Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Механизмы функционирования редокс-чувствительной системы антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE и ее роль в поддержании окислительно-восстановительного равновесия in vivo 11
1.1.1. Гены с ARE-контролируемой экспрессией 11
1.1.2. Индукторы системы Keap1/Nrf2/ARE 13
1.1.3. Структура компонентов системы Keap1/Nrf2/ARE 16
1.1.3.1. Структура ARE 16
1.1.3.2. Структура Nrf2 18
1.1.3.3. Структура Keap1 18
1.1.4. Механизмы активации системы Keap1/Nrf2/ARE 19
1.1.5. Механизмы инактивации системы Keap1/Nrf2/ARE 30
1.2. Активированные кислородные метаболиты и их роль в развитии окислительного стресса и воспаления 32
1.3. Роль системы Keap1/Nrf2/ARE в воспалении 47
1.4. Синтез и исследование антиоксидантных и биологических свойств новых водорастворимых серосодержащих фенольных соединений 54
2. Материал и методы 57
3. Результаты и обсуждение 66
3.1. Изучение влияния исследуемых фенольных антиоксидантов на жизнеспособность клеток в культуре 67
3.2. Изучение способности исследуемых фенольных антиоксидантов индуцировать ARE-зависимые ферменты в культуре клеток 73
3.3. Изучение влияния исследуемых фенольных антиоксидантов на способность модулировать развитие острого локального воспаления in vivo (модель 1) 78
3.4. Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента 81
3.4.1. Изучение влияния фенольного антиоксиданта ТС-13 на содержание глутатиона и активность глутатионредуктазы 81
3.4.2. Изучение влияния фенольного антиоксиданта ТС-13 на активацию транскрипционного фактора Nrf2 82
3.5. Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие острого системного асептического воспаления in vivo (модель 2) 89
3.6. Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие острого системного септического воспаления in vivo (модель 3) 92
3.7. Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие хронического воспаления 94
3.7.1. Обострение хронического воспаления (модель 4) 94
3.7.2. Неспецифическое аутоиммунное воспаление суставов (полиартрит; модель 5) 96
Заключение 102
Выводы 109
Список цитируемой литературы 111
- Механизмы функционирования редокс-чувствительной системы антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE и ее роль в поддержании окислительно-восстановительного равновесия in vivo
- Синтез и исследование антиоксидантных и биологических свойств новых водорастворимых серосодержащих фенольных соединений
- Изучение влияния исследуемых фенольных антиоксидантов на способность модулировать развитие острого локального воспаления in vivo (модель 1)
- Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие хронического воспаления
Введение к работе
Актуальность темы. Одним из неотъемлемых признаков воспалительной реакции является активация фагоцитирующих клеток, микробицидную функцию которых обусловливают генерируемые ими активированные кислородные метаболиты (АКМ), сдвигающие окислительно-восстановительное равновесие клеток в сторону прооксидантов, что приводит к развитию окислительного стресса и может способствовать повреждению окружающих тканей. Наряду с этим большинство исследователей считает АКМ важными регуляторами клеточных процессов и ключевым элементом изменения программ дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток [Brne B. et al., 2013], в том числе посредством изменения активности редокс-чувствительных транскрипционных факторов [Ляхович В.В. и др., 2006].
Особое место среди редокс-чувствительных систем клетки занимает сигнальный путь Keap1/Nrf2, активирующий экспрессию генов за счет взаимодействия транскрипционного фактора Nrf2 с цис-регуляторным антиоксидант-респонсивным элементом (ARE). Главным назначением регуляторной системы Keap1/Nrf2/ARE является поддержание внутреннего гомеостаза при апоптоз-индуцирующих, проканцерогенных и стрессовых воздействиях [Ляхович В.В. и др., 2006; Турпаев К.Т., 2013]. Исследования, проведенные на нокаутных по Nrf2 животных, выявляют важность ARE в процессах воспаления, канцерогенеза, фиброза, а также защиты от различных стрессовых воздействий [Меньщикова Е.Б и др., 2010]. Так, у мышей с выключенным геном Nrf2 более выражен воспалительный ответ на различные стимулы [Ma Q. et al., 2006], кроме того, Nrf2 способствует разрешению острых воспалительных процессов, препятствуя их хронизации [Reddy N.M. et al., 2009]. Биологическая важность ARE определяется тем, что от его активности зависит функционирование многих других редокс-чувствительных элементов, в том числе транскрипционных факторов NF-B и АР-1, регулирующих развитие воспалительного процесса [Hayes J.D. et al., 2010; Wakabayashi N. et al., 2010], поэтому сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE считается перспективной мишенью при разработке новых противовоспалительных препаратов [Hybertson B.M. et al., 2011].
В научной литературе описан широкий спектр различных индукторов транскрипции генов, регулируемых ARE [Xiao H.Parkin K.L., 2006; Garbin U. et al., 2009]: прежде всего это фенолы и хиноны, акцепторы Михаэля, серо- и селенсодержащие соединения. Большое внимание при исследовании новых стимуляторов ARE уделяется зависимости индуцирующей способности от структуры соединений: для фенолов существенно расположение ОН-групп [Prestera T. et al., 1993; Magesh S. et al., 2012] и степень их экранирования орто-заместителями [Takabe W. et al., 2006], для серо- и селен-содержащих соединений показана высокая активность диатомарной структуры –S-S- или -Se-Se- [Xiao H. et al., 2006]. Кроме того, важен вопрос биодоступности антиоксидантов, многие из которых липофильны. В отличие от гидрофильных веществ, жирорастворимые соединения при прохождении через желудочно-кишечный тракт взаимодействуют с желчными кислотами и их солями, кроме того, их всасывание в кишечнике происходит путём пассивного транспорта и зависит от наличия жиров в диете, что усложняет подбор дозировки и интервалов приёма. Для жирорастворимых соединений даже с доказанной высокой антиоксидантной активностью ведутся поиски водорастворимых аналогов или форм с целью повышения биодоступности [Yu H., 2011; Neves A.R. et al., 2013; Xiao Y. et al., 2013].
Ранее в системах in vitro была всесторонне изучена антирадикальная и антиоксидантная активность серосодержащих водорастворимых фенольных соединений, синтезированных в НИИ химии антиоксидантов ФГБОУ ВПО "Новосибирский государственный педагогический университет" и представляющих собой экранированные трет-бутильными группами монофенолы с пара-пропильным заместителем сульфонатным или тиосульфонатным заместителем [Просенко А.Е. и др., 2001]. Антиоксидантный эффект соединений прямо зависел от степени экранирования ОН-группы и наличия атома двухвалентной серы в пара-пропильном заместителе. При этом если такая структурная зависимость чётко прослеживалась в случае простых бесклеточных и неферментативных систем, то при переходе к более сложным, в том числе клеточным и ферментативным тест-системам, связь структуры и активности соединения становилась менее однозначной, что, в частности, объяснялось их непрямым действием на регуляторную систему Keap1/Nrf2/ARE [Зенков Н.К. и др., 2007].
В соответствии с изложенным выше была сформулирована цель работы – изучить противовоспалительную активность новых синтетических водорастворимых фенольных антиоксидантов и исследовать ее возможную связь со способностью соединений индуцировать редокс-чувствительную сигнальную систему антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи.
1. Изучить влияние структурно подобных фенольных антиоксидантов на жизнеспособность моноцито/макрофагоподобных клеток линии U937 in vitro.
2. Изучить особенности и специфичность активации антиоксидантных ферментов и ферментов второй фазы метаболизма ксенобиотиков, контролируемых антиоксидант-респонсивным элементом, in vitro с помощью 5 синтетических водорастворимых структурно подобных фенольных антиоксидантов с выявлением наиболее эффективного соединения.
3. В условиях целого организма на модели острого локального воспаления путем скрининга 10 синтетических водорастворимых структурно подобных фенольных антиоксидантов выявить соединение с наиболее выраженным противовоспалительным действием.
4. Исследовать способность наиболее активного соединения индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента in vitro, изучив его влияние на внутриклеточное распределение транскрипционного фактора Nrf2 в макрофагоподобных клетках линии J774 и фибробластах линии FLECH.
5. Изучить влияние наиболее активного соединения на развитие и течение воспалительного процесса на моделях острого воспаления (внутривенное введение зимозановых частиц, эндотоксиновый шок).
6. Изучить влияние наиболее активного соединения на развитие воспалительного процесса на моделях хронического воспаления ("воздушный мешок", коллаген-индуцированный артрит).
Научная новизна работы
На клетках линии U937 показано, что все соединения нового ряда структурно зависимых водорастворимых монофенольных серосодержащих антиоксидантов малотоксичны, за исключением селенсодержащего аналога, а 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) в малых концентрациях увеличивает жизнеспособность клеток как в нормальных условиях, так и при индукции окислительного стресса за счёт ингибирования апоптоза.
На клетках линии U937 показана способность новых синтетических монофенольных антиоксидантов активировать контролируемые антиоксидант-респонсивным элементом ферменты NAD(P)H:хиноноксидоредуктазу 1 и глутатион-S-трансферазы, выявлена зависимость индуцирующего эффекта от структуры соединений: для реализации биологической активности исследуемых соединений важно присутствие в структуре пара-алкильного заместителя атома двухвалентной серы и степень экранирования ОН-группы. Наибольшим эффектом обладает ТС-13, для которого на клеточных линиях J774 и FLECH получено прямое доказательство способности активировать редокс-чувстви–тельную сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE, а именно дозозависимая индукция транслокации транскрипционного фактора Nrf2 из цитоплазмы в ядро.
Впервые на модели острого каррагинан-индуцированного локального воспаления у крыс выявлена зависимость между химической структурой водорастворимых монофенольных серосодержащих антиоксидантов и способностью ингибировать развитие отёка лапы, максимальная противовоспалительная активность показана для ТС-13. Установлено, что ТС-13 обладает выраженным протективным действием в отношении острого системного воспаления, способствуя угнетению генерации гранулоцитами крови АКМ. Однако применение ТС-13 при моделировании хронического воспаления (индуцированный гетерологичным коллагеном полиартрит) и его обострения (модель "воздушного мешка") способствовало снижению выраженности клинических признаков воспалительной реакции лишь на ранних стадиях, в то время как на более поздних стадиях его эффект проявлялся лишь в уменьшении активности и снижении праймированности к наработке АКМ нейтрофилов и моноцитов.
Использование ТС-13 как индуктора сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE впервые показало, что ее активация обладает выраженным протективным действием в отношении проявлений острого, но не хронического воспаления.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты исследования существенно дополняют представления о механизмах патогенеза воспалительных процессов данными об участии в них редокс-чувствительной сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE.
Полученные в ходе исследования структурно зависимого ряда водорастворимых монофенольных антиоксидантов данные позволяют рекомендовать 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) в качестве перспективного средства дополнительной терапии состояний, связанных с избыточной активацией фагоцитирующих клеток, благодаря выявленному значимому противовоспалительному действию в отношении острых воспалительных процессов в сочетании с высокой скоростью развития данного эффекта. При этом результаты настоящего исследования свидетельствуют о необходимости дифференцированного подхода к противовоспалительной терапии с учётом фазы, стадии и степени выраженности процесса, в том числе в связи с большей эффективностью индукторов редокс-чувствительной системы Keap1/Nrf2/ARE на ранних этапах развития воспаления.
Положения, выносимые на защиту
1. Синтетические водорастворимые структурно подобные фенольные антиоксиданты способны индуцировать редокс-чувствительную сигнальную систему антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE, выраженность эффекта зависит от химической структуры соединений. Наибольшую активность среди исследованных соединений проявляет частично экранированный 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13).
2. Эффективный индуктор сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента ТС-13 обладает наиболее выраженной противовоспалительной активностью на модели острого локального воспаления по сравнению с другими исследованными структурно подобными соединениями.
3. Противовоспалительное действие эффективного индуктора сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента ТС-13 более выражено в отношении острых, чем хронических иммуноопосредованных воспалительных процессов.
Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на Шестой международной крымской конференция "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии" (Украина, Судак, 2010), VIII международной конференции "Биоантиоксидант" (Россия, Москва, 2010), 17-й Ежегодной конференции общества свободнорадикальной биологии и медицины (SFRBM's 17th AnnualMeeting), (США, Орландо, 2010), 7-й научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2011), Седьмой международной крымской конференция "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии" (Украина, Судак, 2011), Всероссийской научно-практической конференции с элементами научной школы для молодежи "Живые системы и конструкционные материалы в условиях криолитозоны" (Якутск, 2011), Шестой Всероссийской научно-практической конференции "Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов" (Новосибирск, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации материалов диссертационных исследований.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав (включающих обзор литературы, описание материала и методов исследования, изложение собственных результатов и их обсуждение) заключения, выводов и списка 376 источников цитируемой литературы (31 отечественный и 345 зарубежных). Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 7 таблицами, 36 рисунками и 1 схемой.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 09-04-00600) с использованием оборудования ЦКП "Современные оптические системы". Автор глубоко признательна В.О. Ткачёву за неоценимую помощь в работе, сотрудникам НИИ химии антиоксидантов ФГБОУ ВПО НГПУ Н.В. Кандалинцевой, А.Е Просенко за предоставленные оригинальные соединения.
Механизмы функционирования редокс-чувствительной системы антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE и ее роль в поддержании окислительно-восстановительного равновесия in vivo
В конце 80х годов ХХ века при изучении метаболизма действующих через ксенобиотик-респонсивный элемент (xenobiotic respons(iv)e element, XRE) ксенобиотиков-лигандов рецептора ароматических углеводородов (aromatic hydrocarbon receptor, AhR) было выявлено, что некоторые из них способны вызвать индукцию ферментов как первой, так и второй фазы детоксикации ксенобиотиков (бифазные индукторы), тогда как другие вызывали только индукцию ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков независимо от XRE (монофазные индукторы). Последующие исследования воздействия электрофильных соединений на клетки позволили идентифицировать новую регуляторную структуру, которая, в силу того что большая часть индуцирующих её соединений относилась к группе фенольных антиоксидантов, была названа антиоксидант-респонсивным элементом (antioxidant respons(iv)e element, ARE) [Prochaska H.J., Talalay P. 1988; Rushmore T.H. et al., 1991].
Позднее в химическом строении и свойствах индукторов XRE и ARE были выявлены принципиальные различия: если для активаторов AhR характерна планарная структура, то для вторых важны окислительно-восстановительные свойства молекул [Prochaska H.J. et al., 1985]. Особенности действия бифазных индукторов позднее были объяснены их способностью запускать опосредованно через XRE синтез монооксигеназных ферментов и затем метаболизироваться в клетках с образованием электрофильных соединений, активирующих ARE [Prochaska H.J., Talalay P. 1988]. В настоящее время мотивы ARE выявлены в промоторных участках множества генов, а среди транскрипционных факторов типа лейциновых молний, связывающих и активирующих ARE, показана ведущая роль Nrf2 (NF-E2-related factor 2) семейства Cap n Collar (CNC) [Nguyen T. et al., 2003]. Вместе с репрессорным белком Keap1 (Kelch-like ECH associating protein 1) ARE и транскрипционный фактор Nrf2 объединяют в единую редокс-чувствительную сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE.
ARE контролирует в клетках млекопитающих более двухсот генов. По данным, полученным с использованием животных-нокаутов по Nrf2, двойных нокаутов по Nrf2 и Keap1 [Kwak M. et al., 2003; Cho H.Y. et al., 2005] и различных индукторов системы Keap1/Nrf2/ARE [Li J. et al., 2002; Thimulappa R.K. et al., 2002; Hu R. et al., 2004], редокс-чувствительная сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE контролирует от 1 до 10% всех генов. В соответствии с основной выполняемой функцией ферменты, регуляторные и структурные белки, кодируемые ARE-регулируемыми генами, можно разделить на несколько групп: ферменты детоксикации и экспорта из клеток ксенобиотиков и токсичных продуктов метаболизма, а также ферменты репарации/утилизации поврежденных макромолекул; ферменты, контролирующие редокс-состояние клеток: обладающие непосредственной антиоксидантной активностью или синтезирующие восстановители (в первую очередь, глутатион (GSH)); регуляторы апоптоза, клеточного цикла и дифференцировки; шапероны и белки теплового шока; белки межклеточной адгезии, цитоскелета и внутреннего транспорта; регуляторы рибосомального синтеза белка; регуляторы иммунного ответа и воспаления; а также довольно обширная группа ферментов, обеспечивающих обмен веществ в клетках [Ляхович В.В. и др., 2006; Zhang D.D., 2006; Kensler T.W., Wakabayashi N., 2009] (таблица 1.1).
Исследование функций белков, кодируемых Nrf2-индуцируемыми генами, показало, что основной биологической ролью сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE является поддержание внутриклеточного гомеостаза, защита клетки от потенциально опасных химических агентов и физических воздействий, распознавание поврежденных макромолекул и их репарация/утилизация в зависимости от возможности восстановления нормальной структуры, а при значительном объеме повреждений – инициация апоптоза. За счет этого сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE препятствует злокачественному перерождению клеток и тормозит процессы канцерогенеза [Kensler T.W., Wakabayashi N., 2009].
В то же время эффекты активации Nrf2 могут быть обусловлены его способностью ингибировать транскрипцию различных генов. Так индукторы Nrf2 подавляют процесс активации транскрипционного фактора NF-B, тем самым угнетая экспрессию обширной группы провоспалительных генов (например, 90% из 88 индуцируемых генов раннего ответа в стимулированных липополисахаридом моноцитах человека являются NF-B-зависимыми [Carayol N. et al., 2006]), за счет чего активация сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE снижает выраженность острых воспалительных реакций и усиливает процесс их разрешения, препятствуя переходу патологического процесса в хроническую форму [Меньщикова Е.Б. и др., 2010; Kim J. et al., 2010].
Среди природных и синтетических ксенобиотиков и продуктов метаболизма самого организма было обнаружено огромное количество индукторов сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE, которые могут быть разделены на 10 основных категорий [Dinkova-Kostova A.T. et al., 2004; Xiao H., Parking K.L., 2006]: дифенолы, фенилендиамины, хиноны природного (флаваноиды, куркумин, ресвератрол) и синтетического (трет-бутилгидрохинон tBHQ, трет-бутилгидроксианизол, пробукол) происхождения, а также эндогенные (эстрадиол и его метаболиты, дофамин) [Turan B. et al., 2012]; акцепторы Михаэля (кротоновый альдегид, метаболиты фумаровой кислоты); изотиоцианаты (сульфорафан), тиокарбоматы и родственные им серосодержащие соединения [Keum Y.S., 2011]; 1,2-дитиол-3-тионы, оксатиоленоксиды, алк(ен)ил(поли)сульфиды; гидропероксиды; соединения трехвалентного мышьяка; ионы тяжелых металлов (Cd, Co, Cu, Au, Hg, Pb); соседние димеркаптаны; каротиноиды, терпеноиды и родственные им соединения [Hur W., Gray N.S., 2011; Dinkova-Kostova A.T. et al., 2004]; селенсодержащие соединения (особенно диселениды и селенолы). Кроме того, способностью активировать транскрипцию ARE-регулируемых генов обладают гемовые комплексы, сероводород, продукты перекисного окисления липидов (гидроперекиси, альдегиды, нитрозированные жирные кислоты), прямое действие на клетки активированных кислородных метаболитов (АКМ) (OH, CO, NO, ONOO-/ONOOH, O3, HOCl), вызывающих развитие окислительного стресса, коротковолнового УФ-света, радиации, ишемии/реперфузии, гипоксии и гипероксии, сдвигового стресса [Slocum S.L., Kensler T.W., 2011] (основные представители этих групп индукторов представлены в таблице 1.2).
Синтез и исследование антиоксидантных и биологических свойств новых водорастворимых серосодержащих фенольных соединений
Среди ингибиторов радикалов в биологических системах важное место фенольные антиоксиданты (соединения вида Ar(ОН)„ , в которых одна или несколько гидроксильных групп соединены с ароматическим ядром (Ar), при этом молекулы могут содержать несколько фрагментов Ar(ОН)й). Фенольные антиоксиданты (ArOH) эффективно взаимодействуют с гидроперекисными радикалами жирных кислот и ненасыщенных липидов в реакции (7) (схема 1.2.1) АгОН + RO - ArO + RООН. По существу в данной реакции не наблюдается исчезновения свободной валентности, а имеет место только замена гидроперекисного радикала R0 2 на феноксильный ArO , однако при этом достигается эффект ингибирования
свободнорадикального окисления, обусловленный большей стабильностью ArO , который практически не участвует в реакциях продолжения цепей окисления [Меньщикова Е.Б. и др., 2012]. В природе существуют тысячи фенольных антиоксидантов (только флавоноидов насчитывается более 5000), тем не менее химии всего мира пытаются превзойти Природу и создают новые фенольные антиоксиданты с заданными свойствами, придавая им те или иные преимущества в зависимости от стоящей перед ними задачи.
В НИИ химии антиоксидантов Новосибирского государственного педагогического университета ведётся интенсивный поиск и скрининг новых синтетических антиоксидантов, обладающих выраженным антирадикальным действием в системах in vitro и in vivo, низкой токсичностью, высокой биодоступностью и эффективностью in vivo в отношении патологических процессов и состояний, в основе этиопатогенеза которых лежит развитие окислительного стресса [Просенко А.Е. и др., 2001; Просенко А.Е., 2010.].
Одним из перспективных направлений такого поиска являются работы в области конструирования гидрофильных фенольных антиоксидантов, поскольку данное свойство существенно повышает биодоступность соединений. В отличие от водорастворимых, жирорастворимые соединения при прохождении через желудочно-кишечный тракт взаимодействуют с желчными кислотами и их солями, кроме того, их всасывание в кишечнике происходит путём пассивного транспорта и зависит от наличия жиров в диете, что усложняет подбор дозировки и интервалов приёма, тогда как гидрофильные вещества усваиваются путём активного транспорта. Был создан ряд структурно сходных водорастворимых монофенолов, отличающихся наличием трет-бутильных орто-заместителей (0, 1, 2) и атома двухвалентной серы в пара-пропильном заместителе (пропилсульфонат, проилтиосульфонат), для сравнения применялись метоксилированные незамещённые сульфонаты и тиосульфонаты, а также известный фенол фенозан-калий - водорастворимый антиоксидант схожей структуры, сконструированный и на протяжении многих лет всесторонне исследованный в Институте биохимической физики им. Н. М. Эмануэля РАН [Перевозкина М.Г. и др., 2005].
При исследовании in vivo острой токсичности данного ряда стурктурно подобных фенольных антиоксидантов на мышах линии (C57B1/6 х CBA) F1 (внутрибрюшинное введение, значение LD50 определяли по методу Беренса и Шлоссера) [Меньщикова Е.Б. и др., 2012] установлено, что они относятся к III классу опасности согласно ГОСТ 12.1.007-76, особенно учитывая 3-6-кратное снижение острой токсичности при пероральном назначении препаратов по сравнению с внутрибрюшинным [Барабой В.А., 1976]. По степени увеличения токсичности тестируемые соединения расположились в следующий ряд: ТС-17 (175) C-17 (275) = фенозан-калий (275) ТС-13 (450) ТС-9 (800) С-9 (1800) (в скобках указаны величины LD50, мг/кг массы тела).
В системах in vitro была всесторонне изучена антирадикальная и антиоксидантная активность водорастворимых фенольных соединений данного структурного ряда (С-10, С-9, С 13, С-17, ТС-9, ТС-13 и ТС-17) [Просенко А.Е. и др., 2001; Зенков Н.К. и др., 2007]. Все препараты, за исключением метоксилированного аналога С-10 (что закономерно) в той или иной степени оказывали антиоксидантный эффект, который прямо зависел от степени экранирования ОН-группы и наличия атома двухвалентной серы в пара-пропильном заместителе. При этом если такая структурная зависимость чётко прослеживалась в случае простых бесклеточных и неферментативных систем (индуцированное ионами железа и меди окисление этилолеата и липопротеинов низкой плотности), то при переходе к более сложным, в том числе клеточным и ферментативным тест-системам (разложение морфолиносиднонимина, генерация АКМ в системе "ксантин - ксантиноксидаза", дыхательный взрыв гранулоцитов крови), связь структуры и активности соединения становилась менее однозначной. Это послужило толчком к выполнению настоящей работы по следующим направлениям.
1. Были синтезированы и исследованы соединения с варьирующими пара-алкильными заместителями, аналоги наиболее перспективного антиоксиданта ТС-13 - с укороченной (ТС-12) и удлинённой на одно метиленовое звено (ТС-14) углеводородной цепью, а также с заменой активной двухвалентной серы атомом селена (CC-13). Предполагалось, что такие изменения повлияют на активность ТС-13, так как его бифункциональное антиоксидантное действие обусловлено наличием "активной" серы: липидный пероксирадикал, канонически восстанавливаясь атомом водорода ОН-группы и превращаясь в липопероксид, с участием этого же соединения восстанавливается до неактивного гидроксилипида и не служит источником чрезвычайно реакционных алкоксильного и гидроксильного радикалов (реакция Фентона). Заменой атома серы на селен предполагалось имитировать активный центр глутатионпероксидазы, так как существует целое направление создания имитаторов данного антиоксидантного фермента путём моделирования его активного центра, в состав которого входит селеноцистеин [Bhabak K., Mugesh G., 2010].
2. Утрата однозначной взаимосвязи между структурой и активностью соединения при переходе от простых тест-систем к более сложным является общебиологической закономерностью и позволяет предположить, что in vivo соединения ведут себя по-другому, не только проявляя непосредственную антирадикальную и антиоксидантную активность, но и оказывая непрямой эффект на регуляторные и сигнальные системы, в этом случае структурная зависимость будет иной.
3. Было выдвинуто предположение, получившее косвенное подтверждение [Зенков Н.К. и др., 2007], что фенольные антиоксиданты данной структуры способны активировать редокс-чувствительную сигнальную систему антиоксидант-респонсивного элемента, так как они обладают структурным сходством с классическими низкомолекулярными индукторами Keap1/Nrf2/ARE фенольной природы. При этом интерес к биологической эффективности такого гипотетического индуктора был сфокусирован на воспалении, так как развитие окислительного стресса, обязательное для любого воспалительного процесса, приводит к изменению окислительно-восстановительного баланса в клетках и активирует редокс-чувствительные внутриклеточные сигнальные пути, особое место среди которых принадлежит системе антиоксидант-респонсивного элемента.
4. Выявление оптимальной структуры фенольного антиоксиданта данного структурного ряда положено в основу углубленного исследования универсальности его противовоспалительного действия.
Изучение влияния исследуемых фенольных антиоксидантов на способность модулировать развитие острого локального воспаления in vivo (модель 1)
Каррагинан-индуцированное локальное воспаление является острым, неиммунным и, кроме того, хорошо изученным и легко воспроизводимым, вследствие чего эта модель широко используется для определения противовоспалительной активности различных веществ [Di Rosa M. et al., 1971a, b; Di Rosa M., 1972; Garcia Leme J. et al., 1973], в том числе рекомендована для доклинических исследований новых нестероидных противовоспалительных препаратов в России [Хабриев Р.У., 2005].
Проведен скрининг синтезированных соединений по их влиянию на выраженность локального воспаления в модели каррагинан-индуцированного отека лап крыс линии Вистар с целью отбора наиболее эффективного флоголитика. Обнаружено, что большинство тестируемых соединений проявляют достоверно значимый противовоспалительный эффект, однако укорачивание пара-алкильного заместителя на одно метиленовое звено (ТС-12), инактивация ОН-группы (С-10), также как и замена активного атома серы на селен (СС-13) приводит к потере способности соединения ингибировать развитие отёка лапы. Наиболее выраженным противовоспалительным эффектом, не уступающим эффекту аспирина, обладает частично экранированный тиосульфонат ТС-13, однако удаление на одно метиленовое звено от бензольного ядра атома "активной" двухвалентной серы в составе тиосульфонатного фрагмента у соединения ТС-14 обеспечивало ему эффективность, близкую к эффективности ТС-13 (рисунок 3.17).
При варьировании дозы ТС-13 с целью установить ту, в которой он подавляет выраженность отека на 50 % (ED50), было обнаружено, что данный фенол проявляет достоверно значимую дозовую зависимость, ED50 составила 26 мг/кг массы тела (г = -0,655, р 0,00001) (рисунок 3.18). При этом введение препарата даже в такой высокой концентрации, как 1600 мг на 1 кг массы тела, не сопровождается полным угнетением развития каррагинан-индуцированного отека лапы у крыс.
Формирование отека при остром воспалительном ответе, который характеризуется повышением сосудистой проницаемости и клеточной инфильтрации, происходит в результате транссудации жидкости и белков и скопления лейкоцитов в очаге воспаления. На повышение проницаемости сосудов влияют такие медиаторы воспаления, как гистамин, серотонин, брадикинин и простагландины. Другим важным медиатором острого воспаления является NO , продуцируемый множеством различных клеток, включая лейкоциты, эндотелиоциты и чувствительные нервные клетки [Handy R.L., Moore Р.К., 1998]. Стационарная концентрация NO в очаге воспаления возрастает за счет активации индуцибельной NOS, экспрессию генов которой контролирует транскрипционный фактор NF-B. В ходе клеточной инфильтрации, следующей за повышением проницаемости сосудов, в очаг воспаления проникает множество нейтрофилов, продуцирующих супероксидный анион и гидроксильные радикалы [Fantone J.C., Ward P.A., 1982]. Циклооксигеназы, также находящиеся под контролем NF-B, катализируют образование PGH2 (простагландина, прекурсора синтеза простагландинов, простациклинов и тромбоксанов) [Smith W.L. et al., 1991] из арахидоновой кислоты (многие нестероидные противовоспалительные препараты являются именно ингибиторами COX [Herschman H.R., 1996; Vane J.R., Botting R.M., 1995]). При каррагинан-индуцированном отеке лапы уровень COX-2 возрастает (достигает максимального уровня экспрессии через час после инъекции) с сопутствующим увеличением количества простагландинов, в частности – простагландина Е2 [Nantel F. et al., 1999]. Рисунок 3.18. Зависимость от концентрации ингибирующего действия ТС-13 на выраженность воспалительной реакции (диаграмма рассеяния). Белые квадраты – отдельные значения, чёрные – средние, разбросы – ошибки средних, сплошная линия – экспоненциальная аппроксимация (уравнение приведено на рисунке), пунктирная линия – 95% доверительный интервал.
Вследствие многокомпонентности воспаления и множественности процессов, протекающих в ходе его развития, очевидно, что тестируемый препарат ингибирует лишь часть задействованных реакций, многие из которых находятся под контролем фактора NF-B, провоспалительные эффекты которого способна подавлять система Keap1/Nrf2/ARE. Так, например, показано, что проявляемая трет-бутилгидрохиноном антивоспалительная активность связана с его способностью активировать Nrf2, который, посредством взаимодействия с энхансером гена TNF-a, конкурирует за связывание с этим участком ДНК провоспалительного фактора транскрипции NF-KB, тем самым подавляя синтез цитокина [Ma Q., Kinneer К., 2002]. Эти данные, а также тот факт, что ранее была показана способность исследуемых соединений индуцировать активность ARE-зависимых ферментов [Зенков Н.К. и др., 2007], позволяет предположить, что в основе противовоспалительного действия синтезированных фенольных антиоксидантов лежит их способность индуцировать систему Keap1/Nrf2/ARE. На основании полученных данных для дальнейшей работы был выбран частично экранированный тиосульфонат ТС-13, обладающий максимально выраженными биологическими эффектами при умеренно выраженной токсичности.
Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента 3.4.1. Изучение влияния фенольного антиоксиданта ТС-13 на содержание глутатиона и активность глутатионредуктазы Основополагающим моментом, служащим в качестве триггера для индукции системы Keap1/Nrf2/ARE, является изменение редокс-баланса биологической системы в сторону преобладания прооксидантов, в том числе развитие окислительного стресса. Наиболее адекватным показателем окислительно-восстановительного равновесия служит соотношение восстановленных и окисленных SH-групп в белках, непосредственно зависящее от специализированной системы трипептида глутатиона, к которой можно отнести сам глутатион в окисленной (GSSG) и восстановленной (GSH) форме, использующие последний в качестве кофактора ферменты (глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы) и глутатионредуктазу (GR), восстанавливающую дисульфидную связь окисленного глутатиона до его сульфгидрильной формы.
Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие хронического воспаления
Роль редокс-чувствительной сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE при хроническом воспалении была рассмотрена на примере развития воспалительной реакции в различных моделях артрита.
Для моделирования обострения хронического воспаления суставов широко используется модель "воздушного мешка" ("air pouch"). В 1980–1990-х гг. морфологическими исследованиями было показано, что при разрушении тканей в результате подкожного введения воздуха и последующей миграции и пролиферации макрофагов и фибробластов через 6–7 дней формируется синовиально-подобная оболочка, достаточно точно имитирующая синовиальную выстилку суставов [Edwards J.C. et al., 1981], а инъекция в эту модель суставной полости инфламмогена сопровождается развитием острого воспаления [Martin S.W. et al., 1994], характеризующегося экссудацией лейкоцитов (в первые сутки – преимущественно гранулоцитов).
В качестве модели обострения хронического воспаления сустава была выбрана модель воздушного мешка, индуцируемая введением в сформированную воздушную полость у крыс линии Вистар каррагинана, используемая для исследования ревматоидных заболеваний в связи с наибольшей приближенностью выстилки образующейся полости к синовиальной ткани [Sedgwick A.D. et al., 1985]. Детальное исследование формирующихся воздушных мешков в течение 6 дней после начала введения воздуха свидетельствует о наличии поверхностной популяции клеток соединительной ткани, демонстрирующей ультраструктурные и гистохимические черты, характерные для смешанных популяций, наблюдаемых в синовиальных выстилках: при разрушении тканей в результате подкожного введения воздуха и последующей миграции и пролиферации макрофагов и фибробластов через 6–7 дней формируется синовиально-подобная оболочка, достаточно точно имитирующая синовиальную выстилку суставов [Edwards, J.C. et al., 1981], а инъекция в эту модель суставной полости инфламмогена сопровождается развитием острого воспаления [Martin S.W et al., 1994], характеризующегося экссудацией лейкоцитов (в первые сутки – преимущественно гранулоцитов). Кроме того, данная модель позволяет оценить параметры, преимущественно определяемые состоянием эндотелиального барьера в очаге воспаления и параметры, характеризующие активность собственно клеток воспалительного экссудата.
При исследовании воспалительного экссудата, собранного из полости «воздушного мешка» (его объема, состава и функциональной активности клеток) было показано, что индукция системы Keap1/Nrf2/ARE фенольным антиоксидантом ТС-13 не влияет на объем воспалительной жидкости, содержание в ней белка и клеточных элементов (рисунок 3.28). В то же время способность клеток воспалительного экссудата к генерации АКМ, как спонтанной, так и при развитии дыхательного взрыва под действием корпускулярных (зимозан) и растворимых (РМА) стимуляторов была статистически значимо ниже у животных, получавших накануне и после введения инфламмогена раствор ТС-13, чем у контрольных (рисунок 3.29).
Влияние ТС-13 на интенсивность спонтанной генерации АКМ (1, левые оси ординат) и дыхательного взрыва (2, правые оси ординат) клеток экссудата, определяемой с помощью хемилюминесценции (а) и проточной цитофлуорометрии (б), при моделировании воспаления в "воздушном мешке". Светлые прямоугольники - контроль, темные - ТС-13; р 0,05 по сравнению с контролем.
Таким образом, проявления воспалительной реакции, зависящие от состояния эндотелиального барьера, оказались парадоксальным образом неизмененными, тогда как функциональная активность лейкоцитов, мигрировавших в очаг воспаления, была закономерно снижена. Полученные данные позволяют считать гранулоциты крови и, возможно, праймирующие их макрофаги основной мишенью противовоспалительного действия фенольных антиоксидантов, активирующих ARE. Результаты работы согласуются с приводимыми выше литературными данными, свидетельствующими об угнетении активности ключевого провоспалительного транскрипционного фактора NF-кB пропорционально степени индукции Keap1/Nrf2/ARE в мононуклеарных клетках крови человека. Кроме того, показано, что хронический гранулематоз - наследственное заболевание, обусловленное дефектом NADPH-оксидазы и ее неспособностью синтезировать супероксид-анион (в том числе при развитии дыхательного взрыва фагоцитами) - сопряжен с угнетением функционирования сигнальной системы Keapl/Nrf2/ARE и с повышением активности провоспалительного транскрипционного фактора NF-кВ [Rieber N. et al., 2012].
С целью оценки способности системы Keapl/Nrf2/ARE влиять на выраженность неспецифического воспаления суставов лап самцов крыс Вистар и генерацию АКМ клетками-эффекторами воспаления была использована модель ревматоидного артрита. Индуктор системы ТС-13 вводили крысам опытной группы в день иммунизации, в последующем - через день. Крысы контрольной группы получали дистиллированную воду. Визуальные стадии воспаления, выделенные в настоящем исследовании и оценённые по 5-балльной системе, отражены на рисунке 3.30.
В динамике проведения эксперимента установлено, что ревматоидный артрит развился у 100 % животных. В соответствии с данными литературы, степень тяжести процесса коррелировала с уменьшением прироста массы тела крыс, поскольку развитие данного поражения сопряжено с многократным усилением синтеза и секреции TNF-. Наиболее явной эта взаимосвязь становилась к концу эксперимента, когда на 25 сутки после иммунизации коэффициенты корреляции между приростом массы тела с одной стороны и увеличением объема правой лапы и стадией воспаления – с другой составляли соответственно –0,89 и –0,67 (p 0,05). Кроме того, обнаружена тесная взаимосвязь между выраженностью приростом размеров обеих конечностей и стадией воспаления: r = 0,80 (p 0,05).
Наиболее явные различия между крысами опытной и контрольной групп проявились на начальных стадиях патологического процесса, когда на 15 и 18 сутки после иммунизации показатель средней визуальной стадии воспаления на пораженную конечность был достоверно ниже (p 0,05) в опытной группе, чем в контрольной (рисунок 3.31).
Динамика изменения визуальных признаков воспаления в ходе развития ревматоидного артрита у крыс, получавших раствор ТС-13 () и воду (О).
Достоверных различий между группами по приросту массы тела и объема пораженных лап в динамике наблюдений не выявлено в силу больших разбросов показателей (таблица 3.3), хотя величины медиан толщины конечностей у животных, получавших ТС-13, на 25 сутки наблюдений были многократно меньше, чем в контроле. После забоя животных на 32-33-и сутки развития артрита был проведен анализ влияния активации системы Keap1/Nrf2/ARE на количество лейкоцитов крови, их процентный состав и способность генерировать АКМ ( на 32-е сутки развития ревматоидного артрита, индуцированного коллагеном ii, крысы в опыте и контроле не различались по содержанию лейкоцитов и гранулоцитов крови. не выявлено достоверных различий и по определяемой хемилюминесцентными методами способности лейкоцитов крови генерировать акм – как спонтанно, так и при развитии зимозан-стимулированного дыхательного взрыва. в то же время обнаружено, что интенсивность зимозан-стимулированного хемилюминесцентного ответа гранулоцитов крови значимо коррелирует как с увеличением объемов обеих задних конечностей, так и со стадией воспаления (r = 0,64, r = 0,49 и r = 0,58 соответственно), что подтверждает праймированность клеток в ходе развития артрита. при более детальном рассмотрении отдельных компонентов акм-синтезирующей функции фагоцитов с помощью флуоресцентных методов можно видеть, что праймированность моноцитов к наработке перекиси водорода (dcf-зависимая интенсивность флуоресценции моноцитов при стимуляции pma) у животных, получавших тс-13, достоверно ниже, чем в контроле, а активация и праймированность нейтрофилов имеет тенденцию к уменьшению (p = 0,062).
