вскармливании по сравнению с периодом 3–6 месяцев у детей, находящихся на смешанном вскармливании; 4 – различия статистически значимы при р0,05 у детей 6–12 месяцев, находящихся на смешанном вскармливании по сравнению с периодом 6–12 месяцев у детей, находящихся на грудном вскармливании; 5 – различия статистически значимы при р0,05 у детей 6–12 месяцев, находящихся на смешанном вскармливании по сравнению с периодом до трех месяцев у детей, находящихся на грудном вскармливании (z критерий).
Полученные данные характеризуют микробиоту кишечника у детей с ФГИР на смешанном вскармливании увеличением микробной плотности доминирующих видов – S. аureus, клостридий, грибков рода Candida. Данные изменения характеризуются сменой характера питания ребенка, что впоследствии будет сказываться на формировании иммунитета.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о снижении количественного и качественного состава УПМ в кишечной микробиоте детей с ФГИР. Данный факт связан с началом функционирования собственного иммунитета, восстановлением индигенной микробиоты и угнетением патогенной.
Характеристика чувствительности к бактериофагам штаммов бактерий рода Klebsiella, как основного бактериального агента микробиоты толстой кишки у детей с функциональными гастроинтестинальными расстройствами в различные периоды первого года жизни
Для штаммов K. oxytoca, выделенных у детей в возрасте от рождения до трех месяцев характерно уменьшение частоты встречаемости фагоустойчивых штаммов. У детей до трех месяцев с ФГИР было выделено 76,2% резистентных (R) штаммов к бактериофагу поливалентному, 3–6 месяцев – 75,2%, и 6–12 месяцев – 67,8% (p 0,05).
Умеренную чувствительность к данному бактериофагу имели 23,8% штаммов, выделенных у детей в возрасте до трех месяцев, 26,8% штаммов – в возрасте 3–6 месяцев и 32,2% штаммов – в возратсе 6–12 месяцев. Следует отметить, что с увеличением возраста детей прослежено незначительное увеличение частоты выделения штаммов с умеренной чувствительностью (от 23,8 до 32,2% случаев) (рис. 4).
С увеличением возраста детей (от рождения до 3–6 месяцев) наблюдали увеличение частоты встречаемости штаммов K. oxytoca устойчивых к действию бактериофага секста – от 61,9 до 75,0%, а у детей в 6–12 месяцев происходит снижение частоты встречаемости устойчивых штаммов в полтора раза – 51,7%. При этом возрастает доля штаммов K. оxytoca с умеренной чувствительностью к секстафагу почти в два раза – до 38,1% случаев у детей до 3 месяцев и в 43,3% случаев у детей 6–12 месяцев. Установлено, что у детей первого года жизни ни в одном возастном периоде не были зарегистрированы штаммы с высоким уровнем чувствительности (S) к специфическим бактериофагам – поливалентному и секста.
Установлено, что во все периоды первого года жизни у детей выделенные штаммы бактерий K. оxytoca характеризовались низким уровнем чувствительности к специфическим лечебным бактериофагам. Доля выявленных фагорезистентных штаммов K. oxytoca при действии бактериофага поливалентного практически не изменялась во всех возрастных периодах и составила 70%. Однако при действии бактериофага секста во втором периоде происходит увеличение доли фагоустойчивых штаммов K. oxytoca (до 75%) и ее снижение в третьем периоде (p 0,05).
Полученные данные свидетельствуют о низком уровне чувствительности штаммов K. oxytoca к бактериофагам трех видов. При тестировании штаммов K. pneumoniae аналогичного периода (от рождения до трех месяцев) наблюдается снижение регистрации фагоустойчивых штаммов бактерий при активности бактериофага клебсиелл пневмоний (до 64,5%), и, соответственно, увеличение доли штаммов с умеренной чувствительностью (до 33,9%) к действию данного бактериофага. У детей с ФГИР в возрасте до трех месяцев также характерно появление чувствительных штаммов K. pneumoniae к бактериофагу поливалентному (в 0,8% случаев) и бактериофагу клебсиелл пневмоний (в 1,6% случаев) (p 0,05) (рис. 5).
Были детектированы 64,5% устойчивых штаммов к действию бактериофага клебсиелл пневмоний, выделенных у детей с ФГИР в возрасте до 3 месяцев, 57,7% штаммов – в возрасте 3–6 месяцев, и 65% штаммов – в возрасте 6–12 месяцев. Умеренный уровень чувствительности к данному бактериофагу имели 33,9% штаммов K. рneumoniae, выделенных у детей от рождения до 3 месяцев, 42,3% – 3–6 месяцев, и 35,0% штаммов – 6–12 месяцев. У детей с ФГИР от рождения до трех месяцев зарегистрированы штаммы бактерий с высоким уровнем чувствительсти (S) к действию данного бактериофага – 1,6% штаммов (p0,05). Показано, что у детей 3–6 месяцев снижается частота выделения устойчивых штаммов K. pneumoniae (от 64,5 до 57,7%), и повышается частота встречаемости штаммов с умеренной чувствительностью к бактериофагу клебсиелл пневмоний (от 33,9 до 42,3%). Однако в толстой кишке детей с ФГИР от 6 до 12 месяцев, наоборот, повышается доля фагоустойчивых штаммов бактерий (до 65,0%), и снижается доля штаммов с умеренной чувствительностью (до 35,0%).
В период 3–6 месяцев у детей с ФГИР при действии трех видов бактериофагов на штаммы K. oxytoca, выделенных из кишечника, показатели детекции фагорезистентных штаммов практически не изменяются (от 75 до 77% штаммов), равно как и показатели штаммов с умеренной чувствительностью (от 22 до 26% случаев). Однако, при сравнении с аналогичным периодом, но при действии бактериофагов на штаммы K. pneumoniae происходит увеличение частоты встречаемости штаммов с умеренной чувствительностью к бактериофагу клебсиелл пневмоний (до 42,3% штаммов) и секстафагу (до 45,9% штаммов).
Возраст 3–6 месяцев характеризовался для выделенных штаммов K. oxytoca и K. pneumoniae снижением частоты встречаемости устойчивых к бактериофагам штаммов бактерий и увеличением доли штаммов с умеренной чувствительностью (почти в половине случаев – до 45,2%) (р 0,05).
Полученные нами данные показывают, что высокий уровень чувствительности наблюдался лишь в 2,4% случаев у штаммов K. pneumoniae, выделенных у детей с ФГИР в возрасте до трех месяцев. При дисбиозе во втором периоде происходит адаптация бактерий K. oxytoca ко всем трем видам бактериофагов, в третьем периоде преобладают штаммы уже с более высоким уровнем чувствительности к бактериофагам для обоих видов бактерий (до 45,2% штаммов к действию секстафага).
С увеличением возраста происходит снижение выделения фагорезистентных штаммов K. pneumoniae к действию секстафага – от 72,1% штаммов, выделенных у детей до трех месяцев, 54,1% штаммов – 3–6 месяцев, и 54,8% штаммов 6–12 месяцев. В периоде от рождения до трех месяцев выделяется 27,9% штаммов с умеренной чувствительностью к действию данного бактериофага, 45,9% штаммов – 3–6 месяцев, и 45,2% штаммов у детей 6–12 месяцев. Активность бактериофага клебсиелл пневмоний, специфичного для штаммов K. рneumoniae, показала статистически значимые различия по сравнению с действием бактериофага поливалентного на штаммы K. оxytoca (p0,05). Показано, что при действии бактериофага клебсиелл пневмоний регистрируются штаммы бактерий рода Klebsiella с высоким уровнем чувствительности – в 1,6% случаев. Период 6–12 месяцев у детей с ФГИР характеризуется увеличением доли штаммов K. pneumoniae с умеренным уровнем чувствительности к бактериофагам клебсиелл пневмоний и секста – 42,3 и 45,9% штаммов соответственно.
Данные, полученные при расчете критерия 2, представлены в таблице 19.
Показано, что статистически значимых различий при сравнении чувствительности штаммов Klebsiella spp. к бактериофагам различных видов и в различные временные периоды у детей первого года жизни с ФГИР не выявлено (р 0,05).
Полученные данные о чувствительности к бактериофагам представителей микробиоты толстой кишки у детей с ФГИР свидетельствуют о высоком уровне фагоустойчивости бактерий рода Klebsiella, что может являться одной из причин неэффективного использования препаратов бактериофагов. Проанализировав действие бактериофагов на бактерии рода Klebsiella, установлено, что штаммы K. pneumoniae имеют большую степень чувствительность (в два раза) к действию бактериофагов клебсиелл пневмоний и секста во втором возрастном периоде развития (от трех до шести месяцев) у детей с ФГИР по сравнению со штаммами K. oxytoca аналогичного периода.
Таким образом, данные изменения свидетельствуют о перестройке функционирования микробиоты толстой кишки у детей с ФГИР. При этом отмечается высокий уровень резистентности бактерий K. oxytoca, что может поддерживать высокую степень агрессивности данного бактериального агента в кишечной микробиоте детей первого года жизни и манифестацию клинической картины.